一种重组蛋白G3P20-31及其制备方法和应用
阅读：544发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种重组蛋白G3P20-31及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种重组蛋白G3P20-31及其制备方法和应用，属于 生物 工程 中的DNA重组技术领域。本发明利用 噬菌体 展示技术将编码P53蛋白N端20-31肽段的基因 片段 克隆到丝状噬菌体载体PIII蛋白基因中，制备出一种展示P53蛋白表位的重组蛋白，并将该重组蛋白展示在噬菌体表面，进而用于 肿瘤 患者血清p53 抗体 检测。本发明还公开了重组蛋白G3P20-31在制备检测肿瘤患者血清p53抗体的生物制品中的应用，该生物制品具有特异性强、灵敏度高、制备简单、成本低廉等优点。，下面是一种重组蛋白G3P20-31及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种重组蛋白G3P20-31，其特征在于，将P53蛋白N段20-31位氨基酸SDLWKLLPENNV展示在丝状噬菌体次要外壳蛋白PIII上；所述重组蛋白G3P20-31的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白G3P20-31，其特征在于，编码所述重组蛋白G3P20-31的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的一种重组蛋白G3P20-31的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)对载体fADL-le进行Bgl I酶切，并回收酶切后的载体fADL-le；
(2)合成噬菌体展示表位SDLWKLLPENNV：
合成编码P53蛋白N端第20-31位氨基酸SDLWKLLPENNV的两个互补DNA片段；
5’-CGGCCATGGCATCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTGGCCCGGG-3’；SEQ ID NO.3；
5’-GGGCCAACGTTGTTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGTCTGATGCCATGGCCGGCT-3’；SEQ ID NO.4；
将两种片段溶解后等摩尔混合，94℃变性5min后58℃复性4min，使两条片段互补结合成双链，合成目的片段；
(3)将步骤(1)获得的酶切后的载体fADL-le与步骤(2)合成的目的片段连接，16℃反应过夜，获得重组质粒；
(4)将重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，进行PCR鉴定；
(5)利用鉴定正确的阳性克隆制备展示重组蛋白G3P20-31的噬菌体。
4.根据权利要求1-3所述的重组蛋白G3P20-31在制备检测肿瘤患者血清p53抗体的生物制品中的应用。
一种重组蛋白G3P20-31及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 癌症是威胁人类健康的主要杀手，在我国每年癌症发病人数约260万，死亡约180万。导致这一现象的原因很多，其中一个重要的原因是目前人类还不能对肿瘤的发生发展过程进行有效的诊断，尤其是早期诊断。
[0003] p53是一种抑癌基因，其蛋白对维持正常的细胞分裂与生长起重要的调节作用；但是一旦该基因发生突变，其编码的突变蛋白半衰期延长，失去抑癌作用，积累于细胞内并刺激免疫系统产生P53抗体。研究表明，血清P53抗体可以作为一种广谱性的肿瘤标志物用于肿瘤早期检测和肿瘤高危人群的筛查。
[0004] 目前，血清p53抗体的检测主要以重组p53蛋白为基础开展，而蛋白的制备及纯化具有操作繁琐、费时、价格相对昂贵且灵敏度低等缺点。因此，提供一种重组蛋白G3P20-31及其制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种重组蛋白G3P20-31及其制备方法和应用，制备方法简单、成本低、灵敏度高，重组蛋白G3P20-31能够用于肿瘤患者血清p53抗体的检测。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 肿瘤患者体内血清P53抗体识别的表位主要位于P53蛋白的N段，其中N段 20-31氨基酸是该抗体识别的一个关键表位。
[0008] 一种重组蛋白G3P20-31，由P53蛋白表位(SDLWKLLPENNV)与丝状噬菌体次要外壳蛋白g3p组成，具体为将P53蛋白N段20-31位氨基酸 SDLWKLLPENNV展示在丝状噬菌体次要外壳蛋白PIII上；所述重组蛋白 G3P20-31的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。黑色加粗部分为P53蛋白表位 (SDLWKLLPENNV)。
[0009] MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMASDLWKLLPENNVGPGGLSLEAETV ESCLAKPHTENSFTNVWKDDKTLDRYANYEGCLWNATGVVVCTGDETQ CYGTWVPIGLAIPENEGGGSEGGGSEGGGSEGGGTKPPEYGDTPIPGYTYI NPLDGTYPPGTEQNPANPNPSLEESQPLNTFMFQNNRFRNRQGALTVYTGT VTQGTDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNGKFRDCAFHSGFNEDPFVCEY QGQSSDLPQPPVNAGGGSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS GSGDFDYEKMANANKGAMTENADENALQSDAKGKLDSVATDYGAAIDG FIGDVSGLANGNGATGDFAGSNSQMAQVGDGDNSPLMNNFRQYLPSLPQ SVECRPYVFGAGKPYEFSIDCDKINLFRGVFAFLLYVATFMYVFSTFANILR NKES；SEQ ID NO.1。
[0010] 进一步，编码所述重组蛋白G3P20-31的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 黑色加粗部分(核苷酸序列：67-102)是编码P53蛋白表位 (SDLWKLLPENNV)的核苷酸序列；黑色加粗之前核苷酸序列(核苷酸序列：1-66)为编码PIII蛋白的信号肽；黑色加粗加下划线部分(核苷酸序列 103-126)为Linker，连接目标肽多噬菌体的PIII蛋白，其目的是使展示的外源肽更好的发挥其功能；黑色加粗加下划线部分之后的核苷酸序列(127-1344) 为PIII蛋白的基因。
[0012] ATGAAATACCTATTGCCTACGGCGGCCGCTGGATTGTTATTACTCG CGGCCCAGCCGGCCATGGCATCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAA AACAACGTTGGCCCGGGAGGCCTGTCTCTAGAAGCCGAAACTGTTG AAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTG GAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGTCT GTGGAATGCTACAGGCGTTGTGGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGT TACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTG GTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCG GTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTA TATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCC GCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCAT GTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGTGCATTAACTGTTTAT ACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGT ACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAA ATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTT GTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGC TGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGCGG CTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGCGGTTC CGGTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAAATGGCAAA CGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACA GTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCT GCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATG GTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGG TGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTT CTTTGCCTCAGTCGGTTGAATGTCGCCCTTATGTCTTTGGCGCTGGTAA ACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGT GTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCGAC GTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCT；SEQ ID NO.2。
[0013] 进一步，一种重组蛋白G3P20-31的制备方法，具体步骤如下：
[0014] (1)对载体fADL-le进行Bgl I酶切，并回收酶切后的载体fADL-le；
[0015] (2)合成噬菌体展示表位SDLWKLLPENNV：
[0016] 合成编码P53蛋白N端第20-31位氨基酸MEEPQSDPSVEP的两个互补 DNA片段；
[0017] 5’-CGGCCATGGCATCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAAC GTTGGCCCGGG-3’；SEQ ID NO.3；
[0018] 5’-GGGCCAACGTTGTTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGTCTGATG CCATGGCCGGCT-3’；SEQ ID NO.4；
[0019] 将两种片段溶解后等摩尔混合，94℃变性5min后58℃复性4min，使两条片段互补结合成双链，合成目的片段；
[0020] (3)将步骤(1)获得的酶切后的载体fADL-le与步骤(2)合成的目的片段连接，16℃反应过夜，获得重组质粒；
[0021] (4)将重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，进行 PCR鉴定；
[0022] (5)利用鉴定正确的阳性克隆制备展示重组蛋白G3P20-31的噬菌体。
[0023] 进一步，所述的重组蛋白G3P20-31在制备检测肿瘤患者血清p53抗体的生物制品中的应用。
[0024] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种重组蛋白G3P20-31及其制备方法和应用，利用噬菌体展示技术将编码P53蛋白N 端20-31肽段的基因片段克隆到丝状噬菌体载体PIII蛋白基因中，制备出一种展示P53蛋白表位的重组蛋白，并将该重组蛋白展示在噬菌体表面，进而用于肿瘤患者血清p53抗体检测。本发明还公开了重组蛋白G3P20-31在制备检测肿瘤患者血清p53抗体的生物制品中的应用，该生物制品具有特异性强、灵敏度高、制备简单、成本低廉等优点。附图说明
[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0026] 图1为本发明fADL-le载体Bgl I酶切结果；
[0027] 其中，1，Marker；2-3，fADL-le载体；4，Bgl I酶切后的fADL-le载体；
[0028] 图2为本发明PCR验证重组fADL-le载体阳性克隆；
[0029] 其中，1，Marker；2-6，阳性克隆；
[0030] 图3为本发明重组噬菌体载体部分测序峰图；
[0031] 其中，第884-919为编码目标多肽的核苷酸序列；
[0032] 图4为本发明Westernblot分析重组蛋白G3P20-31；
[0033] 其中，1，3，5为Marker；2，重组蛋白G3P20-31与anti-PIII蛋白的单克隆抗体杂交(阳性对照)；4，6为重组蛋白G3P20-31分别与p53抗体阳性肿瘤患者及健康人血清杂交(阴性对照)；
[0034] 图5为本发明重组蛋白G3P20-31检测乳腺癌患者血清P53抗体的结果。
具体实施方式
[0035] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036] 实施例1重组噬菌体的构建
[0037] (1)噬菌体载体fADL-le的提取
[0038] 利用Axygen的质粒小量提取试剂盒提取质粒商业化的噬菌体载体 fADL-le(购自Antibody Design laboratories，Catalog number：PD020)，具体步骤如下：
[0039] 1)取6ml在LB培养基中过夜培养的菌液JM109(本实验室保存，里面转化有载体fADL-le)，12000×g离心1min，弃尽上清；
[0040] 2)加250μl Buffer S1，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；
[0041] 3)加250μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次，混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
[0042] 4)加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转6-8次，12000×g离心10min；
[0043] 5)吸取步骤4)中离心后的上清，并转移到制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；
[0044] 6)将制备管放回离心管，加500μl BufferW1，12000×g离心1min，弃滤液；
[0045] 7)将制备管放回离心管，加700μl BufferW2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl BufferW2洗涤一次，弃滤液；
[0046] 8)将制备管放回2ml离心管，12000×g离心1min；
[0047] 9)将制备管移入到新的1.5ml离心管中，在制备管的膜中央加50μl Eluent 溶液，室温静置1min，12000×g离心1min。
[0048] (2)酶切fADL-le
[0049] Bgl I酶切载体fADL-le，具体酶切反应体系如下：
[0050]
[0051] (3)酶切载体的回收
[0052] 对载体fADL-le以及酶切后的载体fADL-le进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。fADL-le载体主要以环状和线状的形式存在，酶切后均变为线性(只切掉10bp左右)，电泳速率较线状空载构象快一些，初步证明酶切成功。
[0053] 对琼脂糖凝胶电泳证明酶切完全的载体进行切胶回收，按照DNA凝胶回收试剂盒的说明进行操作，具体如下：
[0054] 1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；
[0055] 2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶完全融化；
[0056] 3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；
[0057] 4)吸取步骤3)中的混合液，转移到DNA制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；
[0058] 5)将制备管放回2ml离心管，加入500μl BufferW1，12000×g离心1min，弃滤液；
[0059] 6)将制备管放回离心管，加700μl BufferW2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl BufferW2洗涤一次，弃滤液；
[0060] 7)将制备管放回2ml离心管，12000×g离心1min；
[0061] 8)将制备管移入到新的1.5ml离心管中，在制备管的膜中央加10μl Eluent 溶液，室温静置1min，12000×g离心1min。
[0062] (4)噬菌体展示表位的合成
[0063] 合成编码P53蛋白N端第20-31位氨基酸MEEPQSDPSVEP的两个互补 DNA片段；
[0064] 5’-CGGCCATGGCATCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAAC GTTGGCCCGGG-3’；SEQ ID NO.3；
[0065] 5’-GGGCCAACGTTGTTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGTCTGATG CCATGGCCGGCT-3’；SEQ ID NO.4；
[0066] 将两种片段溶解后等摩尔混合，94℃变性5min后58℃复性4min，使两条片段互补结合成双链。
[0067] (5)目的片段与fADL-le酶切载体的连接
[0068] 将步骤(4)合成的目的片段与fADL-le酶切后载体连接，16℃反应过夜，连接反应体系如下：
[0069]
[0070] (6)重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞
[0071] 1)在大肠杆菌JM109感受态细胞中加入10μl连接产物，混匀，冰浴30min；
[0072] 2)42℃，热击90s；
[0073] 3)立即放置到冰上，冰浴10min；
[0074] 4)加入800μl LB培养基，37℃，100rpm，45min；
[0075] 5)将转化产物均匀涂在含有卡那霉素的LB固体培养基上，完全吸收后，倒置于37℃培养箱中，过夜培养12h；
[0076] 6)挑取阳性克隆，进行PCR鉴定。
[0077] (7)菌液PCR鉴定
[0078] 挑单克隆，转入5ml含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm，8h，分别吸取1μl菌液作为模板进行菌液PCR鉴定，引物和扩增条件如下：
[0079] 上游引物(PF)：5’-CCGTGCATCTGTCCTCGTTCAA-3’；SEQ ID NO.5；
[0080] 下游引物(PR)：5’-GTTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGTC-3’；SEQ ID NO.6；
[0081] 在载体pIII基因插入位点上游大约700bp处设计上游引物PF，利用插入片段的反义链作为下游引物进行PCR验证。
[0082] PCR反应体系如下：
[0083]
[0084] PCR反应条件为：94℃预变性8min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35 个循环；72℃延伸10min。
[0085] 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR验证结果见图2。阳性克隆经PCR 扩增后会在700bp处出现特异性目的带，阴性克隆经PCR后无特异性条带的出现。图2结果显示，在700bp处出现一条特异性目的条带，初步表明外源肽(SDLWKLLPENNV)的编码片段被成功插入到噬菌体的pIII基因中，重组噬菌体载体构建成功。
[0086] 反应结束后，将筛选到的阳性克隆送到上海生工生物技术服务有限公司进行测序。
[0087] 重组载体测序结果如下，目的片段(黑色加粗划线部分和图3)被成功克隆到噬菌体载体fADL-le的PIII基因中，且与连接的原始序列完全一致，表明重组载体构建成功，可用于下一步重组蛋白G3P20-31的制备。
[0088] TCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAAT TCAAAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCGCAATTTACTAC CCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAG CTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTGCTTGTCAAGATTA CTCTCGACGAAGGTCAGCCAGCGTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTGCA TCTGTCCTCGTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCTCTTATGATTGACCGTC TGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGAC ACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGC TTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTC GCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTAC CCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCT CCGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGG TGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGAC CGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCA ACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGAT AAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTGTCGACTA ACGAGGGCAAATCATGAAATACCTATTGCCTACGGCGGCCGCTGGATT GTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCATCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTGGCCCGGGAGGCCTGTCTCTAGAAGCCG AAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATC；SEQ ID NO.7。
[0089] 实施例2展示重组蛋白G3P20-31的噬菌体的制备
[0090] 1)将200μl测序正确的JM109接种到含有100ml LB液体培养基(100μg/ml Kar+)的试管中，37℃剧烈震荡10h；
[0091] 2)8000rpm，10min，4℃，留上清；
[0092] 4)加入六分之一体积的PEG/NaCl溶液，涡旋，4℃过夜；
[0093] 5)12000rpm离心15min，用1ml TBS溶解噬菌体沉淀；
[0094] 6)将溶液转移至1.5ml EP管中，14000rpm离心1min，小心将上清转移至1.5ml EP管中，每个EP管中加入150μl PEG/NaCl，混匀后4℃过夜；
[0095] 7)14000rpm离心15min，用100μl TBS溶解噬菌体沉淀，4℃冰箱保存。
[0096] 实施例3Western-blot分析展示重组蛋白G3P20-31噬菌体
[0097] 为了验证P53蛋白N端20-31多肽与PIII融合表达并成功展示在噬菌体的表面，将制备的噬菌体分别与anti-PIII的单克隆抗体及P53抗体阳性肿瘤患者血清杂交，具体步骤如下：
[0098] 1)SDS-PAGE后，将分离胶切下，放置于转移缓冲液中；
[0099] 2)将PVDF膜和滤纸按照胶的大小进行裁剪，滤纸浸泡在转移缓存液中， PVDF膜用甲醇浸泡1min后再放置到转移缓存液中；
[0100] 3)80V恒压电转2h；
[0102] 5)将膜放入封闭液中封闭1h；
[0103] 6)PBST洗三次，每次间隔5min；
[0104] 7)加入按照1：1000稀释的商品化的鼠源anti-PIII单克隆抗体(NEB) 或1:100稀释的p53抗体阳性癌症患者血清或1：100稀释健康人血清，37℃， 1h；
[0105] 8)PBST洗三次，每次间隔5min；
[0106] 9)羊抗鼠IgG或羊抗人IgG二抗稀释至工作浓度后，将膜条放入其中， 37℃，45min；
[0107] 10)PBST洗三次，每次间隔5min；
[0108] 11)将ECL发光液稀释到工作浓度后，滴加在PVDF膜上，曝光30s。
[0109] 结果如图4所示，重组蛋白G3P20-31能同时与anti-PIII单克隆抗体及肿瘤患者血清P53抗体发生特异性反应，且目的条带位置相同，而该重组蛋白与健康人血清无任何交叉反应，表明重组蛋白G3P20-31表达成功，且能特异性的识别肿瘤患者血清P53抗体。
[0110] 实施例4G3P20-31噬菌体检测乳腺癌患者血清P53抗体ELISA结果
[0111] (1)G3P20-31-ELISA
[0112] 以展示重组蛋白G3P20-31噬菌体为检测抗原，利用ELISA方法对60例乳腺癌患者及60例健康人(阴性对照)进行血清P53抗体的检测，具体步骤如下：
[0113] 1)以展示重组蛋白G3P20-31噬菌体作为包被抗原(简称 G3P20-31-ELISA)包被96孔酶标板，浓度为30μg/ml，每孔50μl，放置湿盒中4℃过夜；
[0114] 2)第二天，先用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，再用PBS溶液洗涤两次，每次3min；
[0115] 3)每孔加入200μl封闭液封闭，37℃，1h；
[0116] 4)洗涤后加入按照1:200稀释的乳腺癌患者或健康人血清，每孔50μl， 37℃反应1h；
[0117] 5)重复洗涤后加入1:5000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG二抗，每孔50μl，37℃温育45min；
[0118] 6)重复洗涤后加入100μl底物显色液TMB，室温避光反应12min，每孔加入50μl 2M的硫酸终止反应；
[0119] 7)利用酶标仪检测OD450nm处的吸光值。每个样本的检测均为平行复孔，结果取检查结果的平均值。
[0120] (2)P53-ELISA
[0121] 以重组P53蛋白(购自Abcam，Catalog number:ab82201)作为包被抗原检测血清53抗体的方法简称为P53-ELISA。除了酶标板上面包被的抗原为重组P53蛋白且浓度为5μg/μl外，整个实验流程与G3P20-31-ELISA完全相同。
[0122] (3)cut-off值的确立
[0123] 根据之前确立的G3P20-31-ELISA及P53-ELISA检测体系，分别检测60 例健康人血清，采用平均值+2SD的方法分别确立每种检测方法的cut-off值。
[0124] 结果如图5所示，60例乳腺癌患者中，展示重组蛋白G3P20-31的噬菌体检测到13例P53抗体阳性患者血清，检出率为21.67％，与重组P53蛋白检测效率(21.67％)一致，两种检测方法的特异性分别为96.67％ (G3P20-31-ELISA)、95.00％(P53-ELISA)。该结果表明，重组蛋白G3P20-31 在检测乳腺癌患者血清P53抗体方面，具有特异性强、灵敏度高且制备简单等优点，可用于乳腺癌患者血清P53抗体的检测应用研究。
[0125] 噬菌体展示技术能够将基因型与表现型联系起来，使研究者可以在基因水平上实现对蛋白质构象的体外控制，在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。本发明利用噬菌体展示技术得到了一种次要外壳蛋白(PIII)展示p53 蛋白表位(N段20-31位肽段)的重组蛋白G3P2-31，并将其展示在噬菌体的表面。本发明方法具有制备简单、成本低、灵敏度高等优点，能够应用于肿瘤患者血清p53抗体的检测。
[0126] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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