本发明是关于一种用作疫苗或疫苗中间体的溶液或粒子悬浮液。具体的讲，本发明涉及带有新型高效免疫粒子的乙型肝炎表面抗原（HBs    Ag）。本发明是关于该种粒子的制备过程及其用于例如人和黑猩猩类的动物免疫抗乙型肝炎病毒的方法。

现在称为乙型肝炎表面抗原（HBs    Ag）的东西与乙型肝炎病毒的关系许多年以前就被Alfred    M.Prince（Pro.Nat.Acad.Sci（U.S）60∶814-821，1968）所明确鉴定。该抗原主要位于嵌在颗粒大小约为18-24纳米的酯蛋白颗粒膜上的蛋白质表面以及具相似直径的丝状体上。现在已知其表现为类似膜的，包围乙型肝炎病毒（HBV）颗粒的膜的碎片，亦知其为“戴恩”（Dane）颗粒。

此后，具有该种粒子的疫苗被Blumberg等人发表于美国专利第3，636，191号，以后，Prince和其他人发表了别的具有由戴恩颗粒和丝状体得到的膜蛋白的乙型肝炎病毒疫苗。这些戴恩颗粒和丝状体含有或结合有发现于慢性乙型肝炎病毒的许多携带者身上的乙型肝炎e抗原。

因为进行了上述的工作，抗乙型肝炎病毒疫苗被引进已有HBs    Ag颗粒的美国。该疫苗为酶解含有由慢性感染的HBV携带者的颗粒衍生出来的粒子的HBs    Ag而获得，由前述美国专利第3，636，191号有此描述。本疫苗用昂贵的纯化方法所制备，结果其免疫原性大部分丧失。结果是必须给予相对来说大剂量的最终抗原（HBs    Ag）以得证足够的免疫反应。因为这些因素，所以该疫苗只能以相当高的价格得到，大约每支30美元或更高。因为需要独特的注射和两种辅助剂，所以现在在美国约需花费100美元以获得抗乙型肝炎免疫，这样的价格在世界上那些对这种疫苗的需求最大的地方是支付不起的。

因此，现已需要提供一种含有乙型肝炎表面抗原的乙型肝炎疫苗，该抗原以相当纯的形式存在，因而免疫原性大大地增强，所以可使用小得多的剂量而且花费又不太昂贵。当然，存在于起始血浆中的感染病毒已被完全灭活也是必需的，用以保证没有感染的危险。

乙型肝炎主要感染那些居住在亚洲和非洲的发展中国家的居民，在那里用于公共健康检查的资金有限。在二十世纪，有义务提供这样一种疫苗，用于那些被乙型肝炎病毒感染所威胁的，其结果是受到随之而来的肝癌和肝硬化发展威胁的无数人们的预防，并以能付出的价格提供该疫苗。在发展中世界的许多国家里，需要使免疫必须花费每人少于1美元。如果真要使用疫苗的话。

根据前述内容，由本发明提供的疫苗或疫苗中间体包含具有乙型肝炎表面抗原（HBs    Ag）粒子，该抗原已经基本上被转化成具有新的在自然界从未被发现过其形态的形式，并具有人惊奇地提高了的免疫原性。本发明的疫苗的特征在于，含有以重量计少于5%的血清蛋白，除了辛酸钠稳定血清白蛋白以外，实际上最好是没有血清蛋白质。

已经发现用于使在纯化后可能存留下的活病毒灭活的独特的快速加热方式，不但象黑猩猩试验所看到的那样病毒被灭活了，而且大部分粒被转化成新的形态的形式。它含有加热之前不存在的15-30纳米直径的丝状体形式。这些丝状形式包括图1和电子显微图所图解说明的新形态。这些形态包括直纤维，闭合环状或环状形纤维以及许多种类的分枝纤维。

一般说来，含有以这样希奇古怪的纤维状结构存在的粒子的HBs    Ag百分率用电子显微镜检查在15-75%之间。以含有已经转化为新的纤维状结构粒子起过全部含有粒子50%的HBs    Ag为更好。

另外，本发明疫苗可以其制备方式来表示其特征。一般说来，疫苗按下列步骤制备：

A.从血浆中沉淀HBs    Ag，例如，含有HBs    Ag的人血浆用聚乙二醇处理后，可从其中含有的其它血清蛋白质中分离出HBs    Ag;

B.分离出的HBs    Ag在羟基磷灰石上负吸附，进一步除去大部分血清蛋白;

C.这样吸附的HBs    Ag等密度离心分离残余的完态戴恩颗粒，并进一步除去残留的微量杂质血清蛋白;

D.对离心分离出的粒子加热使之热灭活，浓度为0.5-10mg/ml，温度101-104℃，2-5分钟，然后冷却热粒子，例如将它们置于冰水浴中。

前述A到C是重要的，因为正是通过这些步骤HBs    Ag被纯化，因而使经过热处理的大部分物质所含其它血清蛋白以重量计少于5%。换句话说就是经过热处理的物质含有以总蛋白质重量计至少95%的HBs    Ag粒子，以含99%以上的为更好。HBs    Ag最好不要被其它蛋白质稀释，但可以加入辛酸钠处理的清蛋白作为外加稳定剂。理想的是，在热灭活步骤（步骤D）中处理的组合物其特征在于其纯度，特别是不含其它血浆蛋白。

然而，步骤A-C产物的热灭活步骤不但有助于疫苗的安全，而且最重要的是增强了疫苗的免疫原性。这步灭活的步骤最好在101-104℃下将从步骤C得到的纯化粒子溶液通过一根直径为2mm的浸子101-104℃热介质（例如油浴）中的管子（例如，黄铜或不锈钢等），全部滞留时间为2.5-6.0分钟。对发明来说，最重要的是加热溶液的HBs    Ag蛋白浓度必须在0.1-10mg/ml之间，最好是在0.5-0.6mg/ml。应该认识到，在应用前述程序时，需要废时把在管道中的溶液加热到101-104℃，因此，“全部滞留时间”将比溶液实际上在1010-104℃被加热的时间要长一些。其差别当然取决于流速。

应该认识到，连续流体快速加热必须在升高的压力下进行，以防止当温度升至高于100℃时溶液的蒸发。这些由于高压液体色层分离泵的使用而很容易地达到，而且流体静压力使之从接受管道中流出。

非强制性地，可通过用吐温80类的洗涤剂处理步骤C所纯化的抗原的方法进行追加的灭活，例如，将等体积的2%的吐温80加入于水中。这种处理进一步增强疫苗的安全性。然而，因为如果灭活步骤中没有洗涤处理的话则最终产物免疫性更强，所以，不要洗涤剂处理为更好。

跟着快速加热灭活步骤，重新得到的纯化的和病毒灭活的粒子溶液，如果需要的话，可以通过磷酸铝或氢氧化铝凝胶吸附而作为辅药。用于热带国家时可在加入铝凝胶之前需要将疫苗冻干，并且，如果需要的话在再水化之后加入铝凝胶。

此后用生李上可接受的媒介质，例如0.15摩尔Na    Cl所稀释，制备最终疫苗。

作为最后的安全保证，需要将最后桶装的或在最终容器内的铝吸附疫苗作追加热灭活处理，即暴露于65℃，10-18小时。最后的巴氏灭菌步骤是从对黑猩猩的研究中得知的，能使大约10，000感染剂量的乙型肝炎病毒（HBV）灭活，而对疫苗的免疫原性只有极小或没有影响。

在最终疫苗中，HBs    Ag所含蛋白的浓度为每毫升0.1-10毫克。用于注射的合适的剂量取决于受者的年龄。成年男性的典型剂量在1-10mg，HBs    Ag之间，并且可以肌内、皮下或皮内注射。

图1是表示从小球形颗粒经快速加热产生的丝状体的纲要图解：a.线状纤维;b.闭环或环状纤维;c.分枝纤维;d.开环纤维;e.分枝环状纤维;f.多重分枝纤维。

图2为表示按本发明制备疫苗的方法的流程图。

图3是含有前述步骤A-C得到的粒子的磷钨酸负染HBs    Ag的电镜照片，没有进行本发明的快速加热处理，并且含有HBs    Ag粒子的主要形式是18-24纳米的球状颗粒。

图4是一幅电镜照片，类似图1，显示出当进行热处理时含有颗粒的HBs    Ag的形态，表明粒子转化成线状，分枝和环状丝状体。

图5是相似于图3和图4的，将示于图4的溶液8000g下离心20分钟并过滤所得上清液之后得到的上清液碎片的电镜照片。

图6为一类似图3到图5的电镜照片，表示由8000g下离心20分钟所得沉淀，在等渗盐水中重新悬浮至原体积。

图7为类似图3到图6的电镜照片，表示含有按本发明方法制备的粒子的HBs    Ag，其中HBs    Ag粒子在3mg/ml辛酸钠处理了的血清清蛋白存在下被快速加热处理时。得到的是相同的形态结构。

图8为热灭活纯化HBs    Ag在准备的小鼠中的免疫原性的效果，其形态已在图3-6中说明过。

现将参考图2说明本发明。有代表性的，100立升含有HBs    Ag的血浆，最好也含有乙型肝炎e抗原（HBe    Ag），在调整到PH4.6以后进行处理，用连续流动离心机纯化，用浓度为3-8%的聚乙二醇（分子量2000-8000）使其沉淀。沉淀含有带颗粒的HBs    Ag。含有其它血清蛋白的上清液移去，沉淀加入蒸馏水，重新溶解至体积为24立升，并将PH调至7.5-8.0。随后将溶液调到PH5.0并将最终沉淀移去。

此后，该组份用聚乙二醇（分子量为2000-8000）处理，PH调到3.5-5.0之后将聚乙二醇调到重量百分比为2.5-6.0范围内，PH最好为4.6，可形成含有HBs    Ag的次级沉淀。因此形成的含有残余血清蛋白的上清液弃去。次级沉淀在调PH为5.0后按上述加入蒸馏水溶解，PH调到6.0-8.0，最好PH6.8，总体积为8升。

溶于0.005MPH6.8磷酸缓冲液的HBs    Ag随后用填充羟茎磷灰石处理。上清液以及0.02和0.05M磷酸缓冲洗脱液用透析过滤法浓缩至0.3立升并进行浮选等密度区带离心。

在这一步，浓缩的HBs    Ag用固体溴化钾调节到1.23-1.30g/ml密度，并于转子中以1.3-2g/ml    KBr作底，上为1.05-1.20g/ml    KBr线性梯度被动力填充。在每分钟25，000-35，000转下梯度离心16-24小时，泵水于转子中心使之分离。收集密度在1.17-1.22g/ml的相应部分。

为把HBs    Ag稀释至浓度为0.5-10mg/ml，用普通生理盐水将结果部分的体积调整到1-10立升。然后，溶液最好用等体积的吐温80洗涤剂或其它两性离子洗涤剂处理一下，使用其浓度为1-3重量百分比的水溶液。高含量HBs    Ag可在4-25℃下与洗涤剂接触0.5-24小时。

然后，该组份用0.22微米滤器过滤并于101-104℃下加热之1-15分钟使其热灭活，最好是2-5分钟，其时该组份如上述在压力下通过一根0.1-10mm，最好1-3mm直径的浸于102-105℃油浴的不锈钢管。压力必须足以防止沸腾，即800-1000mmHg，特别是900-1000mmHg。

然后将已加热的部分冷却，可将热溶液收集于一浸于冰水浴中的容器。一般说来，在热处理结束后的5分钟之内冷至2-4℃是最好的。不过可以推知将溶液通过一已知温度在20-100℃尤其是75-90℃下浴槽内的二级盘管可达到理想的效果。

含有物质的纯化了并快速加热灭活的HBs    Ag，随后用磷酸铝佐剂适当处理。一般说来，预先灭菌的磷酸铝在无菌条件下加入于稀释的灭活抗原中，以得到每毫升抗原含有0.3-0.6mg磷酸铝的稀释抗原。此后，加入佐剂的组份被无菌填充于适当的容器内。最终容器在65℃下进一步处理10个小时（巴氏灭菌法）作为附加灭菌处理以进一步保证最终产物的安全性。疫苗在用于免疫之前被贮存于2-6℃的温度下三年。

作为按上述方式纯化HBs    Ag及对所含粒子浓度在0.1-10mg/ml的相对较纯的HBs    Ag进行上述热处理的结果，产生了象图4-7所示的异常形态的HBs    Ag粒子。而含有颗粒的起始HBs    Ag通常为球形，且大部分大小为18-24纳米，（图3），照本发明的方法所得的粒子主要转化为正如在图1、图4和图6中所看到的多形纤维。特别值得注意的是在此之前没见过的纤维，正如在图4至图7，特别是图5中所看到的那样。这种具有HBs    Ag抗原性的纤维具有分枝的或环状的特性。它们的构象可以是直线的或者是曲线的。一般说来，纤维长度至少为50纳米，通常在100-1000纳米之间。

当丝状结构分枝时，其分枝结构长度至少50纳米，且常见的为100-300纳米。按本发明方法制备的一些丝状体，每一丝状结构至少有三个分枝且具有不规则的形状，其最小长度至少为100纳米，以200-1000纳米更好。

应该强调一下，这种分枝或环状形纤维从未在结合含有未进行快速热处理粒子的、由血清制备的HBs    Ag上见到过。

参见图4-7的电镜照片，将可以观察到含有包括本发明环状粒子，分枝纤维和线状纤维粒子的HBs    Ag，以及球形的16-25纳米的HBs    Ag粒子。

新形态类型包括具有从粒子上突出的纤维蛋白的环状粒子。这些丝状粒子通常具有至少50纳米的长度，一般长100-300纳米。

当用洗涤剂处理时，无分枝纤维可进一步通过20℃下1.210和1.230g/ec（平均1.224g/ec）间的密度而特征化，并因此与在一些慢性HBs    Ag携带者的原生质中所见到的无分枝纤维相区别，该携带者含有所谓的戴恩颗粒和或结合纤维。后者具有1.200的平均密度。

“环状”颗粒包括那些基本上形成了完整的圈或环和其它实际上围成一区域的环。由含有质团的HBs    Ag所确定的范围可为任意形状，包括椭圆形和环状形的，即其可有规则的或不规则的形状。

观察到的新形态类型与前述微团粒子有显著区别。后者的特征是具有由疏水末端和多肽链所构成的中心体，其亲水蛋白扩展到近似球形颗粒的表面而按本发明制备的纤维并未与中心体接触。一些纤维以不规则环状形式存在，以及它们本身有突出的纤维的环状形式存在。但通常不超过三个，一般为两个或者只有一个这样突出的纤维。当然，本发明粒子没有向外突出纤维的紧密坚实的核。

为了更全面地说明本发明及实验本发明的方法，列出下列实施例：实施例1将从慢性HBs    Ag携带者得到的含有HBs    Ag和HBe    Ag的郁滞的血浆调PH4.6并于Westphalia连续流动离心机上以每分钟10，000转分离。澄清的上清液在4℃下调聚乙二醇（PEG）6000至最终浓度为4%，搅拌20分钟。不离心静置2小时回收沉淀并用蒸馏水调PH到7.5-8.0溶解为原体积的1/5。然后PH降至5.0，最终沉淀用离心法回收。然后将上清液PH调到4.6，加入聚乙二醇到最终浓度为3%。

4℃静置过夜后，沉淀被中性再溶解，在象前述那样降低PH至5.0以后将上清液澄清。将该物质的PH调到6.8，加入0.005M磷酸缓冲液后用等体积的填充羟基磷灰石连续吸附2-3次进一步纯化。随后用0.02和0.05M的磷酸缓冲液洗脱羟基磷灰石沉淀。最后将原上清液与羟基磷灰石沉淀的洗脱液汇总，离心澄清之并用Amicon空心纤维药筒浓缩到大约起始血浆体积的0.3%。浓缩的HBs    Ag随后用固体KBr（溴化钾）调整密度为1.25gm/ml，并以1.3g/ml    KBr作底，上为1.05-1.2g/ml    KBr线性梯度动态填充于Beckman    Ti-14离心转子中。在每分钟28，000转下梯度离心18小时，并通过往转子中心泵水而分离之。收集相应于密度为1.17-1.22g/ml间的部分。

纯化的抗原调整浓度为1mg/ml（建立在OD280，E0.1%1cm＝3.73的基础上）并用同体积2%吐温80洗涤剂稀释之。这步洗涤剂处理可以从戴恩颗粒上剥去其外膜，因此使它们无传染性。除去一些类酯化合物的结果，是也将剩余粒子水溶液密度从平均为1.200g/ml变到1.224g/ml。室温下静置1小时以后，溶液用0.22微米微孔过滤器过滤。然后将纯化抗原在950mmHg压力下通过一直径为2mm的悬浮于温度保持在102℃的油浴中的不锈钢盘管中，其速度为使原料在102℃保留2分钟。这就需要全部滞留时间为2分40秒。稀释后，所得组份用无菌磷酸铝作为佐剂。最终铝吸附疫苗在65℃下进一步处理10小时作为追加病毒灭活步骤。

对照例2：基本上重复实施例1的程序，除去在102℃下热灭活步骤及其后步骤。所得HBs    Ag含有大量的蛋白浓度，象实施例1中所说的那样为1.18g/ml。HBs    Ag纯度为95%或更高，根据用多价和单价抗人体血清蛋白质的抗血清凝胶渗滤的研究。因此，该组份主要是基本上不具有人血清蛋白。一部分样品用2%磷钨酸负染后在195，000X放大率下电镜观察。本样品的电镜照片示于图3。

实施例3：例2描述的样品的一部分随之暴露于102℃下进行热处理，通过1支2mm直径的浸于102℃油浴中的不锈钢管，总滞留时间为2分40秒。40秒是用于使其温度达到102℃。因此，蛋白组份在102℃下加热约2分钟。样品变得稍带乳白色，指示有一些聚集。样品的一部分经负染并拍摄其电镜照片。如图4所示，加热后出现线状的，分枝的通常为环形丝状体的表面抗原颗粒。这些颗粒在起始制剂中是不存在的。这些颗粒与其说是简单聚集到不如说是真实的膜融合的结果，因为即使是置于超声波下30分钟也不影响它们的形态。

为测定纤维状及球状颗粒的相对免疫原性，可用离心法进行不完全的互相分离。

实施例4：实施例3中加热了的制剂在8000g下离心20分钟，分离出上清液，加入50μl/ml的吐温20以减少过滤损失后，用0.22微米微孔滤膜进一步过滤。这部分上清液的一部分用磷钨酸负染并于电镜下观察，结果为图5的电镜照片。

实施例5：

实施例4过滤的沉淀重新用等渗盐水悬浮至原体积，随后负染进行电镜观察，拍下图5所示电镜照片。

实施例6：清蛋白存在下的快速加热灭活，按实施例3所述在3mg/ml人血清清蛋白存在下对制剂进行快速加热，用辛酸钠稳定。多形纤维体再次产生（图7）。

实施例7：佐剂蛋白组合物的制备30微升实施例2和实施例3的组份，40微升实施例4组份及90微升实施例5的组份分别加入于10ml无菌生理盐水中，根据OD280估计，结果为每毫升4微克。因为加热过程而产生的乳色，其被认为是蛋白浓度的近似估量。这些样品更精确的蛋白浓度范围用BIORAD蛋白质测定法取得。溶液用等体积磷酸铝凝胶（1.2mg/ml）调节，该凝胶为Rijks    Instvoor    de    Volksgesund    heid    of    Bilthoven，Holland所制备，其结果为约1mg/0.5ml剂量吸附于0.3mg磷酸铝凝胶。

含有各自抗原量的1/4和1/16的盐水稀释液象上述那样吸附于铝佐剂，给出的剂量为0.25和0.6微克。对照用盐水代替抗原溶液同样制备。

小鼠的接种每组20只重20-22g的雌性ICR    Swiss小鼠腹膜内接种0，5cc不同制剂。每一样品接种60只小鼠，20只接受三份稀释剂。10只小鼠接种对照佐剂。

所有小鼠都心脏放血。血收集于各自的试管中，在室温下凝块，在离心血块（每分钟3，000转，15分钟）回收血清之前于4℃静置过夜。

每一血清用AusAB 试验装置（Abbott Lsboratories，Chicago，Illinois），按定量平行放射免疫测定法测定，与每毫升含100国际单位的WHO国际HBIG标准对比。样品给出的放射活性大于国际标准，不超出相对稀释的线性曲线并每分钟计数减去负对照，平均CPM（每分次数），再以1∶10和1∶100稀释后重测。样品的HBs Ag抗原性用AusRIA

试验装置（Abbott Laboratories，North Chicago，Illinois）按平行放射免疫测定法判定，与U.S.F.D.A提供的暂定HBs Ag/ad标准对比。由此标准所得的结果与德国国家HBs Ag/ad标准（German National HBs Ag/ad Standard）一致。

下面的表1显示实施例2-5不同样品的蛋白质含量抗原性及其比率，即“特异抗原性可以看出加热降低了特异抗原性约50%。实施例5特别明显，它具有丰富的丝状体，正如在图6中所见到的。

图8示一次注射4份制剂稀释液28-30天后显示出至少产生1m    IU/ml抗乙型肝炎表面抗体（anti-HBs）的小鼠百分比。可以看出热处理制剂具有显著增强的按本标准的免疫原性。小鼠50%血清转化所需剂量的判定揭示了热处理导致免疫原性增效7.4倍，正如下面的表2所示。纤维体组份（实施例5）致免疫性最强，增效29.5倍。

表1（加热对特异抗原性的影响）实施例    原料    HBs    Ag    HBs    Ag    起始抗原的特1    2    3蛋白1（mg/ml） 抗原性2（mg/ml） 异抗原性3（%）2.未处理HBs    Ag    1.44    0.55    0.38    1003.102℃2分钟    1.44    0.27    0.19    50R×HBs    Ag4.102℃2分钟    0.74    0.23    0.31    818000g上清液5.102℃2分钟    0.35    0.02    0.06    168000g沉淀1.用BIORAD蛋白质测定法

2.按平行放射免疫测定法（RIA），用Aus    RIA试验，与FDAHBs    Ag/ad暂定标准相比较。

3.特异抗原性：用RIA的HBs    Ag    μg对用BIORAD蛋白质测定法的HBs    Ag/ad    标准/μg    HBs    Ag蛋白质。

表2.纯化HBs    Ag热灭活对小鼠免疫原性的影响，总结。

（A）血清转化50%（ED50）所需剂量的影响实施例原料估计的ED50增效系数（lgng/鼠ng/鼠）2.未处理HBs    Ag    2.91    813    1.03.102℃2分钟    2.04    110    7.4R×HBs    Ag4.102℃2分钟    2.46    288    2.88000g上清液5.102℃2分钟    1.44    276    29.58000g沉淀（B）在反应者中对平均抗HBs抗体水平的影响。实施例    原料给出1.5lg1.m    IU/ml    增效系数的估计计量（lgng/鼠ng/鼠）2.未处理HBs    Ag    3.81    1500    1.03.102℃2分钟    2.40    250    6.0R×HBs    Ag4.102℃2分钟    2.46    288    5.28000g上清液5.102℃2分钟    1.95    89    16.8

8000g沉淀从上述数据可以推断出，按前述分离方法制备的基本上纯化的HBs Ag粒子的加热，实际上增加了HBs Ag的免疫原性从而产生了较高的抗体水平。一个定量参数通过估计产生1.5log10mIU/ml（32m IU）的几何平均乙型肝炎表面抗体水平所需要的剂量而得到。用这个参数估计在102℃下加热2分钟可增加6倍免疫原性。因此，本发明的蛋白质的大部分可由具有4-10倍免疫原性，特别是比基本上由18-24纳米直径的球形HBs Ag颗粒所构成的蛋白质的免疫原性大6-8倍而特征化。当然，通过从球形18-24纳米颗粒中分离出本发明的纤维结构，最终产物甚至可以具有更强的免疫原性，以20-30倍级数增长，正象前述关于实施例5的产物数据显示的那样。

因此，意外发现了通过按本发明的程序纯化的HBs    Ag象前述那样的在102℃灭活两分钟不但使残留传染性降到所预想的那样，而且免疫原性出乎意料地得到明显的增加。增强的免疫原性使疫苗以较低蛋白含量配制，并因此而降低了疫苗生产的总成本，从而其价格大大低于目前所用的疫苗。

实施例8：按另一纯化技术和相似的但是不同的热灭活技术得到的热灭活疫苗与按本发明步骤制得的纯化抗原的灭活的比较评价。

HBs    Ag的纯化按前述程序用聚乙二醇（PEG）两次沉淀后负吸附于羟基磷灰石纯化，并使之等密度离心纯化。这个部分纯化的物质在此定为样品A。

另一部分纯化的HBs    Ag组份，此处定为样品B，按Brummelhuis等人所描述的方法制造（Preparation    of    Hepatitis    B    Vaccine    by    Heat    Inactivation    in    Hepatitis    B    Vaccine    in    SerumSymposium    No.18，Eds.P.Maupas    and    P.Guesry，Elsevier/North-Holland    Biomedical    Press，1981）。

样品A用磷酸缓冲盐水稀释为1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml和6mg/ml，并按下述方法进行热处理。样品B用重悬浮HBs    Ag的最终颗粒按Brummelhuis方法所详细说明的调到20μg    HBs    Ag/ml的浓度进行热处理。

样品A和B置于内径为2毫米的金属管中，后接一短的用金属螺旋夹夹住的硅橡胶管。热灭活是在把管子浸于一加热至102℃的热稳定油浴中进行的。样品A和B在102℃温度下的滞留时间是两分钟。然后，将它们移至冰水浴中冷却。

最终产物的样品按图3-6即磷钨酸负染的方法负染后进行电镜观察。样品A（1-6mg/ml）的电镜照片显示了在图4-6中见到的同样的多形态纤维。按Netherlands    Red    Cross的方法制备的灭活样品，样品B含有除HBs    Ag外至少约3mg/ml的其它血清蛋白。其电镜照片显示了基本上无纤维HBs    Ag颗粒。已经发现加入辛酸钠稳定的清蛋白至1-3mg/ml，象实施例6那样，不改变向多形态形式（图7）的转化，或免疫原性的增强。可以推断出HBs    Ag纯化的方式及其被加热时的浓度决定其是否能由于进行随后的快速热处理，HBs    Ag粒子被转化成图4-6所示的新型的不常见的形态结构。因此，热灭活不是本身形态效应的决定因素，而宁可说由于现在所用的热灭活方法和纯化技术相结合而形成的新形态结构是免疫原性增强的原因。

前面描述了实施本发明的现在所期望的最佳方式。在开始的导致异常形态结构的HBs    Ag的研究中，纯化的HBs    Ag用适当的蛋白质稀释，例如，可防止热灭活对HBs    Ag可能具有的任何有害效果的血清清蛋白，即保护HBs    Ag使之不受变性作用的侵害。随后，Messers    Prince和Kim发现，不进行这种稀释也可进行灭活，实施本发明的最佳方式是对纯化的并没有稀释的HBs    Ag进行灭活。这种最佳方式的进行也产生上述改善了的HBs    Ag形态结构，该方法是即将以Messers    Prince和Kim的名字申请的独立专利的主题。

我们期望本发明的原理，即通过对高浓度纯化膜制剂的快速加热灭活增强类酯膜免疫原的免疫原性将很快用于增强其他疫苗的效力和/或降低所需的剂量，象重组DNA所得的在真核细胞中产生的疫苗，例如，酵母和细胞培养得到基于乙型肝炎的重组DNA和其它疫苗，即现存的杀死疫苗，例如，用于流感、狂犬病、麻疹、疱疹族病毒，逆病毒的疫苗，逆病毒有HTLV    Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，寄生疫苗和其它现在应用或发展过程中的疫苗。