海绵共附生优势细菌组成及宿主特异菌的分子鉴定方法
阅读：433发布：2020-08-04
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1.一种海绵共附生的优势细菌组成及宿主特异菌的分子鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：1)海绵共附生微生物的基因组总DNA的提取：将海绵样品用无菌小刀切成小块，加入pH8.0-8.5的由三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸二钠配置的TE缓冲液，于置于冰块上的研钵中研磨，取研磨后的悬浮液离心弃上清，加入TE缓冲液悬浮沉淀，并加入溶菌酶混匀，35-40℃水浴处理，再加入十二烷基磺酸钠及蛋白酶K混匀于50-60℃水浴处理，离心取上清，加入1-1.5倍体积的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚充分混匀重复抽提，离心取上清，依次加入1-1.5倍体积的体积比为25∶24∶1的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚∶氯仿∶异戊醇混合液、1-1.5倍体积的体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液处理，离心取上清后，加入0.1-0.2倍体积的5M NaCl和1-2倍体积的异丙醇处理析出DNA沉淀，离心弃去异丙醇，加入70-75％的乙醇洗涤沉淀，离心弃去乙醇，干燥后将沉淀加入TE缓冲液和不含DNA酶的RNase酶，35-40℃水浴处理消解去除RNA，琼脂糖凝胶电泳分析得到基因组总DNA样品；2)16S rDNA-DGGE基因指纹图的构建：以第1步得到的基因组总DNA样品为模板，采用针对细菌16S rDNA的通用引物经聚合酶链式反应扩增得到海绵共附生细菌DNA的16S rDNA片段，将小于500bp的16S rDNA的混合片段进行变性梯度凝胶电泳，染色、拍照得到变性梯度凝胶电泳的指纹图谱；3)海绵共附生的优势细菌组成的分子鉴定：对于每一种海绵的变性梯度凝胶电泳的指纹图谱，割胶回收条带，经无菌水多次冲洗后捣碎，加入TE缓冲液浸泡、涡旋后离心取上清作为聚合酶链式反应的模板进行再扩增，确认是回收的条带后用DNA纯化试剂盒纯化，构建重组载体后转化宿主菌，筛选、鉴定连接有外源DNA片段的阳性克隆，提取质粒DNA进行16S rDNA测序，通过对照基因库进行序列同源性比对和系统发育树分析，确定条带代表的细菌的分类地位；4)海绵宿主特异菌的分子鉴定：通过对比不同海绵的变性梯度凝胶电泳指纹图谱的差异，找出某一海绵特有的差异性条带，采用以上相同的方法割胶回收、克隆测序、序列同源性比对和系统发育树分析，确定宿主特异菌的分类地位。
海绵共附生优势细菌组成及宿主特异菌的分子鉴定方法
技术领域
背景技术
海绵具有独特的腔状结构，依靠过滤海水吸收营养生存，体内聚集了大量的共附生微生物，一般可以达到海绵体积的40％以上。这些微生物一些可以作为海绵的食物而被消解，另外一些在海绵体内、体表生存下来，并可能参与海绵的化学防御中或者为海绵提供能量。因此，揭示这些微生物的组成信息是开发利用海绵共附生微生物资源的前提。然而，由于目前依赖于分离培养的微生物研究方法仅能揭示不到1％的微生物信息，99％以上的环境微生物是目前还不能分离得到的，对于海绵共附生微生物而言，能被分离培养的微生物所占整个共附生微生物的比例远小于1％，因此依赖于分离培养的研究方法不可能揭示海绵共附生微生物的组成信息。如果想全面地、原位地揭示海绵丰富的共附生微生物组成信息，就必须采用不依赖于分离培养的分子技术。
核糖体RNA基因既具有保守性又具有高变性。保守性使其能够反映生命物种的系统关系，为系统发育提供线索；高变性则能反映出物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。目前基于16S rDNA信息的分子技术已经成为直接从分子水平揭示环境微生物区系组成的有力工具。16S rDNA文库分析是一种经典的揭示某一环境区系微生物多样性组成的分子技术，其优点在于可以全面地揭示微生物区系的整体组成信息，缺点在于操作复杂、费时，不适合不同样品及同一样品在不同时间或者空间时微生物组成的比较。荧光原位杂交等技术虽然能够对于一些已知序列的微生物分布进行揭示，但是因为探针设计需要建立在已知基因信息基础上，因此仅限于少数微生物信息的揭示。
如果希望能对于不同海绵样品中的共附生微生物组成进行全面揭示和比较，DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术是一个很好方法，其优势在于能快速揭示优势菌组成的差异性与相似性，简便快捷，尤其适合不同样品中微生物组成的比较，以及同一样品在不同时间和空间时微生物组成的变化揭示。通过16S rDNA-DGGE基因指纹与克隆测序和系统发育树分析相结合，就能很好地实现海绵共附生微生物组成与多样性的快速揭示，这些特点是现有技术所不具备的。目前还没有采用16S rDNA-DGGE技术揭示不同海绵的共附生微生物组成结构与多样性及宿主特异细菌的方法的报道。
核糖体RNA基因既具有保守性又具有高变性。保守性使其能够反映生命物种的系统关系，为系统发育提供线索；高变性则能反映出物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。目前基于16S rDNA信息的分子技术已经成为直接从分子水平揭示环境微生物区系组成的有力工具。16S rDNA文库分析是一种经典的揭示某一环境区系微生物多样性组成的分子技术，其优点在于可以全面地揭示微生物区系的整体组成信息，缺点在于操作复杂、费时，不适合不同样品及同一样品在不同时间或者空间时微生物组成的比较。荧光原位杂交等技术虽然能够对于一些已知序列的微生物分布进行揭示，但是因为探针设计需要建立在已知基因信息基础上，因此仅限于少数微生物信息的揭示。
如果希望能对于不同海绵样品中的共附生微生物组成进行全面揭示和比较，DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术是一个很好方法，其优势在于能快速揭示优势菌组成的差异性与相似性，简便快捷，尤其适合不同样品中微生物组成的比较，以及同一样品在不同时间和空间时微生物组成的变化揭示。通过16S rDNA-DGGE基因指纹与克隆测序和系统发育树分析相结合，就能很好地实现海绵共附生微生物组成与多样性的快速揭示，这些特点是现有技术所不具备的。目前还没有采用16S rDNA-DGGE技术揭示不同海绵的共附生微生物组成结构与多样性及宿主特异细菌的方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种海绵共附生细菌种群组成及宿主特异菌的分子鉴定方法，采用不依赖于分离培养的分子技术，实现不同海绵共附生微生物的种群组成结构和宿主特异性细菌的快速揭示。
为实现这一目的，本发明首先采用机械研磨破碎海绵组织结构，再采用溶菌酶与蛋白酶K破壁方法释放DNA，采用酚-氯仿抽提方法制备海绵共附生微生物宏基因组总DNA样品。然后以提取的DNA样品为模板，以细菌通用性引物进行16SrDNA片段的PCR(聚合酶链式反应)扩增。将得到的小于500bp的16S rDNA片段混合样品进行变性梯度凝胶电泳，染色后拍照得到海绵共附生细菌的16SrDNA-DGGE基因指纹图谱。割胶回收DNA条带，再次PCR扩增及变性梯度凝胶电泳确认条带位置，纯化后克隆、测序，对照基因库进行同源性与系统发育分析，通过一种海绵的DGGE指纹图谱上所有条带的分析对海绵共附生的优势细菌种群组成进行分子鉴定，通过找到不同海绵的DGGE指纹图谱上的差异性条带完成宿主特异细菌的分子鉴定。
本发明的方法具体包括如下步骤：1、海绵共附生微生物的基因组总DNA的提取：将海绵样品用无菌小刀切成小块，加入pH8.0-8.5的由三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸二钠配置的TE缓冲液，于置于冰块上的研钵中研磨，取研磨后的悬浮液离心弃上清，加入TE缓冲液悬浮沉淀，并加入溶菌酶混匀，35-40℃水浴处理，再加入十二烷基磺酸钠及蛋白酶K混匀于50-60℃水浴处理，离心取上清，加入1-1.5倍体积的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚充分混匀重复抽提，离心取上清，依次加入1-1.5倍体积的体积比为25∶24∶1的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚∶氯仿∶异戊醇混合液、1-1.5倍体积的体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液处理，离心取上清后，加入0.1-0.2倍体积的5M NaCl和1-2倍体积的异丙醇处理析出DNA沉淀，离心弃去异丙醇，加入70-75％的乙醇洗涤沉淀，离心弃去乙醇，干燥后将沉淀加入TE缓冲液和不含DNA酶的RNase酶，35-40℃水浴处理消解去除RNA，琼脂糖凝胶电泳分析得到基因组总DNA样品。
2、16S rDNA-DGGE基因指纹图的构建：以第1步得到的基因组总DNA样品为模板，采用针对细菌16S rDNA的通用引物经聚合酶链式反应扩增得到海绵共附生细菌DNA的16S rDNA片段，将小于500bp的16S rDNA的混合片段进行变性梯度凝胶电泳，染色、拍照得到变性梯度凝胶电泳的指纹图谱。
3、海绵共附生的优势细菌组成的分子鉴定：对于每一种海绵的变性梯度凝胶电泳的指纹图谱，割胶回收条带，经无菌水多次冲洗后捣碎，加入TE缓冲液浸泡、涡旋后离心取上清作为聚合酶链式反应的模板进行再扩增，确认是回收的条带后用DNA纯化试剂盒纯化。构建重组载体后转化宿主菌，筛选、鉴定连接有外源DNA片段的阳性克隆，提取质粒DNA进行16S rDNA测序，通过对照基因库进行序列同源性比对和系统发育树分析，确定条带代表的细菌的分类地位。
4、海绵宿主特异菌的分子鉴定：通过对比不同海绵的变性梯度凝胶电泳指纹图谱的差异，找出某一海绵特有的差异性条带，采用以上相同的方法割胶回收、克隆测序、序列同源性比对和系统发育树分析，确定宿主特异菌的分类地位。
本发明采用了16S rDNA-DGGE基因指纹、克隆测序与系统发育分析技术对海绵共附生的优势细菌种群组成及宿主特异菌进行分子鉴定，克服了传统依靠分离培养的方法的不足，原位、快速地实现了海绵复杂的共附生细菌种群组成的鉴定，同时实现了传统方法很难达到的宿主特异细菌的确认。
附图说明
图1为本发明方法的技术路线流程图。
图2为本发明实施例中四种海绵的16S rDNA-DGGE基因指纹图谱。
图2中，A：细薄星芒海绵；B：皱皮软海绵；C：贪婪倔海绵；D：澳大利亚厚皮海绵。
为实现这一目的，本发明首先采用机械研磨破碎海绵组织结构，再采用溶菌酶与蛋白酶K破壁方法释放DNA，采用酚-氯仿抽提方法制备海绵共附生微生物宏基因组总DNA样品。然后以提取的DNA样品为模板，以细菌通用性引物进行16SrDNA片段的PCR(聚合酶链式反应)扩增。将得到的小于500bp的16S rDNA片段混合样品进行变性梯度凝胶电泳，染色后拍照得到海绵共附生细菌的16SrDNA-DGGE基因指纹图谱。割胶回收DNA条带，再次PCR扩增及变性梯度凝胶电泳确认条带位置，纯化后克隆、测序，对照基因库进行同源性与系统发育分析，通过一种海绵的DGGE指纹图谱上所有条带的分析对海绵共附生的优势细菌种群组成进行分子鉴定，通过找到不同海绵的DGGE指纹图谱上的差异性条带完成宿主特异细菌的分子鉴定。
本发明的方法具体包括如下步骤：1、海绵共附生微生物的基因组总DNA的提取：将海绵样品用无菌小刀切成小块，加入pH8.0-8.5的由三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸二钠配置的TE缓冲液，于置于冰块上的研钵中研磨，取研磨后的悬浮液离心弃上清，加入TE缓冲液悬浮沉淀，并加入溶菌酶混匀，35-40℃水浴处理，再加入十二烷基磺酸钠及蛋白酶K混匀于50-60℃水浴处理，离心取上清，加入1-1.5倍体积的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚充分混匀重复抽提，离心取上清，依次加入1-1.5倍体积的体积比为25∶24∶1的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚∶氯仿∶异戊醇混合液、1-1.5倍体积的体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液处理，离心取上清后，加入0.1-0.2倍体积的5M NaCl和1-2倍体积的异丙醇处理析出DNA沉淀，离心弃去异丙醇，加入70-75％的乙醇洗涤沉淀，离心弃去乙醇，干燥后将沉淀加入TE缓冲液和不含DNA酶的RNase酶，35-40℃水浴处理消解去除RNA，琼脂糖凝胶电泳分析得到基因组总DNA样品。
2、16S rDNA-DGGE基因指纹图的构建：以第1步得到的基因组总DNA样品为模板，采用针对细菌16S rDNA的通用引物经聚合酶链式反应扩增得到海绵共附生细菌DNA的16S rDNA片段，将小于500bp的16S rDNA的混合片段进行变性梯度凝胶电泳，染色、拍照得到变性梯度凝胶电泳的指纹图谱。
3、海绵共附生的优势细菌组成的分子鉴定：对于每一种海绵的变性梯度凝胶电泳的指纹图谱，割胶回收条带，经无菌水多次冲洗后捣碎，加入TE缓冲液浸泡、涡旋后离心取上清作为聚合酶链式反应的模板进行再扩增，确认是回收的条带后用DNA纯化试剂盒纯化。构建重组载体后转化宿主菌，筛选、鉴定连接有外源DNA片段的阳性克隆，提取质粒DNA进行16S rDNA测序，通过对照基因库进行序列同源性比对和系统发育树分析，确定条带代表的细菌的分类地位。
4、海绵宿主特异菌的分子鉴定：通过对比不同海绵的变性梯度凝胶电泳指纹图谱的差异，找出某一海绵特有的差异性条带，采用以上相同的方法割胶回收、克隆测序、序列同源性比对和系统发育树分析，确定宿主特异菌的分类地位。
本发明采用了16S rDNA-DGGE基因指纹、克隆测序与系统发育分析技术对海绵共附生的优势细菌种群组成及宿主特异菌进行分子鉴定，克服了传统依靠分离培养的方法的不足，原位、快速地实现了海绵复杂的共附生细菌种群组成的鉴定，同时实现了传统方法很难达到的宿主特异细菌的确认。
附图说明
图1为本发明方法的技术路线流程图。
图2为本发明实施例中四种海绵的16S rDNA-DGGE基因指纹图谱。
图2中，A：细薄星芒海绵；B：皱皮软海绵；C：贪婪倔海绵；D：澳大利亚厚皮海绵。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明方法的流程如图1所示，首先获得海绵样品，提取基因组总DNA，利用聚合酶链式反应扩增得到细菌的16S rDNA片段，进行变性梯度凝胶电泳构建指纹图谱，对于一种海绵选择所有条带，通过比较不同海绵变性梯度凝胶电泳构建指纹图谱的差异找出某一海绵具有的特异性条带，将这些条带割胶回收克隆测序，并对照基因库进行同源性比对和系统发育树分析，完成对细菌的分子鉴定，从而揭示海绵共附生的优势细菌组成和海绵宿主特异菌的分子鉴定。具体实施步骤如下：1.海绵共附生微生物的宏基因组DNA的提取(1)取海绵样品用无菌小刀切成2mm3小块，置于无菌研钵中(研钵放在冰块上)，加入TE(pH8.0：10mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)和1mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠))后研磨6-12分钟(在无菌台上操作)。10,000rpm离心弃上清。加入TE(pH8.0)悬浮沉淀。
(2)加入溶菌酶混匀(10mg/ml)，37℃水浴30min。再加入10％的SDS及10mg/ml的蛋白酶K混匀，55℃水浴30min。12,000rpm离心10min取上清，加入等体积的Tris-饱和酚充分混匀处理。13,000rpm离心10min，取上清用Tris-饱和酚重复抽提一次。将上清加入等体积的Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀。13,000rpm离心5min，取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀处理。
(3)13,000rpm离心5min，取上清，加入0.1倍体积的5M NaCl，再加入1-1.5倍体积的异丙醇，轻轻混匀，在-20℃冰箱放置30min沉淀DNA。14,000rpm离心15min，弃去异丙醇，加入500μl 70％的乙醇洗涤沉淀。13,000rpm离心10min，弃去乙醇，风干，沉淀加入30μl TE，再加入不含DNA酶的Nase酶5μl，37℃水浴10min消解RNA。1.0％的琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙锭)染色分析检测。
2.16S rDNA-DGGE基因指纹图谱的构建(1)总DNA为模板，采用引物8f(5’-GGA GAG TTT GAT CA/CT GGC T-3’)与798r(5’-CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3’)扩增海绵细菌DNA的16S rDNA片段。体系及反应条件如下：9μL 10xPCR缓冲液(50mmol/LTris-HCl(pH8.2)，18mmol/L MgCl2，500mmol/L KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚))，10pmol的引物8f及10pmol的引物798r，2μL 10mmol/L d NTP，1μL基因组DNA及2.5U Super Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μL。PCR反应程序如下：94℃预变性5min，80℃保持1min，加入Super Taq酶。接着按(94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min)25次循环，72℃延伸2min完成扩增。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB(溴化乙锭)染色观察。
(2)以获得的PCR产物为模板，采用引物P2(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)与P3(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGGGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)进行16S rDNA-V3扩增。扩增体系及反应条件如下：5μL 10xPCR缓冲液(50mmol/LTris-HCl(pH8.2)，18mmol/L MgCl2，500mmol/LKCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100)，25pmol的P3及25pmol的P2，1.75μL 10mmol/L d NTP，2μL纯的16S rDNA及2.5U Super Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μL。PCR反应程序如下：94℃预变性5min，80℃保持1min，加入SuperTaq酶。65℃退火1min；21次循环：94℃变性30S，65℃(65℃-0.5℃/循环)退火30S，72℃延伸1min；5次循环：94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min；72℃延伸3min，最后4℃保存备用。用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。
(3)在电压150V，1×TAE电泳缓冲液(20mMTris-醋酸，0.5mM EDTA，pH＝8.0)，60℃，电泳时间4.5h，在30-50％的变性剂梯度范围进行DGGE电泳。得到的凝胶用固定液(10％无水乙醇，0.5％冰乙酸)固定15min，0.2％的硝酸银染色15min，显色液(3.0％NaOH，0.5％甲醛)显色5min，用固定液终止反应。数码相机拍照得到DGGE基因指纹图谱。
3.海绵共附生的优势细菌组成的分子鉴定(1)用无菌的手术刀割下DGGE胶上含需回收的特征DNA片段的胶块，经无菌水多次冲洗后放入1.5ml离心管中，用无菌枪头将其捣碎，加入TE缓冲液浸泡过夜。第二天将已过夜浸泡的有优势性条带的1.5mlEP管用旋涡振荡器涡旋1min后，12000r/min离心5min，取上清作为PCR的模板。对回收的优势性条带进行PCR再扩增。所用引物是：P1：5’-CCT ACG GGAGGC AGC AG-3’和P2：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’，引物P1比引物P3少一个40碱基的GC夹子。扩增体系：5μl 10×PCR缓冲液(100mMTris-HCl(pH9.0)，15mM MgCl2，500mM KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100)1.25μl 20μM的P1或P3，1.25μl 20μM的P2，1.75μl d NTP，4μl离心上清及0.5μl Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μl。PCR反应程序如下：20次循环：94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min；72℃延伸3min，最后4℃保存备用。
(2)将PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳，然后回收条带用上海生工生物技术公司的UNIQ-10柱按照操作指南进行DNA纯化。回收的DNA片段采用以下条件与PUCm-T载体连接：1μl的连接缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH7.8)、10mM的MgCl2、5mM的DTT、1mM的ATP、25μg/ml的BSA)+1μl PUCm-T+7μl PCR Products+1μl T4DNA ligase，16℃下连接过夜(16-18h)。
(3)转化大肠杆菌DH5 α，涂布在LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、葡萄糖2g/L)(含氨苄青霉素)平板上，平板在使用前预先用10μl IPTG(200mg/ml，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和40μlX-gal(20mg/ml，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)涂布。
(4)采用蓝白斑筛选的方法在X-gal/IPTG平板上筛选白色的连接有外源DNA片段的重组克隆。沸水浴煮沸15min，12000r/min离心2min后取上清进行PCR扩增确认是否是阳性克隆。扩增所用引物是载体引物，序列如下：T7测序引物(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’)，M13反向引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’)，50μl体系，加入2μl模板。PCR扩增程序与16S rDNA-V3区扩增相同。
(5)取3ml培养好的阳性克隆的菌液提取质粒，加入5μl 200μg/ml的RNaseA，40℃水浴10min，以降解RNA。将提到的阳性克隆的质粒DNA用引物P2、P3(带GC夹子)进行PCR扩增，扩增产物跑DGGE，以在DGGE指纹上的位置是否与割胶回收的片段位置一致来确定克隆的片段是否为原先从DGGE胶中割下的条带。
(6)将经过位置确认的代表优势细菌的条带的阳性克隆提取的质粒送交测序公司进行16S rDNA测序。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上采用Blast软件进行序列同源性比对。使用多序列联配软件Clustal X以N-J法进行系统发育树分析，确定海绵优势细菌的分类地位。
4.海绵宿主特异菌的分子鉴定(1)将银染后得到的不同海绵的DGGE基因指纹图谱采用聚类分析软件进行指纹图带型的相似性分析，从中找出不同海绵所具有的差异性条带。
(2)采用步骤3中的割胶回收、克隆测序的方法进行海绵宿主特异性细菌的分子鉴定。具体方法与步骤3中相同。
采用本发明的技术路线对于我国南海细薄星芒海绵(A)、皱皮软海绵(B)、贪婪倔海绵(C)、澳大利亚厚皮海绵(D)四种海绵的优势细菌种群组成进行了鉴定，取得了很好的效果。图2是四种海绵共附生细菌的16S rDNA-DGGE基因指纹图谱，图中数字代表各自优势性条带，从中可以明显看出四种海绵的优势细菌组成的差异与相似性。通过割胶回收、克隆测序就可以得到相关特征菌的分类信息。例如：测序并经比对分析，图中A泳道(海细薄星芒海绵)的1-10条带细菌为α-，γ-变形菌。D泳道(澳大利亚厚皮海绵)的1-10条带为α-变形菌、放线菌、厚壁菌、拟杆菌。两海绵的共附生细菌种群组成有显著差异，具体细菌的种类也不同，具有宿主特异性。
本发明方法的流程如图1所示，首先获得海绵样品，提取基因组总DNA，利用聚合酶链式反应扩增得到细菌的16S rDNA片段，进行变性梯度凝胶电泳构建指纹图谱，对于一种海绵选择所有条带，通过比较不同海绵变性梯度凝胶电泳构建指纹图谱的差异找出某一海绵具有的特异性条带，将这些条带割胶回收克隆测序，并对照基因库进行同源性比对和系统发育树分析，完成对细菌的分子鉴定，从而揭示海绵共附生的优势细菌组成和海绵宿主特异菌的分子鉴定。具体实施步骤如下：1.海绵共附生微生物的宏基因组DNA的提取(1)取海绵样品用无菌小刀切成2mm3小块，置于无菌研钵中(研钵放在冰块上)，加入TE(pH8.0：10mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)和1mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠))后研磨6-12分钟(在无菌台上操作)。10,000rpm离心弃上清。加入TE(pH8.0)悬浮沉淀。
(2)加入溶菌酶混匀(10mg/ml)，37℃水浴30min。再加入10％的SDS及10mg/ml的蛋白酶K混匀，55℃水浴30min。12,000rpm离心10min取上清，加入等体积的Tris-饱和酚充分混匀处理。13,000rpm离心10min，取上清用Tris-饱和酚重复抽提一次。将上清加入等体积的Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀。13,000rpm离心5min，取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀处理。
(3)13,000rpm离心5min，取上清，加入0.1倍体积的5M NaCl，再加入1-1.5倍体积的异丙醇，轻轻混匀，在-20℃冰箱放置30min沉淀DNA。14,000rpm离心15min，弃去异丙醇，加入500μl 70％的乙醇洗涤沉淀。13,000rpm离心10min，弃去乙醇，风干，沉淀加入30μl TE，再加入不含DNA酶的Nase酶5μl，37℃水浴10min消解RNA。1.0％的琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙锭)染色分析检测。
2.16S rDNA-DGGE基因指纹图谱的构建(1)总DNA为模板，采用引物8f(5’-GGA GAG TTT GAT CA/CT GGC T-3’)与798r(5’-CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3’)扩增海绵细菌DNA的16S rDNA片段。体系及反应条件如下：9μL 10xPCR缓冲液(50mmol/LTris-HCl(pH8.2)，18mmol/L MgCl2，500mmol/L KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚))，10pmol的引物8f及10pmol的引物798r，2μL 10mmol/L d NTP，1μL基因组DNA及2.5U Super Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μL。PCR反应程序如下：94℃预变性5min，80℃保持1min，加入Super Taq酶。接着按(94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min)25次循环，72℃延伸2min完成扩增。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB(溴化乙锭)染色观察。
(2)以获得的PCR产物为模板，采用引物P2(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)与P3(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGGGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)进行16S rDNA-V3扩增。扩增体系及反应条件如下：5μL 10xPCR缓冲液(50mmol/LTris-HCl(pH8.2)，18mmol/L MgCl2，500mmol/LKCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100)，25pmol的P3及25pmol的P2，1.75μL 10mmol/L d NTP，2μL纯的16S rDNA及2.5U Super Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μL。PCR反应程序如下：94℃预变性5min，80℃保持1min，加入SuperTaq酶。65℃退火1min；21次循环：94℃变性30S，65℃(65℃-0.5℃/循环)退火30S，72℃延伸1min；5次循环：94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min；72℃延伸3min，最后4℃保存备用。用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。
(3)在电压150V，1×TAE电泳缓冲液(20mMTris-醋酸，0.5mM EDTA，pH＝8.0)，60℃，电泳时间4.5h，在30-50％的变性剂梯度范围进行DGGE电泳。得到的凝胶用固定液(10％无水乙醇，0.5％冰乙酸)固定15min，0.2％的硝酸银染色15min，显色液(3.0％NaOH，0.5％甲醛)显色5min，用固定液终止反应。数码相机拍照得到DGGE基因指纹图谱。
3.海绵共附生的优势细菌组成的分子鉴定(1)用无菌的手术刀割下DGGE胶上含需回收的特征DNA片段的胶块，经无菌水多次冲洗后放入1.5ml离心管中，用无菌枪头将其捣碎，加入TE缓冲液浸泡过夜。第二天将已过夜浸泡的有优势性条带的1.5mlEP管用旋涡振荡器涡旋1min后，12000r/min离心5min，取上清作为PCR的模板。对回收的优势性条带进行PCR再扩增。所用引物是：P1：5’-CCT ACG GGAGGC AGC AG-3’和P2：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’，引物P1比引物P3少一个40碱基的GC夹子。扩增体系：5μl 10×PCR缓冲液(100mMTris-HCl(pH9.0)，15mM MgCl2，500mM KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100)1.25μl 20μM的P1或P3，1.25μl 20μM的P2，1.75μl d NTP，4μl离心上清及0.5μl Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μl。PCR反应程序如下：20次循环：94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min；72℃延伸3min，最后4℃保存备用。
(2)将PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳，然后回收条带用上海生工生物技术公司的UNIQ-10柱按照操作指南进行DNA纯化。回收的DNA片段采用以下条件与PUCm-T载体连接：1μl的连接缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH7.8)、10mM的MgCl2、5mM的DTT、1mM的ATP、25μg/ml的BSA)+1μl PUCm-T+7μl PCR Products+1μl T4DNA ligase，16℃下连接过夜(16-18h)。
(3)转化大肠杆菌DH5 α，涂布在LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、葡萄糖2g/L)(含氨苄青霉素)平板上，平板在使用前预先用10μl IPTG(200mg/ml，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和40μlX-gal(20mg/ml，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)涂布。
(4)采用蓝白斑筛选的方法在X-gal/IPTG平板上筛选白色的连接有外源DNA片段的重组克隆。沸水浴煮沸15min，12000r/min离心2min后取上清进行PCR扩增确认是否是阳性克隆。扩增所用引物是载体引物，序列如下：T7测序引物(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’)，M13反向引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’)，50μl体系，加入2μl模板。PCR扩增程序与16S rDNA-V3区扩增相同。
(5)取3ml培养好的阳性克隆的菌液提取质粒，加入5μl 200μg/ml的RNaseA，40℃水浴10min，以降解RNA。将提到的阳性克隆的质粒DNA用引物P2、P3(带GC夹子)进行PCR扩增，扩增产物跑DGGE，以在DGGE指纹上的位置是否与割胶回收的片段位置一致来确定克隆的片段是否为原先从DGGE胶中割下的条带。
(6)将经过位置确认的代表优势细菌的条带的阳性克隆提取的质粒送交测序公司进行16S rDNA测序。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上采用Blast软件进行序列同源性比对。使用多序列联配软件Clustal X以N-J法进行系统发育树分析，确定海绵优势细菌的分类地位。
4.海绵宿主特异菌的分子鉴定(1)将银染后得到的不同海绵的DGGE基因指纹图谱采用聚类分析软件进行指纹图带型的相似性分析，从中找出不同海绵所具有的差异性条带。
(2)采用步骤3中的割胶回收、克隆测序的方法进行海绵宿主特异性细菌的分子鉴定。具体方法与步骤3中相同。
采用本发明的技术路线对于我国南海细薄星芒海绵(A)、皱皮软海绵(B)、贪婪倔海绵(C)、澳大利亚厚皮海绵(D)四种海绵的优势细菌种群组成进行了鉴定，取得了很好的效果。图2是四种海绵共附生细菌的16S rDNA-DGGE基因指纹图谱，图中数字代表各自优势性条带，从中可以明显看出四种海绵的优势细菌组成的差异与相似性。通过割胶回收、克隆测序就可以得到相关特征菌的分类信息。例如：测序并经比对分析，图中A泳道(海细薄星芒海绵)的1-10条带细菌为α-，γ-变形菌。D泳道(澳大利亚厚皮海绵)的1-10条带为α-变形菌、放线菌、厚壁菌、拟杆菌。两海绵的共附生细菌种群组成有显著差异，具体细菌的种类也不同，具有宿主特异性。
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