一种胰腺癌血清标志分子的检测方法
阅读：321发布：2024-01-02
专利汇可以提供一种胰腺癌血清标志分子的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种胰腺癌血清标志分子的检测方法，通过定量免疫印记法检测人血清/ 血浆 中凝溶胶蛋白浓度，根据所述凝溶胶蛋白含量降低的 水 平无创性地辅助早期发现胰腺癌。人血浆凝溶胶蛋白标准品，按照一定浓度梯度稀释后与待测血清样本总蛋白共同经SDS－PAGE分离，将分离的蛋白从凝胶上转移至PVDF膜上。含有样本的PVDF膜与抗人凝溶胶蛋白 抗体 做免疫印迹反应，印迹 信号 经 化学发光 、放大后使X光片曝光。印迹结果扫描后在 图像分析 软件 辅助下，绘制凝溶胶蛋白标准品含量与印迹强度关系的标准曲线，并在标准曲线的线性范围内计算出同一凝胶上待测血清样品的凝溶胶蛋白含量。该方法简便、快捷，易于被患者接受，对辅助胰腺癌诊断有较高的敏感性和特异性。，下面是一种胰腺癌血清标志分子的检测方法专利的具体信息内容。
1、一种胰腺癌血清标志分子的检测方法，其特征在于：通过定量免疫印记 法检测人血清/血浆中凝溶胶蛋白浓度，根据所述凝溶胶蛋白含量降低的水平无 创性地辅助早期发现胰腺癌。
2、根据权利要求1所述的胰腺癌血清标志分子的检测方法，其特征在于：
A、采集病人手术前的血清，使用1×磷酸盐缓冲液稀释50倍后制成待测血 清样品；
B、将已知浓度的人血浆凝溶胶蛋白标准品，按照一定浓度梯度与所述待测 血清样品共同经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其中，每块含有所 述待测血清样品的胶上至少含有4个泳道连续浓度的所述人血浆凝溶胶蛋白标准 品；
C、通过电转移将经过分离的蛋白质从所述的胶上转移至聚偏氟乙烯膜上， 该膜经脱脂牛奶封闭后，用抗人凝溶胶蛋白抗体进行免疫印迹反应，反应信号 经化学发光、放大，并在暗室内对X光片曝光，形成凝溶胶蛋白印迹结果X光片；
D、使用扫描仪对凝溶胶蛋白印迹结果X光片扫描，用图像分析软件根据已 知凝溶胶蛋白标准品含量信号强度绘制标准曲线，并在标准曲线的线性范围内 计算出同一块胶上所述待测血清样品中未知的凝溶胶蛋白含量。
技术领域
本发明涉及一种胰腺癌血清标志分子的检测方法，该方法通过定量检测 存在于血清/血浆中凝溶胶蛋白(gelsolin)含量，无创性地辅助胰腺癌的早 期发现。
背景技术
胰腺癌是一种凶险的消化系统恶性肿瘤，发病隐匿，预后差。近10年来 其发病率和死亡率呈上升的趋势，根据中国疾病监测指示系统的报告，1991 年至2000年我国胰腺癌的死亡率由2.18/10万上升到3.26/10万，胰腺癌是 我国因癌症死亡的第5-7位常见恶性肿瘤。在美国，2003年新增胰腺癌病人 30,700人，因胰腺癌死亡30,000人，位居恶性肿瘤死亡的第四位。胰腺癌早 期一般没有症状。当肿瘤向周围脏器浸润，出现腹胀、背痛甚至黄疸等症状 时，大部分病人已经出现局部血管、脏器或淋巴结的侵犯或转移，丧失了根 治切除的机会，而化疗、放疗对胰腺癌的控制也不能很有效地延长生命。目 前，胰腺癌总的5年存活率仅为3-5％，确诊后的中位生存时间＜6个月。然而 对于局限在胰腺内的、无淋巴结转移的小胰腺癌(直径＜3cm)实行根治性切 除后，5年存活率可达40％，中位生存时间延长至32个月。因此能否实现对 胰腺癌的早期诊断是胰腺癌防治中的关键所在。
寻找胰腺癌特异的生物标志分子一直是胰腺癌研究的重要内容。Rosty等 使用表面增强激光解吸离子化质谱技术从胰液中发现了称为肝癌-小肠-胰 腺/胰腺炎相关蛋白I。在胰腺癌患者的胰液中该蛋白含量明显升高，其辅助 胰腺癌诊断的敏感性和特异性分别为75％和87％。由于采集人体胰液具有一定 的危险性，该方法不适合用于常规临床检查。目前用于胰腺癌辅助诊断的血 清肿瘤标志物有10余种，其中最常用的CA19-9，诊断胰腺癌的敏感性和特异 性约为70％和60％。但是，由于CA19-9是Lewis血型抗原标志，在人群中约 有5％-10％Lewis血型抗原阴性者不分泌CA19-9，因此CA19-9辅助诊断胰腺癌 的应用具有局限性。寻找特异性和敏感性高的血清/血浆肿瘤相关标志物分 子，对胰腺癌早诊、早治很有必要。
寻找胰腺癌特异的生物标志分子一直是胰腺癌研究的重要内容。Rosty等 使用表面增强激光解吸离子化质谱技术从胰液中发现了称为肝癌-小肠-胰 腺/胰腺炎相关蛋白I。在胰腺癌患者的胰液中该蛋白含量明显升高，其辅助 胰腺癌诊断的敏感性和特异性分别为75％和87％。由于采集人体胰液具有一定 的危险性，该方法不适合用于常规临床检查。目前用于胰腺癌辅助诊断的血 清肿瘤标志物有10余种，其中最常用的CA19-9，诊断胰腺癌的敏感性和特异 性约为70％和60％。但是，由于CA19-9是Lewis血型抗原标志，在人群中约 有5％-10％Lewis血型抗原阴性者不分泌CA19-9，因此CA19-9辅助诊断胰腺癌 的应用具有局限性。寻找特异性和敏感性高的血清/血浆肿瘤相关标志物分 子，对胰腺癌早诊、早治很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胰腺癌血清标志分子的检测方法，该方法可以 测定人血清中凝溶胶蛋白含量，血清凝溶胶蛋白含量明显降低可以作为一个血 清学标志分子，无创性地辅助胰腺癌诊断，早期发现胰腺癌。
本发明的目的是采用以下技术方案实现的：一种胰腺癌血清标志分子的检 测方法，通过定量免疫印记法检测人血清/血浆中凝溶胶蛋白浓度，根据所述凝 溶胶蛋白含量降低的水平无创性地辅助早期发现胰腺癌，其具体步骤是：
A、采集病人手术前的血清，使用1×磷酸盐缓冲液稀释50倍后制成待测血 清样品；
B、将已知浓度的人血浆凝溶胶蛋白标准品，按照一定浓度梯度与所述待测 血清样品共同经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其中，每块含有所 述待测血清样品的胶上至少含有4个泳道连续浓度的所述人血浆凝溶胶蛋白标准 品；
C、通过电转移将经过分离的蛋白质从所述的胶上转移至聚偏氟乙烯膜上， 该膜经脱脂牛奶封闭后，用抗人凝溶胶蛋白抗体进行免疫印迹反应，反应信号 经化学发光、放大，并在暗室内对X光片曝光，形成凝溶胶蛋白印迹结果X光片；
D、使用扫描仪对凝溶胶蛋白印迹结果X光片扫描，用图像分析软件根据已 知凝溶胶蛋白标准品含量信号强度绘制标准曲线，并在标准曲线的线性范围内 计算出同一块胶上所述待测血清样品中未知的凝溶胶蛋白含量。
本发明的有益效果是通过建立检测病人血清中凝溶胶蛋白(gelsolin)含 量的定量免疫印迹方法，准确测定血清凝溶胶蛋白含量。该方法简便、快捷、 患者易于接受，对辅助胰腺癌诊断有较高的敏感性和特异性，也为胰腺癌高危 人群筛查提供了一种新的、无创性的检查方式。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
图1血清凝溶胶蛋白含量的计算方法
图2血清凝溶胶蛋白平均含量的计算
图3血清凝溶胶蛋白标准曲线的绘制
本发明的目的是采用以下技术方案实现的：一种胰腺癌血清标志分子的检 测方法，通过定量免疫印记法检测人血清/血浆中凝溶胶蛋白浓度，根据所述凝 溶胶蛋白含量降低的水平无创性地辅助早期发现胰腺癌，其具体步骤是：
A、采集病人手术前的血清，使用1×磷酸盐缓冲液稀释50倍后制成待测血 清样品；
B、将已知浓度的人血浆凝溶胶蛋白标准品，按照一定浓度梯度与所述待测 血清样品共同经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其中，每块含有所 述待测血清样品的胶上至少含有4个泳道连续浓度的所述人血浆凝溶胶蛋白标准 品；
C、通过电转移将经过分离的蛋白质从所述的胶上转移至聚偏氟乙烯膜上， 该膜经脱脂牛奶封闭后，用抗人凝溶胶蛋白抗体进行免疫印迹反应，反应信号 经化学发光、放大，并在暗室内对X光片曝光，形成凝溶胶蛋白印迹结果X光片；
D、使用扫描仪对凝溶胶蛋白印迹结果X光片扫描，用图像分析软件根据已 知凝溶胶蛋白标准品含量信号强度绘制标准曲线，并在标准曲线的线性范围内 计算出同一块胶上所述待测血清样品中未知的凝溶胶蛋白含量。
本发明的有益效果是通过建立检测病人血清中凝溶胶蛋白(gelsolin)含 量的定量免疫印迹方法，准确测定血清凝溶胶蛋白含量。该方法简便、快捷、 患者易于接受，对辅助胰腺癌诊断有较高的敏感性和特异性，也为胰腺癌高危 人群筛查提供了一种新的、无创性的检查方式。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
图1血清凝溶胶蛋白含量的计算方法
图2血清凝溶胶蛋白平均含量的计算
图3血清凝溶胶蛋白标准曲线的绘制
具体实施方式
一种胰腺癌血清标志分子的检测方法，通过定量免疫印记法检测人血清/血 浆中凝溶胶蛋白(gelsolin)浓度，根据所述凝溶胶蛋白含量降低的水平无创 性地辅助早期发现胰腺癌，其具体步骤是：
A、采集病人血清：用不含任何抗凝剂的真空采血管(Greiner-Bio One， Frickenhausen，Germany)采集病人清晨空腹血液样本4毫升，在4℃下经3000 转/分，离心15分钟，于冰上分离血清。血清分装于多个0.5毫升的离心管中，于 干冰上速冻后立即转-80℃冰箱保存。使用时从冰箱中取出，在冰上自然融化后， 用1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，简称PBS)稀释50倍后制成 待测血清样品；
B、用1×PBS稀释人血浆凝溶胶蛋白标准品至5微克/毫升，制成已知浓度的 人血浆凝溶胶蛋白标准品；
将已知浓度的人血浆凝溶胶蛋白标准品和待测血清样品共同经十二烷基硫 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE)分离：蛋白标准品和待测血清样品在2×SDS 凝胶加样缓冲液中，经100℃加热10分钟处理后，加入SDS-PAGE加样孔。每块 胶上含有由4种连续递增浓度的标准凝溶胶蛋白泳道(即每泳道上样量分别为1 微克/毫升；2微克/毫升；3微克/毫升；3.5微克/毫升)和数个1∶50稀释的待 测病人血清样品(每泳道上样5微升)。凝胶置于垂直蛋白质电泳仪(mini- protein III，Bio-Rad Laboratories)上，在100-120伏恒压条件下使标准品 和待测样品的蛋白质在同一块胶上和完全相同的实验条件下分离；
C、电泳后将已分离的蛋白从凝胶上通过电转膜仪(mini-transblot cell， Bio-Rad Laboratories)在4℃、110伏恒压条件下转移至聚偏氟乙烯膜 (polyvinylidene difluoride，简称PVDF膜)，转膜1小时；
含有样品的PVDF膜经1×PBS稀释的10％脱脂牛奶(安怡长青高钙脱脂奶粉) 于4℃封闭3小时。用抗人凝溶胶蛋白抗体在膜上进行免疫印迹反应：加入1∶1000 稀释的小鼠抗人凝溶胶蛋白单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)室温 孵育2-3小时；洗膜液洗膜，5分钟/次，共洗3次；加入1∶3000稀释的辣根过氧 化物酶标记的羊抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)室温孵育1小时；洗 膜液洗膜，5分钟/次，共洗5次；加入化学发光试剂ECL(Santa Cruz Biotechnology)放大凝溶胶蛋白印迹信号，在暗室内对X光片(Kodak X-Omat V. Film)曝光(每张膜至少选3种不同曝光时间，曝光3次以上)，经显影、定影 后形成凝溶胶蛋白印迹结果X光片，见图1中的A部。图中显示出梯度稀释的凝溶 胶蛋白标准品(一块胶上至少有连续4个不同浓度)与待测血清样品在同一胶上 使蛋白质分离，并用凝溶胶蛋白抗体做特异性免疫印迹分析。结果显示，血清 中凝溶胶蛋白分子量为93kDa，N113、N115和N116为正常血清样品；P16、P57 和P118为胰腺癌血清样品。用人血清中相对恒定表达的转铁蛋白(transferrin ，分子量为80kDa)含量作为血清样本上样量的内对照。
D、用扫描仪(N-TEK NuScan 900)扫描凝溶胶蛋白印迹结果X光片，用图 像分析软件Quantity One 4.4.1(Bio-Rad Laboratories)根据已知凝溶胶蛋 白标准品含量信号强度绘制标准曲线。只有当已知含量的标准品与其对应的蛋 白印迹强度呈线性分布时(r＞0.94)，方可绘制二者之间线性关系的标准曲线 反之，如果r≤0.94，表示标准曲线不可信。进一步在标准曲线的线性范围内， 定量分析同一胶上待测血清的蛋白印迹强度，换算出凝溶胶蛋白含量。
参见图2所示，为了减小由于曝光时间不同对蛋白量与印迹强度间线性关系 影响的实验误差，分别计算三次不同曝光时间下凝溶胶蛋白含量，并取平均值 作为待测样本中凝溶胶蛋白的最终含量。
参见图1中的B部，图中显示根据凝溶胶蛋白标准品的蛋白含量及其对应印 迹信号强度，用Quantity One 4.4.1软件绘制的标准曲线，并根据待测血清样 本凝溶胶蛋白免疫印迹信号强度，在标准曲线的线性范围内计算出待测血清样 本中凝溶胶蛋白含量。横坐标为蛋白印迹强度(像素/平方毫米)，纵坐标为蛋 白浓度(微克/毫升)。Std1-Std4为凝溶胶蛋白标准品，N113、N115和N116为 正常血清样本；P16、P57和P118为胰腺癌血清样品。
图2显示血清中凝溶胶蛋白平均含量的计算方法。图中的A部、B部、C部、D 部、E部和F部代表六次实验结果。由于曝光时间的不同对蛋白含量与蛋白印迹 强度之间的线性关系有一定的影响，为了减小实验误差，每次实验取三种不同 曝光时间对X光片曝光(曝光时间1、2、3)，分别计算三次不同曝光时间的血 清样本凝溶胶蛋白的平均含量，作为待测样品中凝溶胶蛋白最终含量。
结果判定：待测血清样品中凝溶胶蛋白的含量降低，低于191.15mg/L时， 提示该患者可能患有胰腺癌，需高度注意。
在本实施例中，需要提供一个已知浓度的人血浆凝溶胶蛋白作为标准品的 数据，该数据产生如下：
将已知浓度(1毫克/毫升)的人血浆凝溶胶蛋白标准品(购自Cytoskeleton 公司，美国Denver，CO)用1×PBS稀释至5微克/毫升，并呈梯度递增加样， 使每泳道标准品上样量分别为1微克/毫升、1.5微克/毫升、2微克/毫升、2.5 微克/毫升、3微克/毫升和3.5微克/毫升。在每一批实验中至少含有4个连续 浓度的标准品点，绘制标准曲线。
人血浆凝溶胶蛋白标准品和数个1∶50稀释的待测血清(每泳道上样5微升) 样本在2×SDS凝胶加样缓冲液中经100℃加热10分钟后，SDS-PAGE凝胶置 于垂直蛋白质电泳仪(mini-protein III，Bio-Rad Laboratories)上，在100-120 伏恒压条件下使标准品和待测样本的蛋白质在同一块胶上和完全相同的实验条 件下按分子量大小分离；
通过电转膜仪(mini-transblot cell，Bio-Rad Laboratories)在4℃、 110伏恒压条件下，将电泳后的蛋白从凝胶上转移至PVDF膜(转膜1小时)。含 有样本的PVDF膜经1×PBS稀释的10％脱脂牛奶(安怡长青高钙脱脂奶粉)于4℃ 封闭3小时。加入1∶1000稀释的小鼠抗人凝溶胶蛋白单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)室温孵育2-3小时；洗膜液洗膜，5分钟/次，共洗3次；加入1∶3000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)室 温孵育1小时；洗膜液洗膜，5分钟/次，共洗5次；加入化学发光试剂ECL(Santa Cruz Biotechnology)放大凝溶胶蛋白印迹信号，在暗室内对X光片(Kodak X-Omat K Film)曝光(每张膜至少选3种不同曝光时间，曝光3次以上)，经 显影、定影后形成凝溶胶蛋白印迹结果X光片，参见图3中的A部。
凝溶胶蛋白印迹结果经扫描仪(N-TEK NuScan 900)扫描，使用图像分析 软件Quantity One 4.4.1(Bio-Rad Laboratories)根据已知凝溶胶蛋白标准 品含量和对应的印迹信号强度绘制标准曲线。只有当已知含量的标准品与其对 应的蛋白印迹强度呈线性分布时(r＞0.94)，方可绘制二者之间线性关系的标 准曲线。
图3中的A部显示凝溶胶蛋白标准品呈梯度递增加样后的免疫印迹结果。每 泳道标准品上样量分别为1微克/毫升、1.5微克/毫升、2微克/毫升、2.5微克/ 毫升、3微克/毫升和3.5微克/毫升等；图3中的B部显示使用Quantity One 4.4.1 软件绘制凝溶胶蛋白标准品的蛋白浓度与其对应的蛋白印迹强度之的标准曲线 (r＝0.996)。横坐标为蛋白印迹强度，即每平方毫米面积中的平均像素数 (pixel/mm2)，纵坐标为蛋白浓度，即每毫升体积含蛋白质的微克数(μg/ml)。
本实施例中所用液体配方如下：
1、1×PBS(pH7.4)：137mM NaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4。
2、2×SDS凝胶加样缓冲液：100mM Tris-HCl，pH6.8，200mM DTT，4％SDS， 0.2％溴酚蓝，20％甘油。
3、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM Tris，250mM甘氨酸，pH8.3，0.1％SDS。
4、转膜液：25mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3。
5、洗膜液：20mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，0.1％Tween-20。
本发明建立检测病人血清中新的胰腺癌血清学标志分子——凝溶胶蛋白含 量的定量免疫印迹方法，准确测定血清凝溶胶蛋白含量对早期发现胰腺癌具有 重要意义。通过定量免疫印迹方法检测了血浆型凝溶胶蛋白(gelsolin)在65 例胰腺导管腺癌、34例消化系统其它恶性肿瘤(包括食管癌6例、胃癌6例、 结直肠癌5例、十二直肠癌5例、胆囊癌4例、胆管癌3例和胰岛细胞瘤5 例)、11例胰腺良性疾病(慢性胰腺炎5例、假性囊肿3例和良性腺瘤3例) 和54例正常人血清中的表达水平。胰腺癌病人血清中凝溶胶蛋白的平均含量 为155.24±44.29mg/L，显著低于正常人血清凝溶胶蛋白平均含量 224.44±42.92mg/L；消化系统其它恶性肿瘤病人平均血清凝溶胶蛋白含量为 212.10±60.35mg/L；胰腺良性疾病病人血清凝溶胶蛋白含量为 203.74±26.70mg/L(P＜0.001)。而且，血清凝溶胶蛋白含量不受血清中其它 成分，如白蛋白、胆红素等的影响，比较稳定。受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线显示，以血清凝溶胶蛋白浓度 ≤191.15mg/L为标准，用血清凝溶胶蛋白含量检测胰腺癌的敏感性为78.5％， 特异性为72.7％，可以作为胰腺癌的一个血清学辅助诊断标志分子。
A、采集病人血清：用不含任何抗凝剂的真空采血管(Greiner-Bio One， Frickenhausen，Germany)采集病人清晨空腹血液样本4毫升，在4℃下经3000 转/分，离心15分钟，于冰上分离血清。血清分装于多个0.5毫升的离心管中，于 干冰上速冻后立即转-80℃冰箱保存。使用时从冰箱中取出，在冰上自然融化后， 用1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，简称PBS)稀释50倍后制成 待测血清样品；
B、用1×PBS稀释人血浆凝溶胶蛋白标准品至5微克/毫升，制成已知浓度的 人血浆凝溶胶蛋白标准品；
将已知浓度的人血浆凝溶胶蛋白标准品和待测血清样品共同经十二烷基硫 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE)分离：蛋白标准品和待测血清样品在2×SDS 凝胶加样缓冲液中，经100℃加热10分钟处理后，加入SDS-PAGE加样孔。每块 胶上含有由4种连续递增浓度的标准凝溶胶蛋白泳道(即每泳道上样量分别为1 微克/毫升；2微克/毫升；3微克/毫升；3.5微克/毫升)和数个1∶50稀释的待 测病人血清样品(每泳道上样5微升)。凝胶置于垂直蛋白质电泳仪(mini- protein III，Bio-Rad Laboratories)上，在100-120伏恒压条件下使标准品 和待测样品的蛋白质在同一块胶上和完全相同的实验条件下分离；
C、电泳后将已分离的蛋白从凝胶上通过电转膜仪(mini-transblot cell， Bio-Rad Laboratories)在4℃、110伏恒压条件下转移至聚偏氟乙烯膜 (polyvinylidene difluoride，简称PVDF膜)，转膜1小时；
含有样品的PVDF膜经1×PBS稀释的10％脱脂牛奶(安怡长青高钙脱脂奶粉) 于4℃封闭3小时。用抗人凝溶胶蛋白抗体在膜上进行免疫印迹反应：加入1∶1000 稀释的小鼠抗人凝溶胶蛋白单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)室温 孵育2-3小时；洗膜液洗膜，5分钟/次，共洗3次；加入1∶3000稀释的辣根过氧 化物酶标记的羊抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)室温孵育1小时；洗 膜液洗膜，5分钟/次，共洗5次；加入化学发光试剂ECL(Santa Cruz Biotechnology)放大凝溶胶蛋白印迹信号，在暗室内对X光片(Kodak X-Omat V. Film)曝光(每张膜至少选3种不同曝光时间，曝光3次以上)，经显影、定影 后形成凝溶胶蛋白印迹结果X光片，见图1中的A部。图中显示出梯度稀释的凝溶 胶蛋白标准品(一块胶上至少有连续4个不同浓度)与待测血清样品在同一胶上 使蛋白质分离，并用凝溶胶蛋白抗体做特异性免疫印迹分析。结果显示，血清 中凝溶胶蛋白分子量为93kDa，N113、N115和N116为正常血清样品；P16、P57 和P118为胰腺癌血清样品。用人血清中相对恒定表达的转铁蛋白(transferrin ，分子量为80kDa)含量作为血清样本上样量的内对照。
D、用扫描仪(N-TEK NuScan 900)扫描凝溶胶蛋白印迹结果X光片，用图 像分析软件Quantity One 4.4.1(Bio-Rad Laboratories)根据已知凝溶胶蛋 白标准品含量信号强度绘制标准曲线。只有当已知含量的标准品与其对应的蛋 白印迹强度呈线性分布时(r＞0.94)，方可绘制二者之间线性关系的标准曲线 反之，如果r≤0.94，表示标准曲线不可信。进一步在标准曲线的线性范围内， 定量分析同一胶上待测血清的蛋白印迹强度，换算出凝溶胶蛋白含量。
参见图2所示，为了减小由于曝光时间不同对蛋白量与印迹强度间线性关系 影响的实验误差，分别计算三次不同曝光时间下凝溶胶蛋白含量，并取平均值 作为待测样本中凝溶胶蛋白的最终含量。
参见图1中的B部，图中显示根据凝溶胶蛋白标准品的蛋白含量及其对应印 迹信号强度，用Quantity One 4.4.1软件绘制的标准曲线，并根据待测血清样 本凝溶胶蛋白免疫印迹信号强度，在标准曲线的线性范围内计算出待测血清样 本中凝溶胶蛋白含量。横坐标为蛋白印迹强度(像素/平方毫米)，纵坐标为蛋 白浓度(微克/毫升)。Std1-Std4为凝溶胶蛋白标准品，N113、N115和N116为 正常血清样本；P16、P57和P118为胰腺癌血清样品。
图2显示血清中凝溶胶蛋白平均含量的计算方法。图中的A部、B部、C部、D 部、E部和F部代表六次实验结果。由于曝光时间的不同对蛋白含量与蛋白印迹 强度之间的线性关系有一定的影响，为了减小实验误差，每次实验取三种不同 曝光时间对X光片曝光(曝光时间1、2、3)，分别计算三次不同曝光时间的血 清样本凝溶胶蛋白的平均含量，作为待测样品中凝溶胶蛋白最终含量。
结果判定：待测血清样品中凝溶胶蛋白的含量降低，低于191.15mg/L时， 提示该患者可能患有胰腺癌，需高度注意。
在本实施例中，需要提供一个已知浓度的人血浆凝溶胶蛋白作为标准品的 数据，该数据产生如下：
将已知浓度(1毫克/毫升)的人血浆凝溶胶蛋白标准品(购自Cytoskeleton 公司，美国Denver，CO)用1×PBS稀释至5微克/毫升，并呈梯度递增加样， 使每泳道标准品上样量分别为1微克/毫升、1.5微克/毫升、2微克/毫升、2.5 微克/毫升、3微克/毫升和3.5微克/毫升。在每一批实验中至少含有4个连续 浓度的标准品点，绘制标准曲线。
人血浆凝溶胶蛋白标准品和数个1∶50稀释的待测血清(每泳道上样5微升) 样本在2×SDS凝胶加样缓冲液中经100℃加热10分钟后，SDS-PAGE凝胶置 于垂直蛋白质电泳仪(mini-protein III，Bio-Rad Laboratories)上，在100-120 伏恒压条件下使标准品和待测样本的蛋白质在同一块胶上和完全相同的实验条 件下按分子量大小分离；
通过电转膜仪(mini-transblot cell，Bio-Rad Laboratories)在4℃、 110伏恒压条件下，将电泳后的蛋白从凝胶上转移至PVDF膜(转膜1小时)。含 有样本的PVDF膜经1×PBS稀释的10％脱脂牛奶(安怡长青高钙脱脂奶粉)于4℃ 封闭3小时。加入1∶1000稀释的小鼠抗人凝溶胶蛋白单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)室温孵育2-3小时；洗膜液洗膜，5分钟/次，共洗3次；加入1∶3000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)室 温孵育1小时；洗膜液洗膜，5分钟/次，共洗5次；加入化学发光试剂ECL(Santa Cruz Biotechnology)放大凝溶胶蛋白印迹信号，在暗室内对X光片(Kodak X-Omat K Film)曝光(每张膜至少选3种不同曝光时间，曝光3次以上)，经 显影、定影后形成凝溶胶蛋白印迹结果X光片，参见图3中的A部。
凝溶胶蛋白印迹结果经扫描仪(N-TEK NuScan 900)扫描，使用图像分析 软件Quantity One 4.4.1(Bio-Rad Laboratories)根据已知凝溶胶蛋白标准 品含量和对应的印迹信号强度绘制标准曲线。只有当已知含量的标准品与其对 应的蛋白印迹强度呈线性分布时(r＞0.94)，方可绘制二者之间线性关系的标 准曲线。
图3中的A部显示凝溶胶蛋白标准品呈梯度递增加样后的免疫印迹结果。每 泳道标准品上样量分别为1微克/毫升、1.5微克/毫升、2微克/毫升、2.5微克/ 毫升、3微克/毫升和3.5微克/毫升等；图3中的B部显示使用Quantity One 4.4.1 软件绘制凝溶胶蛋白标准品的蛋白浓度与其对应的蛋白印迹强度之的标准曲线 (r＝0.996)。横坐标为蛋白印迹强度，即每平方毫米面积中的平均像素数 (pixel/mm2)，纵坐标为蛋白浓度，即每毫升体积含蛋白质的微克数(μg/ml)。
本实施例中所用液体配方如下：
1、1×PBS(pH7.4)：137mM NaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4。
2、2×SDS凝胶加样缓冲液：100mM Tris-HCl，pH6.8，200mM DTT，4％SDS， 0.2％溴酚蓝，20％甘油。
3、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM Tris，250mM甘氨酸，pH8.3，0.1％SDS。
4、转膜液：25mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3。
5、洗膜液：20mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，0.1％Tween-20。
本发明建立检测病人血清中新的胰腺癌血清学标志分子——凝溶胶蛋白含 量的定量免疫印迹方法，准确测定血清凝溶胶蛋白含量对早期发现胰腺癌具有 重要意义。通过定量免疫印迹方法检测了血浆型凝溶胶蛋白(gelsolin)在65 例胰腺导管腺癌、34例消化系统其它恶性肿瘤(包括食管癌6例、胃癌6例、 结直肠癌5例、十二直肠癌5例、胆囊癌4例、胆管癌3例和胰岛细胞瘤5 例)、11例胰腺良性疾病(慢性胰腺炎5例、假性囊肿3例和良性腺瘤3例) 和54例正常人血清中的表达水平。胰腺癌病人血清中凝溶胶蛋白的平均含量 为155.24±44.29mg/L，显著低于正常人血清凝溶胶蛋白平均含量 224.44±42.92mg/L；消化系统其它恶性肿瘤病人平均血清凝溶胶蛋白含量为 212.10±60.35mg/L；胰腺良性疾病病人血清凝溶胶蛋白含量为 203.74±26.70mg/L(P＜0.001)。而且，血清凝溶胶蛋白含量不受血清中其它 成分，如白蛋白、胆红素等的影响，比较稳定。受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线显示，以血清凝溶胶蛋白浓度 ≤191.15mg/L为标准，用血清凝溶胶蛋白含量检测胰腺癌的敏感性为78.5％， 特异性为72.7％，可以作为胰腺癌的一个血清学辅助诊断标志分子。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种具有更新功能的电镀产品外观的检测系统 | 2020-05-08 | 376 |
| 一种基于VR技术的记忆提升检测方法及系统 | 2020-05-08 | 395 |
| 一种用于餐饮后厨的智能巡查方法 | 2020-05-08 | 210 |
| 基于低质量照片的多维度分析、识别与优化方法 | 2020-05-11 | 242 |
| Morris水迷宫实验图像分析系统及方法 | 2020-05-08 | 702 |
| 一种用于冷冻电镜分析的单颗粒图像聚类方法 | 2020-05-11 | 840 |
| 一种免疫层析检测的图像分析方法以及系统 | 2020-05-11 | 811 |
| 快速图像分析 | 2020-05-08 | 697 |
| 一种便携式超声影像智能处理系统及其辅助分析方法 | 2020-05-08 | 643 |
| 一种眼科房角眼前节图像分析系统 | 2020-05-08 | 967 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈