技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，涉及小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的分子检测方法，专用于小菜蛾对钠离子通道阻断类
杀虫剂(Sodium Channel Blocking Insecticides，简称SCBIs，包括茚虫威和氰氟虫腙)靶标抗性的高灵敏度快速检测。技术背景
[0002] 小菜蛾作为世界性十字花科蔬菜和油菜
害虫，全球每年造成的损失和防治
费用高达40～50亿美元。十字花科蔬菜是世界各国食用蔬菜的主要来源，与人们日常生活息息相关；油菜是各国重要的油料作物，事关食用油产量安全。20世纪80年代中后期以来，小菜蛾在我国持续大面积暴发成灾，据统计近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世界第一大蔬菜种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。在长期的杀虫剂选择压
力作用下，小菜蛾已对至少92种
杀虫活性成分产生了不同程度的抗药性，几乎涵盖了所有用于其防治的杀虫剂。我国田间小菜蛾抗药性发展速度极快，并导致蔬菜
农药残留超标严重威胁农产品
质量安全，小菜蛾抗药性治理形势十分严峻。
[0003] 茚虫威是由美国杜邦公司20世纪末开发的第一个商品化的钠离子通道阻断型杀虫剂，已在中国、澳大利亚、美国等多个国家作为优良的候选杀虫剂登记注册。茚虫威在昆虫体内迅速转化为N-去甲
氧碳基
代谢物，它能更有效抑制
电压门控钠通道进而阻断神经冲动传导。经过十多年使用，一些地区种群对茚虫威的抗性逐渐显现，部分使用较多地区的小菜蛾种群对其已产生极高
水平抗性。氰氟虫腙是德国巴斯夫公司和日本农药公司联合开发的一种全新的化合物，其不需要生物激活本身具有杀虫活性，也属于神经元钠离子通道阻断剂。目前，昆虫中报道甜菜夜蛾对氰氟虫腙产生了较强的抗药性。茚虫威和氰氟虫腙同属钠离子通道阻断类杀虫剂，而钠离子通道基因突变是导致抗性产生的最主要原因。
[0004] 至今，国内外尚未建立昆虫对SCBIs类杀虫剂抗性的分子检测方法，基于该靶标基因的分子检测技术均集中在DDT和拟
除虫菊酯类杀虫剂相关的突变位点。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对
现有技术中小菜蛾对钠离子通道阻断类杀虫剂抗性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾SCBIs类杀虫剂抗药性机理的研究，提供小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的分子检测方法。
[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0007] 一种小菜蛾对钠离子通道阻断剂抗性靶标的分子检测方法，所述的钠离子通道阻断剂为茚虫威和氰氟虫腙，利用SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物R对小菜蛾基因组DNA模板进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据测序色谱图鉴定小菜蛾个体钠离子通道编码1845和1848位
氨基酸的核苷酸是否突变及其具体类型，一次性区分出所述钠离子通道阻断剂抗性靶标的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。
[0008] 本发明涉及的小菜蛾野生型钠离子通道基因cDNA序列全长5850bp(GenBank登录号为KM027335)，我们研究发现：敏感型序列ROTH-S第5534位核苷酸由T突变为A(
附图1：SCBIs-R2，GenBank登录号为KM027337)，其编码的
蛋白质由F突变为Y，将导致小菜蛾对钠离子通道阻断剂茚虫威和氰氟虫腙产生抗性；敏感型序列ROTH-S第5542位核苷酸由G突变为A(附图1：SCBIs-R1，GenBank登录号为KM027336)，其编码的蛋白质由V突变为I，将导致小菜蛾对钠离子通道阻断剂茚虫威和氰氟虫腙产生抗性。
[0009] 所述的根据直接测序色谱图准确鉴定小菜蛾个体钠离子通道1845和1848位氨基酸是否突变及其具体类型，一次性区分出两个位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：小菜蛾钠离子通道基因5534位
碱基(即色谱图识别序列5′-CCTCATC-3′前一位)为T单峰、5542位碱基(即色谱图识别序列5′-CCTCATC-3′后一位)为G单峰，则表明该小菜蛾个体为不携带钠离子通道突变的敏感纯合子；5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的杂合子；5534位碱基为A单峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的纯合子；5534位碱基为T单峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸突变的杂合子；5534位碱基为T单峰、5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸突变的纯合子；
5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的杂合子；5534位碱基为A单峰、5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的纯合子。
[0010]
说明书中所述的F1845Y表示第1845位氨基酸发生由F到Y的突变，V1848I表示第1848位氨基酸发生由V到I的突变。
[0011] 所述的分子检测方法，优选包含以下步骤：
[0012] (1)提取单头小菜蛾幼虫或成虫的基因组DNA；
[0013] (2)利用SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增；
[0014] (3)将上一步获得的PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶
电泳，对目的
片段纯化回收后进行直接测序，测序引物为SEQ ID NO.2所示的引物R，通过检测编码1845和1848位氨基酸的核苷酸测序色谱图，一次性区分在这两个位点分别或同时携带所述钠离子通道阻断剂抗性基因的个体。
[0015] 其中PCR反应体系25ul：12.5ul 2xGC Buffer I，1.25U LA Taq DNA聚合酶,1ul单头小菜蛾样本的基因组DNA，1ul 10mM dNTPs，10mM的引物各1ul，加双蒸水至反应总体积为25ul；PCR反应程序：94℃预变性3min，然后循环数为35：94℃变性30s，47℃
退火30s，72℃延伸10min。
[0016] 用于分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的引物对，由SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物R组成。
[0017] 一种用于检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的
试剂盒，包含本发明所述的引物对。
[0018] 本发明所述的引物对在分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性中的应用。
[0019] 本发明所述的试剂盒对在分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性中的应用。
[0020] 有益效果
[0021]
发明人研究发现小菜蛾钠离子通道第4结构域第6跨膜片段的F1845Y和V1848I突变与茚虫威和氰氟虫腙抗性相关，且在我国多个田间种群中可以检测到不同
频率的等位基因突变情况。本发明基于上述发现建立了小菜蛾对钠离子通道阻断剂抗性靶标的分子检测方法。
[0022] 本发明与常规的生物测定技术相比，其优点和积极效果表现在：(1)快速准确：生测技术需要采集试虫并繁殖到一定规模才可以进行检测，至少需要2周时间，本发明可直接检测田间小菜蛾个体，从取得样本到获得检测结果在12个小时以内(若送公司测序也仅需2天时间)；生物测定技术要求试虫标准化，取样误差和虫体之间的差异对结果影响很大，造成结果的不
稳定性。本技术由于采取了核苷酸测序策略，在可快速操作的
基础上实现了准确性的最强化。(2)材料要求少：生物测定技术中测定一个标准曲线至少需要200-300头标准试虫，这些试虫的饲养需要花费一定的人力、物力。而本发明对一个种群的检测只需要50头左右，即可判定种群中突变个体的基因型，计算出与抗性有关的等位基因突变频率。(3)灵敏度高：生物测定检测技术是一种相对粗略检测抗性水平的方法，不能检测早期抗性或低频率抗性纯合子或杂合子，本发明基于小菜蛾对SCBIs类杀虫剂抗性相关的点突变，设计特异性引物扩增目的片段，根据测序色谱图可以直接判断个体的基因型。通过一定数量的个体的检测，可以确定某个种群中敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的频率，为抗药性早期预警和害虫综合治理提供了最直接的依据。
附图说明
[0023] 图1小菜蛾钠离子通道基因突变区域的核苷酸和氨基酸序列
[0024] 图示小菜蛾钠离子通道基因Domain4部分序列，其中ROTH-S序列来自小菜蛾敏感品系，该基因cDNA序列第5534位核苷酸为T，编码氨基酸为F、第5542位核苷酸为G，编码氨基酸为V；SCBIs-R1序列来自抗茚虫威和氰氟虫腙的BY12种群，该基因cDNA序列第5542位核苷酸为A，编码氨基酸为I；SCBIs-R2序列来自抗茚虫威和氰氟虫腙的BY12种群，该基因cDNA序列第5534位核苷酸为A，编码氨基酸为Y。
[0025] 图2小菜蛾钠离子通道基因突变区域的直接测序色谱图
[0026] A:小菜蛾钠离子通道基因5534位碱基(即色谱图识别序列5′-CCTCATC-3′前一位)为T单峰、5542位碱基(即色谱图识别序列5′-CCTCATC-3′后一位)为G单峰，则表明该小菜蛾个体为不携带钠离子通道突变的敏感纯合子；B:5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的杂合子；C:5534位碱基为A单峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的纯合子；D:5534位碱基为T单峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸突变的杂合子；E:5534位碱基为T单峰、5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸突变的纯合子；F:5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的杂合子。
具体实施方式
[0028] 本实施例选取了室内敏感品系ROTH和6个小菜蛾田间种群进行了生物测定，并运用本发明优选的技术检测了各种群携带钠离子通道基因1845和1848位突变的等位基因频率。其中BY12和ZH12种群于2012年11月采集自广东省广州市和珠海市，BY13、ZC13和HZ13分别于2013年12月采集自广东省广州市、增城市和惠州市，SY14种群于2014年1月采集自海南省三亚市，各种群对茚虫威和氰氟虫腙的生物测定数据见表1：
[0029] 表1
[0030]
[0031] 注：ROTH品系为室内饲养多年的敏感材料，其对茚虫威和氰氟虫腙的致死中浓度(LC50值)在本实验中作为对照基线，以此测定其他6个田间种群的抗性水平。
[0032] 根据本发明优选的分子检测技术，其具体实施步骤包括：
[0033] 1.单头小菜蛾幼虫基因组DNA的提取：分别随机挑取上述种群的15-30头四龄幼虫，使用AXYprepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit基因组试剂盒提取全基因组DNA。
[0034] 2.以各地理种群小菜蛾的基因DNA模板进行钠离子通道基因目的片段的PCR扩增。
[0035] (1)设计小菜蛾钠离子通道基因的特异性引物，上游引物F序列为:5'-ATTTGGGATGTCCTTCTTC-3'(SEQ ID NO.1)、下游引物R序列为:5'-TGTACTTGTTGGGCTTGTG-3'(SEQ ID NO.2),引物合成由上海Invitrogen公司完成。
[0036] (2)在0.2mL的PCR管中完成总反应体积为25μL的目的片段扩增：
[0037]
[0038]
[0039] (3)PCR反应程序为：首先94℃预变性3min，进行循环数为35：94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。
[0040] 3.对6个种群各个样本获得的PCR产物纯化后进行直接测序。
[0041] (1)制备1.5％(g/mL)的琼脂糖凝胶，取25μL PCR扩增产物进行电泳，稳流120mA，20分钟后在紫外光下观察。
[0042] (2)对目的片段(约660bp)进行切胶回收，在制备管的滤膜中央加入30ul去离子水溶解DNA，产物送上海Invitrogen公司由引物R(SEQ ID NO.2)完成直接测序。
[0043] (3)分析直接测序色谱图，根据对应于钠离子通道第5534位和5542位碱基峰图的情况判定个体是否携带抗性基因。
[0044] 4.计算小菜蛾种群携带抗性基因(包括1845Y和1848I)的突变频率。
[0045] 小菜蛾田间种群钠离子通道突变抗性基因频率的计算方法如下：
[0046] 1845位抗性等位基因频率(RF1)＝(1845位抗性纯合子个体数×2+1845位抗性杂合子个体数)/(总检测个体数×2)
[0047] 1848位抗性等位基因频率(RF2)＝(1848位抗性纯合子个体数×2+1848位抗性杂合子个体数)/(总检测个体数×2)
[0048] 小菜蛾种群钠离子通道突变抗性基因频率(RF)＝1845位抗性等位基因频率(RF1)+1848位抗性等位基因频率(RF2)
[0049] 根据上述计算方法，测得本例ROTH敏感品系和6个田间种群在1845和1848位的基因型和抗性等位基因突变频率如下：
[0050]
[0051]
[0052] 根据上述生物测定所得的各种群对茚虫威和氰氟虫腙的抗性倍数，与本发明检测到的钠离子通道1845和1848位等位基因突变频率(RF)做相关分析，发现钠通道等位基因突变频率与氰氟虫腙抗性具高度相关性，为极相关(r2＝0.887,df＝4,P＝0.0025)，钠通道等位基因突变频率与茚虫威抗性具中度相关性，为显著相关(r2＝0.545,df＝4,P＝0.047)。
[0053] 通过本实施案例，本发明优选的分子检测技术可以快速测定不同地理种群钠离子通道编码1845和1848位氨基酸的基因型，同时利用介绍的计算方法可以获得种群携带钠离子通道阻断剂抗性等位基因的突变频率。并且，本例数据通过相关性分析验证了小菜蛾钠离子通道F1845Y和V1848I等位基因突变频率与茚虫威和氰氟虫腙抗性显著相关。
[0054] 实施例2
[0055] 本例说明本发明优选的技术方案用于小菜蛾种群钠离子通道基因1845位和1848位基因型的鉴定和突变基因频率的计算。
[0056] 1.2014年11月份在我国广东省深圳市直接随机采集田间小菜蛾成虫30头，基因组DNA的提取采用AXYprepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit基因组试剂盒。
[0057] 2.利用第一步中提取的基因DNA模板进行钠离子通道基因目的片段的PCR扩增：
[0058] (1)设计小菜蛾钠离子通道基因的特异性引物，上游引物F序列为:5'-ATTTGGGATGTCCTTCTTC-3'(SEQ ID NO.1)、下游引物R序列为:5'-TGTACTTGTTGGGCTTGTG-3'(SEQ ID NO.2),引物合成由上海Invitrogen公司完成。
[0059] (2)在0.2mL的PCR管中完成总反应体积为25μL的目的片段扩增：
[0060]
[0061]
[0062] (3)PCR反应程序为：首先94℃预变性3min，进行循环数为35：94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。
[0063] 3.对第二步得到的PCR产物纯化后进行直接测序：
[0064] (1)制备1.5％(g/mL)的琼脂糖凝胶，取25μL PCR扩增产物进行电泳，稳流120mA，20分钟后在紫外光下观察。
[0065] (2)对目的片段(约660bp)进行切胶回收，在制备管的滤膜中央加入30ul去离子水溶解DNA，产物送上海Invitrogen公司由引物R(SEQ ID NO.2)完成直接测序。
[0066] (3)分析直接测序色谱图，根据对应于钠离子通道第5534位和5542位碱基峰图的情况判定个体是否携带抗性基因。一次性区分出两个位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：小菜蛾钠离子通道基因5534位碱基(即色谱图识别序列5′-CCTCATC-3′前一位)为T单峰、5542位碱基(即色谱图识别序列5′-CCTCATC-3′后一位)为G单峰，则表明该小菜蛾个体为不携带钠离子通道突变的敏感纯合子；5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的杂合子；5534位碱基为A单峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的纯合子；5534位碱基为T单峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸突变的杂合子；5534位碱基为T单峰、5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸突变的纯合子；5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的杂合子；5534位碱基为A单峰、5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的纯合子。
[0067] 根据上述检测方法，检测种群的个体基因型信息如下：
[0068] ①：1845和1848位氨基酸均为敏感纯合个体(SS&SS)：包括3、8、21、23和25号样本；
[0069] ②：1845位抗性杂合、1848位敏感纯合个体(RS&SS)：包括1、10、22、24和29号样本；
[0070] ③：1845位抗性纯合、1848位敏感纯合个体(RR&SS)：包括5和13号样本；
[0071] ④：1845位敏感纯合、1848位抗性杂合个体(SS&RS)：包括7、11、12、14、16、17、18、19和28号样本
[0072] ⑤：1845位敏感纯合、1848位抗性纯合个体(SS&RR)：包括2、6、9和26号样本；
[0073] ⑥：1845和1848位氨基酸均为抗性杂合个体(RS&RS)：包括4、15、20、27和30号样本；
[0074] ⑦：1845和1848位氨基酸均为抗性纯合个体(RR&RR)：在本种群中未检测到该类型个体。
[0075] 根据上述计算方法，测得该田间种群在1845和1848位的等位基因突变频率为60％，这预示该地区小菜蛾对SCBIs类杀虫剂抗性已经较高，田间化学防控应注意轮换使用不同作用机制的杀虫剂，延缓抗性进一步发展。
