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代谢物检测设备和对应的检测方法

阅读：507发布：2020-05-11

专利汇可以提供代谢物检测设备和对应的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种基于CMOS的芯片，具有多个感测模态，所述多个模态能够独立地检测存在于样本中的多种代谢物 (例如，胆固醇和葡萄糖 )。具体地，所述芯片提供能够在相同物理测试体积内执行检测的多个感测模态，即，所述芯片可以同时地检测在所述测试体积中发生的多个化学反应，其中每个化学反应产生可独立地检测的结果。所述芯片可以包括光学传感器 (例如，光电二极管 )和化学传感器(例如，pH传感器，体现为ISFET)。通过这种技术，可以使用小型即时装置实时地测量多种代谢物。，下面是代谢物检测设备和对应的检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测生物样本中的代谢物的设备，所述设备包括：
样本接收模块，所述样本接收模块被布置成接收所述生物样本并且将所述生物样本施加到测试材料，所述测试材料的性质受待检测的代谢物的存在的影响，其中所述样本接收模块将所述测试材料支撑在反应区中；以及
基于CMOS的传感器单元，所述基于CMOS的传感器单元具有多个感测模态，所述传感器单元包括衬底，所述衬底具有制造在其上的第一感测元件和第二感测元件，其中所述第一感测元件和所述第二感测元件被布置成同时地检测在所述反应区的共用体积内的所述测试材料的不同性质，以使得能够同时地检测多种代谢物。
2.根据权利要求1所述的设备，其中由所述传感器单元检测到的所述测试材料的所述不同性质独立地受待检测的一种或多种代谢物的影响。
3.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述第一感测元件包括光学传感器。
4.根据权利要求3所述的设备，所述设备包括光学源，所述光学源用于用光学辐射照射所述测试材料。
5.根据权利要求3或4所述的设备，其中所述光学传感器是光电二极管。
6.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述第二感测元件是化学传感器。
7.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述第二感测元件是pH传感器。
8.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述第二感测元件包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)，所述ISFET具有与所述测试材料接触的栅极电极。
9.根据权利要求8所述的设备，所述设备包括参考电极，所述参考电极被布置成向所述测试材料施加电压。
10.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述测试材料是液体溶液，所述液体溶液被布置成在接收到所述生物样本后支持多个代谢物激活的反应。
11.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述液体溶液包括缓冲溶液中的多种酶。
12.根据权利要求11所述的设备，其中所述缓冲溶液包括pH调节剂，所述pH调节剂用于将所述液体溶液的pH维持在所述多种酶保持有效的范围内。
13.根据任一前述权利要求所述的设备，所述设备包括基于CMOS的传感器单元的阵列，其中所述阵列中的每个基于CMOS的传感器单元包括相应的第一感测元件和相应的第二感测元件。
14.根据权利要求12所述的设备，其中所述阵列中的每个基于CMOS的传感器单元可独立地寻址，以从每个相应的第一感测元件和相应的第二感测元件获得信号。
15.根据任一前述权利要求所述的设备，所述设备包括温度调节模块，所述温度调节模块用于控制所述测试材料的温度。
16.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述生物样本是血清。
17.一种检测生物样本中的代谢物的方法，所述方法包括：
在检测设备的反应区中将所述生物样本施加到测试材料，所述测试材料的性质受待检测的代谢物的存在的影响；
使用具有多个感测模态的基于CMOS的传感器单元来同时地测量在所述反应区的共用体积中的所述测试材料的不同性质，所述传感器单元包括衬底，所述衬底具有制造在其上的第一感测元件和第二感测元件；以及
基于来自所述第一感测元件和所述第二感测元件的输出信号而确定多种代谢物的存在。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一感测元件包括光学传感器，其中所述方法包括用光学辐射照射所述反应区，并且其中来自所述第一感测元件的所述输出信号指示所述测试材料对所述光学辐射的吸收。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二感测元件包括pH传感器，其中来自所述第二感测元件的所述输出信号指示所述测试材料的pH。

说明书全文

代谢物检测设备和对应的检测方法

发明领域

[0001] 本发明涉及一种用于即时实时代谢物感测的过程和设备。具体地，本发明涉及一种使得能够同时从单个样本检测多种代谢物的设备和过程。

[0002] 发明背景

[0003] 代谢是重要的细胞过程，并且代谢障碍可能是很多疾病的主要诱因。代谢物(即，代谢所涉及的物质)可以是疾病表型的良好指示，并且可以用作代谢性疾病生物标记。因此，代谢物的定量和分析可以在很多疾病的研究和检测中起到重要作用。

[0004] 单一代谢物可以是若干种不同疾病的生物标记。然而，多种代谢物可以一起用作特定疾病的生物标记。因此，经常需要对多种代谢物的存在进行检测和定量以便准确地识别疾病。

[0005] 例如，血糖升高可以是高血糖症或糖尿病的征兆并且可能引起冠心病。血清胆固醇在人体中履行很多基本职责，诸如用作甾类激素、胆汁酸和维生素D的生物合成的前体。血胆固醇水平升高会增加心血管疾病、特别是冠心病的风险。葡萄糖和胆固醇两者已经被充分地研究并被证明为是冠心病的单独风险因素。已经表明，空腹血糖与总胆固醇存在不利协同相互作用，从而对于高血压患者来说，扩大了与总胆固醇相关联的突发性冠心病事件的风险。因此，血糖和胆固醇可以作为冠心病的生物标记进行研究。

[0006] 用于对代谢物进行检测和定量的常用技术是质谱分析(MS)。这涉及对化学物类电离并且基于它们的质荷比而对产物离子进行分类。在执行质谱分析测量之前，经常需要分离方法，诸如气相色谱法和液相色谱法。核磁共振(NMR)光谱法是用于代谢物研究的另一种技术。NMR可以用于对广泛范围的代谢物进行检测、识别和定量而不必首先将它们分离。然而，这两种技术都需要体积庞大且昂贵的设备，从而将它们的使用限制在医院和实验室。

[0007] 最近，在一次性感测平台中使用光电二极管来测量酶测定的颜色变化已经被证明为检测胆固醇的手段[1]。该平台是根据基于互补金属氧化物半导体(CMOS)的光电二极管阵列以及成品发光二极管(LED)。使用可易用于低成本批量生产的商业标准CMOS工艺来生产该光电二极管阵列。

[0008] 由于硅的带隙(1.12eV)，在CMOS工艺中制造的光电二极管通常对200nm至1100nm范围内的光敏感。这个范围使得它们适于使用可见光或荧光介体的比色酶测定，该介体经常使用400nm至700nm范围内的波长。这个范围的酶测定(例如，胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆固醇酶酯和胆固醇氧化酶)的颜色变化可以用来得到胆固醇水平。

[0009] 在其他近期工作中，使用用集成式离子敏感场效应晶体管(ISFET)阵列制造的另一种类型的基于CMOS的芯片来通过己糖激酶的活性来测量血液中的葡萄糖浓度。己糖激酶对葡萄糖的动作释放氢离子，而氢离子被ISFET检测到[2]。

发明内容

[0010] 总的来说，本发明提供了一种基于CMOS的芯片，所述基于CMOS的芯片具有多个感测模态，所述多个感测模态能够独立地检测存在于样本中的多种代谢物。具体地，本发明涉及在相同物理测试体积中通过多个感测模态进行检测的情形，即，芯片可以同时地检测在测试体积中发生的多个化学反应，其中每个化学反应产生可由芯片上的感测模态中的一个独立地检测的结果。通过这种技术，可以使用小型即时装置实时地测量多种代谢物。

[0011] 根据本发明的一方面，提供了一种用于检测生物样本中的代谢物的设备，该设备包括：样本接收模块，该样本接收模块被布置成接收生物样本并且将生物样本施加到测试材料，该测试材料的性质受待检测的代谢物的存在的影响；以及基于CMOS的传感器单元，该基于CMOS的传感器单元具有多个感测模态，该传感器单元包括衬底，该衬底具有制造在其上的第一感测元件和第二感测元件，其中第一感测元件和第二感测元件被布置成同时地检测测试材料的不同性质，以使得能够同时检测多种代谢物。样本接收模块可以将测试材料支撑在反应区中，在反应区中，测试材料可由传感器单元检测。第一感测元件和第二感测元件可以被布置成同时地检测在反应区的共用体积内的测试材料的不同性质。测试材料可以固定或以其他方式紧固或保持在反应区内，以准备接收生物样本。在一个示例中，测试材料可以是液体溶液，液体溶液被布置成在接收到生物样本后支持多个代谢物激活的反应。

[0012] 提供基于芯片的传感器单元的一个优点在于，以使得能够实际实现单个样本的多个性质的规模来提供多个感测模态。通过探究测试材料的不同性质，本发明有效地提供一种复用测量系统，其中可以从相同的装置和测试体积获得对应于不同模态的单独信号。这在以下情况下特别有用：由传感器单元检测到的测试材料的不同性质独立地受待检测的一种或多种代谢物的影响，即，信号之间基本上不存在串扰。

[0013] 在本文中，短语“基于CMOS”可以表示装置能够使用常规半导体芯片工艺来制造，例如，包括在衬底上进行一系列沉积、掩蔽和蚀刻步骤。因此，传感器单元及其组成部件可以是半导体部件。这可以使得能够以低成本批量生产传感器单元。因此，该设备可以体现为可易于运输的紧凑手持式装置，由此促进快速即时诊断。与用于代谢物检测和定量的当前分析方法相比，不需要昂贵的检测设备。

[0014] 传感器单元本身可以类似于半导体芯片，并且可以具有安装在其上或与其连接的用于控制和处理芯片功能的器件。例如，该设备可以包括控制器，例如微处理器等，控制器被布置成发送信号和从传感器单元接收信号。例如，控制器可以被布置成通过施加适当的电压来激活第一感测元件和第二感测元件。

[0015] 测试材料的由传感器单元检测到的性质可以是物理或化学性质。例如，传感器单元可以被布置成检测外观、化学成分、质量、温度等的变化。第一感测元件和第二感测元件中的每一个可以被布置成检测单一性质。

[0016] 在一个示例中，第一感测元件包括光学传感器。光学传感器可以被布置成例如通过捕获图像或确定其光学性质的变化来检测测试材料的外观的变化。该设备可以包括光学源，该光学源用于以光学辐射照射测试材料。在一个示例中，光学传感器可以是光谱吸收传感器，例如单光电二极管(PD)、单光子雪崩二极管(SPAD)、PD阵列或SPAD阵列中的任一个。所使用的光学传感器的类型可以取决于预期的应用。例如，光电二极管和SPAD典型地具有不同的动态范围和敏感性，并且基于这些性质可以将它们选择用于传感器单元。在一个示例中，PD和SPAD两者可以设在相同的装置上。它们可以基于当前测试情形而选择性地操作。

[0017] 第二感测元件检测与第一感测元件不同的性质。例如，第二感测元件可以是化学传感器，化学传感器例如被布置成确定测试材内的成分或化学变化。在一个示例中，第二感测元件是pH传感器，例如包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)，该ISFET具有与测试材料接触的栅极电极。设备可以包括参考电极，参考电极被布置成向测试材料施加电压。

[0018] 上述特征可以组合。因此，在一个特定实施方案中，本发明可以提供一种使得能够同时检测血清样本中的两种代谢物的代谢物检测装置。该装置包括：样本容器，该样本容器用于容纳测试溶液和传感器单元，传感器单元具有pH传感器，该pH传感器被布置成检测测试溶液中的由第一测试溶液中的第一代谢物-酶反应引起的pH变化；以及光谱吸收检测器，该光谱吸收检测器被布置成检测测试溶液中的由测试溶液中的第二代谢物-酶反应引起的吸收变化。pH变化与测试溶液中的第一代谢物的存在相关联，并且因此可以用来确定在第一代谢物-酶反应开始时存在于测试溶液中的第一代谢物的量。类似地，测试溶液的吸收变化可以用来确定在第二代谢物-酶反应开始时存在于测试溶液中的第二代谢物的量。测试溶液的吸收变化可以由源于第二代谢物-酶反应的测试溶液的颜色变化引起。两个代谢物-酶反应可以在测试溶液中同时地发生，从而使得能够同时检测两种代谢物。

[0019] 在以上示例中，生物样本是血清，但本发明可以与能够将代谢物传递到反应区中的任何生物样本一起使用。

[0020] 测试溶液或上述液体溶液可以包括缓冲溶液中的多种酶。缓冲溶液可以包括同时的第一和第二代谢物-酶反应所需的化学物质的混合物。缓冲溶液可以包括用于反应的相关酶，以及pH调节剂，以确保溶液的pH保持在酶有效的范围内。缓冲溶液还可以包括与代谢物-酶反应中的一个的产物反应的化学物质，以便产生测试溶液的吸收变化(例如，颜色变化)。

[0021] 样本容器可以预先装有缓冲溶液。然后将血清样本放置在样本容器中，从而引起血清和缓冲溶液混合并形成测试溶液。如果所测试的代谢物中的一个或两个存在于血清中，那么将发生对应的代谢物-酶反应，从而引起样本容器中的测试溶液的pH和/或吸收变化。

[0022] pH传感器可以是能够将测试溶液中的pH变化转换成电信号的电化学传感器。pH传感器可以对在代谢物-酶反应中产生的氢和/或氢氧离子种类敏感。例如，pH传感器可以是离子敏感场效应晶体管(ISFET)。ISFET是将测试溶液用作栅极电极的场效应晶体管(FET)。测试溶液的pH变化(即，H+的浓度变化)引起行进通过ISFET的电流变化可测量的量。

[0023] 光谱吸收检测器能够响应于对由测试溶液透射的光的吸收变化而产生电信号。光谱吸收检测器可以被布置成以特定频率或在频率范围上监测吸收。代谢物检测装置可以包括光学源(例如，LED)，光学源被布置成使光照射通过测试溶液。然后光电二极管可以包括在传感器单元中，其中光电二极管被布置成从光学源接收已经被测试溶液透射的光。光电二极管可以响应于接收到由测试溶液透射的光而产生电信号，其中电信号的大小取决于透射光的强度。

[0024] 该设备可以包括基于CMOS的传感器单元的阵列，其中阵列中的每个基于CMOS的传感器单元包括相应的第一感测元件和相应的第二感测元件。可以从每个传感器单元测量相应的信号。可选地，可以从传感器单元的阵列测量平均信号。测量平均信号可以大大地降低信号噪声：根据高斯统计，信号噪声作为的函数而降低，其中N是传感器的数量。

[0025] 阵列中的每个基于CMOS的传感器单元可以独立地寻址，以从每个相应的第一感测元件和相应的第二感测元件获得信号。

[0026] 该设备可以包括用于控制或监测反应区的其他部件。例如，该设备可以包括温度调节模块，温度调节模块用于控制测试材料的温度。

[0027] 在另一个方面，本发明可以提供一种检测生物样本中的代谢物的方法，该方法包括：在检测设备的反应区中将生物样本施加到测试材料，测试材料的性质受待检测的代谢物的存在影响；使用具有多个感测模态的基于CMOS的传感器单元来同时地测量在反应区中的测试材料的不同性质，传感器单元包括衬底，该衬底具有制造在其上的第一感测元件和第二感测元件；以及基于来自第一感测元件和第二感测元件的输出信号而确定多种代谢物的存在。

[0028] 传感器单元可以包括上述特征中的任一个。例如，第一感测元件可以包括光学传感器，其中方法包括用光学辐射照射反应区，并且其中来自第一感测元件的输出信号指示测试材料对光学辐射的吸收。第二感测元件可以包括pH传感器，其中来自第二感测元件的输出信号指示测试材料的pH。附图说明

[0029] 下文参考附图详细地描述本发明的实施方案，在附图中：

[0030] 图1是本发明的实施方案的多模态代谢物检测装置的示意性侧视图；

[0031] 图2是可以在图1的检测装置中使用的传感器单元的阵列的示意性平面图；

[0032] 图3是来自图2所示的阵列的单个传感器单元的示意性平面图；

[0033] 图4是穿过图3的传感器单元的示意性截面图；

[0034] 图5是穿过图3的传感器单元的另一个示意性截面图；

[0035] 图6是呈测量配置的根据本发明的多模态代谢物检测装置的示意性透视图；以及[0036] 图7是示出图5的传感器单元中的ISFET和光电二极管的特性的一对曲线图。

[0037] 具体描述；进一步选项和偏好

[0038] 本发明的实施方案提供了一种代谢物检测装置，其中通过制造在单个基于CMOS芯片上的部件来提供多个感测模态。在下文讨论的示例中，所述感测模态包括例如用于感测光学辐射的光学传感器，以及例如用于感测样本中的离子物类的浓度的pH传感器。然而，可以理解，本发明的原理适用于可以制造在芯片上并且能够检测指示代谢物的存在的信息的任何种类的传感器。

[0039] 所述样本可以是以任何常规方式从对象获得的生物样本(例如，流体或组织)。在下文讨论的示例中，所述样本是血清，但应当理解，本发明可以涵盖使用其他(或附加)样本类型。

[0040] 图1是本发明的实施方案的代谢物检测装置100的示意性图示。该代谢物检测装置将pH传感器和光学传感器组合在单个传感器单元内，以便使得能够同时检测来自单个样本的两种代谢物。

[0041] 代谢物检测装置100包括含有传感器单元的阵列的芯片102。每个传感器单元包括pH传感器和光学传感器。芯片102安装在芯片载体104中，该芯片载体本身经由一组引脚108连接到印刷电路板(PCB)106。芯片102利用细小金线而接线结合到芯片载体104上的结合焊盘。芯片载体104上的结合焊盘经由引脚108电连接到PCB 106，使得可以测量来自芯片102的电信号。芯片102利用环氧树脂110固定到芯片载体104。环氧树脂110覆盖芯片102的外边缘，使得细小金线嵌入在环氧树脂110内。环氧树脂还可以用在芯片102的下侧上，以将它固定到芯片载体104。芯片102的中心区域保持暴露，使得它可以与测试溶液接触。这可以例如通过在环氧树脂110沉积和固化时将保护掩模放置在芯片的中心区域上方并且随后移除掩模来实现。

[0042] 圆柱形管112的部段固定到芯片载体104，以在芯片102的表面上方形成样本容器。芯片102形成样本容器的底表面，使得当将测试溶液114放置在样本容器中时，芯片102的暴露的中心区域与测试溶液114接触。代谢物检测装置100还包括设置在样本容器上方的光学源116。光学源被布置成使得光118穿过容纳在样本容器中的测试溶液114照射在芯片102的中心区域上。测试溶液114的光吸收性质的变化可以被芯片102上的光电二极管检测到。光学源116可以例如是LED或者用于发射光学辐射的其他常规源。光学源116可以以特定波长发射光，或者它可以是宽带光学源。

[0043] 代谢物检测装置100还包括加热器和温度传感器(未示出)，以便使用PID控制器来控制芯片102的温度。加热器和温度传感器可以例如安装在芯片载体104的背部上。这使得能够将测试溶液114维持在测试溶液114中所含有的酶保持有效的温度(例如，约37℃)。

[0044] 代谢物检测装置100还包括参考电极120。参考电极120被布置成使得在样本容器容纳测试溶液114时，参考电极120的尖端浸没在测试溶液114中。参考电极120连接到电压源(未示出)并且用来为芯片102上的pH传感器提供液体栅极电压。参考电极120可以是用于电化学测量的常规参考电极，诸如Ag/AgCl电极。光学源116和参考电极两者可以集成在盖帽中，该盖帽被配置成配合在圆柱型管112的上方，以便提供密封的测量环境。

[0045] 在使用中，代谢物检测装置100可以安装在手持式主体内，例如模制的外壳等。该主体可以包括电源和控制器，该控制器用于例如经由安装在主体外部的用户界面来操作装置100。控制器可以包括处理器和存储器，该存储器例如具有存储在其上的指令，所述指令可执行来操作装置100。控制器可以包括用于使得能够将检测过程的结果传递到另一个装置的通信接口。在一个示例中，通信接口可以包括允许主体通信地连接到另一个计算装置(例如膝上型计算机或台式计算机)的USB端口。

[0046] 图6示出了呈测量配置的上述装置的示意性透视图。

[0047] 图2是设置在芯片102的暴露的中心区域中的256个(即，16×16)单独传感器单元的阵列202的示意图。芯片102还包括用于从每个单独传感器单元获得信号的寻址和读出电路。16×16阵列仅被示出为示例，其他大小的阵列是可能的。

[0048] 图3示出了单个传感器单元302的放大图。每个传感器单元302包括光电二极管304和离子敏感场效应晶体管(ISFET)306。光电二极管304结合到有源像素传感器设计中，该有源像素传感器设计结合了光电二极管和三个晶体管以实现数据的读出。该光电二极管可以是基于常规p-n结的光电二极管。如图3所示，芯片上存在空间以便在需要的情况下结合另外的传感器。

[0049] 图4是传感器单元302的示意性截面图。传感器单元的光电二极管304和ISFET 306嵌入在芯片102的衬底402中。光电二极管304的上部光敏表面暴露，使得它可以接收来自光学源116的光。ISFET 306包括源极404、漏极406、栅极氧化物层408和体层410。ISFET 306使得能够检测到存在于溶液114中的H+离子，使得可以测量测试溶液114的pH。H+离子可以吸附到暴露于测试溶液114的氧化物栅极层408上。这将体层410中的电荷载流子吸引到体层410的表面，从而引起ISFET 306的阈值电压变化。参考电极120(图4中未按比例绘制)用来向测试溶液114施加栅极电压。阈值电压的变化可以通过以下方式测量到：利用参考电极施加恒定栅极电压，并且测量在源极404与漏极406之间流动的电流由H+的浓度变化引起的变化。可选地，恒定电流可以在源极404与漏极406之间行进，并且可以测量所施加的栅极电压的变化。

[0050] 图5更详细地示出了图4的截面图。所示的结构可以使用常规0.35μm四金属CMOS工艺来制造。每个像素中的ISFET结构的金属布局使用金属通孔堆叠来使下面的晶体管与顶部金属层M3接触，该顶部金属层位于通过在透明Si3N4 钝化层中形成的窗口而暴露于测试样本(分析物)的介电层内。因此，M3层与芯片上方的分析物形成电容器。与M3接触的电介质充当离子感测材料，该离子感测材料根据能斯脱方程而将分析物中的氢离子浓度转变为ISFET的多晶硅栅极处的电压。暴露于样本的介电材料可以是SiO2或Si3N4 钝化层。可选地或另外地，可以使用另一种电介质，诸如Ta2O5。Ta2O5已经被证明为给出大至58mV/pH的响应。Ta2O5是薄绝缘体并且因此不修改先前已经证明为能够形成图像的单独传感器的串扰性质。

[0051] 中间金属层M2用来使得能够对单元进行寻址。可以存在两个中间层以使得能够对每个传感器单元(像素)独立地寻址。

[0052] 在对实际分析物的实际同时检测测量之前，表征该装置。因此，验证基于CMOS的ISFET的pH敏感性和光电二极管(对颜色变化)的响应性。在这个示例中，ISFET的特征在于三乙醇胺缓冲液(5mM三乙醇胺HCl和50mM NaCl)，该缓冲液具有与实际测量相同的盐浓度和缓冲能力。通过添加1M HCl或1M NaOH来制作具有pH值6、7、8和9的四种不同缓冲液。在每次测量之前，在3％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中温育整个感测阱以最小化非特异性结合。在用去离子水彻底清洗芯片之后，首先将100μl pH 9的缓冲液添加到感测阱以获得基线信号。然后相继地用pH 8、7和6缓冲液替换该缓冲液，从而覆盖实际测量中可能出现的pH范围。图7(a)示出了在这个过程期间的ISFET电压的变化。这个曲线图的小图示出ISFET电压的变化是pH的线性函数，其中斜率为～35mV/pH，这符合SiO2表面的文献值。

[0053] 光电二极管的特征在于过氧化氢(H2O2)，这是在酶反应期间生成的常见产物。测量31μM至375μM的五个不同浓度的H2O2。制备H2O2溶液并且用pH 8的三乙醇胺缓冲液进行稀释。首先将邻联茴香胺(7.89mM)和过氧化物酶(60U/ml)的混合溶液添加到感测阱以得到基线信号。然后添加H2O2溶液以触发反应，并且然后通过光电二极管来记录颜色变化。图7(b)是示出对于每一个H2O2浓度的光电二极管电压响应的曲线图。这个曲线图的小图示出光电二极管电压是H2O2浓度的线性函数(在31μM至375μM的范围内)。

[0054] 因此，ISFET和光电二极管两者被表征且证明为对实际代谢物检测测量足够敏感。

[0055] 使用代谢物检测装置100，可以同时地对血清的样本中的胆固醇和葡萄糖的存在进行检测和定量。这个测量是基于在样本容器中同时地发生的两个单独的代谢物-酶反应：胆固醇-胆固醇氧化酶(下面的方程式(3))，以及葡萄糖-己糖激酶(下面的方程式(1))。胆固醇-胆固醇氧化酶反应产生H2O2，其与邻联茴香胺反应以形成具有橙色的产物。可以使用传感器单元中的光电二极管基于测试溶液对光的吸收来检测这种颜色变化。葡萄糖-己糖+
激酶反应产生H 离子，从而引起测试溶液的pH下降。因此使用ISFET来监测这个反应。通过将血清样本与含有各种代谢物-酶反应的必要化学物质的缓冲溶液混合以便形成测试溶液来执行测量。

[0056] 根据本发明的一个实施方案，在葡萄糖和胆固醇的检测中涉及四个反应：

[0057]

[0058]

[0059]

[0060]

[0061] 方程式(1)描述了葡萄糖-己糖激酶反应。ATP代表5’-三磷酸腺苷，并且ADP代表5’-二磷酸腺苷。在反应期间由产生H+引起的测试溶液的总pH变化可以直接使用ISFET来测量，并且用于确定在反应开始时存在于血清样本中的葡萄糖量。

[0062] 方程式(2)至(4)描述了用于使用光电二极管来检测和定量胆固醇的存在所需的反应。血清中大约30％的胆固醇以其“游离”形式存在(典型地，40mg/dl至85mg/dl)，而剩余的胆固醇被吸收到具有长链脂肪酸的胆固醇酯中。在方程式(2)所描述的反应中，酶(胆固醇酯酶)用来水解胆固醇酯以产生游离胆固醇。这允许通过确保所有的胆固醇都以其“游离”形式存在来测量血清中的胆固醇总量。由方程式(3)描述的第二反应涉及酶(胆固醇酯酶)，其为将分子氧用作离子受体以将氧还原成过氧化氢的氧化还原酶。最初以其“游离”形式存在于血清中的胆固醇和在反应(2)中产生的游离胆固醇两者都参与胆固醇氧化酶反应。由方程式(4)描述的第三反应涉及产生有色产物以便光学测量。第三反应是使用酶(过氧化物酶)进行催化。在存在通过胆固醇氧化酶反应产生的H2O2的情况下，邻联茴香胺被氧化成橙色产物。这引起测试溶液的颜色变化，从而可以通过测量测试溶液的吸收变化来检测到。吸收变化继而可以用来估计存在于血清中的胆固醇总量。选择邻联茴香胺，因为它是非pH依赖型氧化还原指示剂，并且它不受由葡萄糖-己糖激酶反应产生的pH下降影响。

[0063] 可以选择用来检测测试溶液的吸收变化的光电二极管和光学源，以便提供对特定代谢物-酶反应的最佳响应。这可以通过以下方式来完成：将引起颜色变化的代谢物-酶反应的产物的吸收光谱与光电二极管的响应度(即，每入射辐射单位的输出电压)进行比较，以便确定两者之间的重叠区域。然后可以选择光学源，使得它以这个重叠区域中的波长发射光。优选地，选择光电二极管，使得它在代谢物-酶反应的产物的吸收光谱的峰值附近具有其响应度的峰值。对于邻联茴香胺-过氧化物酶反应(方程式(4))，发现含有氧化邻联茴香胺的测试溶液的吸收光谱在460nm附近具有峰值，而发现所使用的光电二极管在600nm附近具有峰值响应度。发现氧化邻联茴香胺的吸收光谱与光电二极管的响应度之间在500nm附近存在强重叠，使得在500nm附近操作的光学源将提供最佳响应。出于这个原因，选择具有502nm的峰值波长的绿色LED。

[0064] 诸如温度、pH和离子强度的测量条件对于酶反应的稳定性和活性很关键。因此，重要的是将维持样本容器中的最佳条件，使得由方程式(1)至(4)描述的各种酶反应可以在样本容器内同时地发生，其中它们之间很少或没有串扰。芯片102的温度可以使用PID控制器设置到37℃，因为这是胆固醇酯的最佳温度。在这种情况下，可以向测试溶液添加硅油，以防止溶液蒸发。

[0065] 测试溶液的pH可以使用pH调节剂(也被称为“缓冲液”)来控制。来自链霉菌孢子的胆固醇氧化酶从pH 5到10是稳定的，并且从pH 6.5到7是最佳的。来自酿酒酵母的己糖激酶pH 7.5到9是最佳的，而来自辣根的过氧化物酶在pH 5到9的范围内是稳定的并且从pH 6到6.5是最佳的。葡萄糖-己糖激酶反应(方程式(1))的pH下降约1的值。本发明人发现，pH调节剂的最佳pH值是8，因为这对所有的反应都呈现最佳的效果。可在pH 7.3到8.3的范围内使用的三乙醇胺盐酸盐被发现是合适的pH调节剂。

[0066] 然而，缓冲溶液的缓冲能力(即，其调节pH的能力，该能力取决于pH调节剂的浓度)可以影响使用ISFET进行的测量结果。如果缓冲能力太高，那么可以筛选出小pH变化，使得ISFET检测不到pH的任何变化。三乙醇胺盐酸盐的5mM浓度被发现足够维持缓冲液的稳定性，而不阻止检测小pH变化。

[0067] 离子强度(即，离子的浓度)不仅在酶反应中起到重要作用，而且影响ISFET的性能。缓冲溶液中的NaCl的50mM浓度被发现适合于这两个目的。

[0068] 用于产生反应(1)至(4)以便同时检测和定量葡萄糖和胆固醇的合适缓冲溶液包括以下酶和化学物质：46.9μl处于pH 8的5mM三乙醇胺HCl；1.7μl的15％w/w牛磺胆酸溶液；1.7μl的15％w/w胆酸溶液；5μl的60U/ml过氧化物酶；10μl的500mM NaCl；1.7μl的8.5U/ml胆固醇酯酶；10μl 100mM的MgCl2溶液、10μl处于pH 8.5的100mM ATP；4μl的邻联茴香胺；1μl的0.1U/μl己糖激酶；以及3μl的10U/ml胆固醇氧化酶。牛磺胆酸溶液和胆酸溶液是用来激活胆固醇酯酶并且由此促进对胆固醇的吸收的胆汁酸。

[0069] 在将缓冲溶液装入样本容器之前，可以通过用牛血清白蛋白(BSA)在三乙醇胺HCl缓冲液(例如，5mM三乙醇胺和50mM NaCl)中温育样本腔来预处理样本容器。温育可以持续30分钟并且防止分子附加到芯片表面以便最小化非特异性结合。然后可以向样本容器施加
10μl的硅油，以便防止测试溶液在被加热时蒸发。在对样本容器的这个预处理之后，将上述缓冲溶液装入样本容器。以此方式，当将血清样本插入样本容器中时可以引发反应(1)至(4)。

[0070] 为了基于ISFET和光电二极管测量而准确地确定血清中的代谢物的量，可能需要校准代谢物检测装置。这可以通过测量含有已知量的代谢物的一系列样本来执行，以便建立ISFET和/或光电二极管电压与代谢物浓度之间的关系。由于ISFET和/或光电二极管的电压响应将部分地取决于所使用的缓冲溶液(例如，具有较高缓冲能力的缓冲溶液将减小pH的变化，从而引起较低ISFET电压响应)，因此优选地针对特定缓冲溶液来校准代谢物检测装置。换句话说，期望实际测量中使用的缓冲液与用于校准的缓冲液相同。

[0071] 本发明的另一个实施方案可以基于图5所示的结构，但是其中光电二极管被单光子雪崩二极管(SPAD)替换。SPAD是基于在高于击穿电压的电压下逆向偏压的p-n结的半导体装置。能够检测低强度信号(下至单个光子)，并且以高时间分辨率(数十皮秒)来用信号表示光子到达的时间。

[0072] 独立地测量PD和SPAD两者对各种光强度的响应，以便确定两个检测器的总动态范围。通过逐渐地增大光学源，SPAD被证明为能够在功率计测量21pW/cm2时检测光，并且最大检测功率被限制为1.81μW/cm2，在该功率下SPAD开始饱和。类似地，发现PD检测动态范围响2 2 2 2
应是从280nW/cm至41.1μW/cm 。两个传感器的总合成动态范围是从19pW/cm至41.1μW/cm的范围内。结果表明，SPAD能够实现比PD可以实现的检测水平低得多的检测水平。因此，SPAD适合于需要高敏感性和低光照明的检测技术，而PD理想地适于不太敏感的检测技术或者需要高照射的技术，因为它在实验期间将不易受饱和的影响。

[0073] 本公开呈现了一种用于经由pH和颜色变化来同时地检测和分析代谢物的基于CMOS的ISFET和光电二极管传感器。已经用pH和比色读出开发出在血清中同时地检测冠心病的风险因素(葡萄糖和胆固醇)的测定。与需要单独样本和不同检测设备的常规方法不同，该测量可以使用基于CMOS的装置在一个单一阱中执行。没有观察到明显的串扰，从而意味着这种方法可以容易应用于检测在酶反应期间产生pH或颜色变化的其他代谢物。与用于代谢物检测和定量的当前分析方法相比，不需要昂贵的检测设备并且测试样本的体积非常小。这个测定的重要优点在于在一个感测窗口中实时地同时分析两种代谢物。这提供有用的信息以用于监测和诊断目的。因此，这个基于CMOS的ISFET和光电二极管装置可以用作快速即时诊断系统的一部分，其可以用于生物分子感测和用于个人代谢物剖析。通过提供可以使用标准CMOS工艺制造的装置，可以成本有效地实现提供上述多种感测模态的单次使用的一次性物品。

[0074] 参考文献

[0075] [1]Al-Rawhani,M.A.et al.:A Colorimetric CMOS-Based Platform for Rapid Total Serum Cholesterol Quantification,IEEE SENSORS JOURNAL,17(2):240-247[0076] [2]Cheah,B.C.et al.:An Integrated Circuit for Chip-Based Analysis of Enzyme Kinetics and Metabolite Quantification,IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems 10(3):721-730

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