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一种高山冰缘 植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法

阅读：760发布：2020-06-16

专利汇可以提供一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法以及相关基因的鉴定和验证方法，发明人利用MS-AFLP技术并结合统计学技术，通过不同温度和不同时期的胁迫处理，对DNA甲基化的变化规律进行了系统性的分析，总结了利用ChIP-qPCR和qPCR技术对该分析过程和鉴定到的基因进行验证。本发明针对非模式植物，特别是极端生境下的植物类群的DNA甲基化研究提供了有效的参考，首次将气候环境变化与DNA甲基化修饰变化联系在一起进行系统的分析。相对于其他表观遗传学研究，药品廉价易得，成本低。所选分析软件容易操作，方法简便。并对结果进行验证，体系完整。，下面是一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，其特征在于：通过对高山冰缘植物高山离子芥两种不同低温的胁迫处理，观察抗冻性的差异，同时调查DNA甲基化的变化模式，从而发现DNA甲基化随不同冷胁迫强度和不同胁迫时间的变化规律，鉴定不同时期受DNA甲基化调控的相关基因，进行鉴定，分离和克隆，最后利用基因组ChIP-qPCR和转录本qPCR对结果进行验证；
其中所述两种不同的低温胁迫处理，是指在4℃下处理0.5小时，3小时，12小时和24小时，在﹣4℃下处理0.5小时，3小时，12小时和24小时，从正午12点整开始计算时间，同时在适宜温度下正常生长的离子芥再生苗作为对照组，同时进行取样；
包括以下步骤：
<1>冷胁迫处理
选用长势均一的离子芥再生苗，通过在4℃和﹣4℃下不同程度的冷胁迫处理，观察不同胁迫强度下的损伤程度，通过电导率和叶绿素测定进行量化；
<2>提取DNA
分别提取步骤<1>的两个处理组和一个对照组的DNA；
<3>提取RNA
分别提取步骤<1>的两个处理组和一个对照组的RNA；
<4>MS-AFLP分析
步骤<2>中各处理基因组和对照组DNA分别进行Hpa II和EcoRI 酶切过夜，酶切产物搭配特定引物进行选择性扩增，采用变性聚丙烯酰胺电泳检测扩增产物；将扩增的产物进行
1％琼脂糖电泳，切割下特异性条带回收，利用pMD18 T载体试剂盒将特异性条带连入T载体中，将测定序列在NCBI上比对，比对结果进行分析；
<5>数据分析
将扩增条带的有无赋值为0/1，建立0/1矩阵，建立基于R语言的统计工具的广义线性模型Generalized Linear Model，来评估DNA甲基化在不同的冷冻胁迫温度和每个时间点的变化程度；基于past统计工具对DNA甲基化的变化规律进行非度量多维度NMDS的多重二维分析，来分析和阐明DNA甲基化在不同冷冻胁迫温度下随时间的变化模式；基于canoco统计工具对DNA甲基化的变化规律进行主成分分析PCA，来使得DNA甲基化的分异模式可视化，发现DNA甲基化在不同低温胁迫的变化规律，最后整个结果进行随机的CHIP-qPCR和转录本qPCR的验证。
2.根据权利要求1所述的一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，其特征在于：高山植物高山离子芥的DNA提取方法为：取0.3g离子芥再生苗地上部分，加入液氮研磨，2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热，加入700μl的2% CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度占管的三分之二；置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，60min后取出；冷却2 min后，加入体积比为24：
1的氯仿和异戊醇至满管，剧烈振荡3 min，使两者混合均匀；放入离心机中10000 rpm离心
10 min，与此同时，将600μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；60 sec后，直立离心管，加入720μl的质量分数为75%乙醇及80μl 5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 μl 质量分数为75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；5分钟后，直立离心管，自然风干或用风筒吹干DNA；加入50ul 0.5×TE 含RNase的缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱15 h，使RNA消解，放置冰箱备用。
3.根据权利要求1或2所述的一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，其特征在于：建立基于R语言的统计工具的广义线性模型（Generalized Linear Model），来评估DNA甲基化在不同的冷冻胁迫温度和每个时间点的变化程度，R 语言提供了一系列广义线性建模工具，来分析各个胁迫响度和时间段的DNA变化模式的差异程度，命令：eta = beta_1 x_1 + beta_2 x_2 + ... + beta_p x_p；拟似然模型的建立命令：> nlfit <- glm(y x1 + x2 - 1, family = quasi(link=inverse, variance=~
constant), data = biochem)，进行计算分析，结果汇集成表格。
4.根据权利要求3所述的一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，其特征在于：基于past统计工具对DNA甲基化的变化规律进行非度量多维度NMDS的多重二维分析，来分析和阐明DNA甲基化在不同冷冻胁迫温度下随时间的变化模式，直接将0/
1矩阵代入软件，选择NMDC选项和选择杰卡德相似度算法分析。
5.根据权利要求1或4所述的一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，其特征在于：基于canoco统计工具对DNA甲基化的变化规律进行主成分分析PCA，来使得DNA甲基化的分异模式可视化，发现DNA甲基化在不同低温胁迫的变化规律，直接将0/1矩阵代入软件，选择PCA主成分分析，按照软件提示进行数据输入，结果可以直接成图。
6.根据权利要求5所述的一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，其特征在于：整个结果进行随机的CHIP-qPCR和转录本qPCR的验证，具体方法为：每个样品0.5g植物材料在液氮中充分研磨, 倒入有8mL提核缓冲液M1的15mL离心管中，上下颠倒混匀，在上述已混匀的每个样品中加入216μL 质量分数为37％的甲醛，使样品的最终质量浓度为1％，置于4℃冷室摇晃孵育10分钟，每个已交联的样品中加入543μL 2M的甘氨酸，使样品的最终浓度为0.125M，置于4度冷室摇晃孵育5分钟，12000转，4℃，离心10分钟，弃上清；将溶解于M3缓冲液中的细胞核，13200转，离心1分钟，去上清，每个样品用300uL核裂解和超声缓冲液吹吸混匀细胞核颗粒，细胞核裂解和超声缓冲液中1％的SDS会将细胞核膜裂解，至此染色质完全暴露，用超声打断染色质，抗原抗体结合反应，其中采用的是anti-5mC 抗体，进行染色质免疫共沉淀实验，去除非特异性沉淀后，进行解交联，纯化DNA后，对目标基因进行实时荧光定量PCR分析。
7.根据权利要求1或6所述的一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，其特征在于：其中接头：H/M-I: 5’-GATCATGAGTCCTGCTC -3’，H/M-II: 5’-CGGAGCAGGACTCATGA-3’，EcoR-I: 5’- CTCGTAGACTGCGTACG-3’， EcoR -II:5’-AATTCGTACGCAGTC-3’；预扩增引物：EcoR+A:5’-GACTGCGTACGAATTC-3，H/M+0:5’-ATCATGAGTCCTGCTCCGG-3’；引物1：E-ACC: 5’-GACTGCGTACGAATTC ACC-3’，E-AAG: 5’- GACTGCGTACGAATTC AAG-3’，E-ACT:5’-GACTGCGTACGAATTC ACT-3’，E-ACC: 5’-GACTGCGTACGAATTC ACC-3’，E-ACG:5’-GACTGCGTACGAATTC ACG-3’，E-ACG: 5’-GACTGCGTACGAATTC ACG-3’，E-AGC: 5’-GACTGCGTACGAATTC AGC-3’；引物2：H/M-TCT: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCT -3’，H/M-TCC: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCC -3’，H/M-TTC: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TTC -3’，H/M-TTA: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TTA -3’，H/M-TAC: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TAC -3’，H/M-TCAA: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCAA -3’。

说明书全文

一种高山冰缘 植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析

方法

技术领域

[0001] 本发明属于表观遗传学DNA甲基化的技术领域，具体涉及一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法。

背景技术

[0002] 高山离子芥（Chorispora Bungeana Fisch. & C.A. Mey.）是一种具有代表性的高山冰缘植物，它生长在低温的天山山脉（大约海拔3800米）上，属于十字花科。这种植物在整个的生长季中表现出极强的抗冻能力，因此它被广泛的用于冷胁迫的实验研究。可是，并没有观察到高山离子芥在冷胁迫过程中有任何的特异性的表型特征（比如，厚的角质层或者蜡质层的结构），也不像其他的高山植物垫状或者簇生，而是单个生活在流石滩的石缝中。所以，在长期的低温生存条件下，这种植物必然进化出一种适应极端环境的机制以生存和完成生活史。

[0003] 高山离子芥抗寒性的研究具有重大的现实意义和应用价值。在生长发育时，植物往往会遇到各种胁迫条件。这些非生物胁迫条件通过生理代谢反应对植物造成严重的不利影响，尤其是在生长、发育和繁殖过程中。其中低温就是一个重要的非生物胁迫，在限制农业生产方面占据主导因素。叶绿素的形成和光合作用会因此被抑制，而木本植物形成层也会被破坏。寒冷灾害同时也造成作物正常生化过程遭到破坏，包括酶的平衡和破坏细胞膜凝固。因此，了解DNA甲基化的作用将提高植物的抗寒性，也能提高作物的抗胁迫能力和产量。

[0004] DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活。

[0005] 现在对于DNA甲基化的分析技术的专利申请都集中在医学上，比如利用DNA甲基化的特异性变化对一些重大疾病的诊断和治疗（CN104178565B，CN102586425A，CN104024427A，CN105400865A），以及一些调节甲基化的药品（CN103841956B ，CN101535295，CN101889008A）。在植物学相关方面的专利技术相对较少，比如鉴定芥蓝齐口期DNA甲基化基因的方法（CN 103898212 B），利用MS-AFLP技术分析齐口期DNA甲基化水平变化，从而鉴定和分离DNA甲基化相关基因。但这个分析方法没有对整体的DNA甲基化的调控变化规律进行分析，也没有对结果进行有效的验证，我们知道PCR技术的随机性是比较大的。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对高山冰缘植物高山离子芥提供一种特别有效的极端生境（比如低温）下DNA甲基化的分析方法。

[0007] 为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，通过对高山冰缘植物高山离子芥两种不同低温的胁迫处理，观察抗冻性的差异，同时调查DNA甲基化的变化模式，从而发现DNA甲基化随不同冷胁迫强度和不同胁迫时间的变化规律，鉴定不同时期受DNA甲基化调控的相关基因，进行鉴定，分离和克隆，最后利用基因组ChIP-qPCR和转录本qPCR对结果进行验证；
其中所述两种不同的低温胁迫处理，是指在4℃下处理0.5小时，3小时，12小时和24小时，在﹣4℃下处理0.5小时，3小时，12小时和24小时，从正午12点整开始计算时间，同时在适宜温度下正常生长的离子芥再生苗作为对照组，同时进行取样；
包括以下步骤：
<1>冷胁迫处理
选用长势均一的离子芥再生苗，通过在4℃和﹣4℃下不同程度的冷胁迫处理，观察不同胁迫强度下的损伤程度，通过电导率和叶绿素测定进行量化；
<2>提取DNA
分别提取步骤<1>的两个处理组和一个对照组的DNA；
<3>提取RNA
分别提取步骤<1>的两个处理组和一个对照组的RNA；
<4>MS-AFLP分析
步骤<2>中各处理基因组和对照组DNA分别进行Hpa II和EcoRI 酶切过夜，酶切产物搭配特定引物进行选择性扩增，采用变性聚丙烯酰胺电泳检测扩增产物；将扩增的产物进行
1％琼脂糖电泳，切割下特异性条带回收，利用pMD18 T载体试剂盒将特异性条带连入T载体中，将测定序列在NCBI上比对，比对结果进行分析；
<5>数据分析
将扩增条带的有无赋值为0/1，建立0/1矩阵，建立基于R语言的统计工具的广义线性模型Generalized Linear Model，来评估DNA甲基化在不同的冷冻胁迫温度和每个时间点的变化程度；基于past统计工具对DNA甲基化的变化规律进行非度量多维度NMDS的多重二维分析，来分析和阐明DNA甲基化在不同冷冻胁迫温度下随时间的变化模式；基于Canoco统计工具对DNA甲基化的变化规律进行主成分分析PCA，来使得DNA甲基化的分异模式可视化，发现DNA甲基化在不同低温胁迫的变化规律，最后整个结果进行随机的CHIP-qPCR和转录本qPCR的验证。

[0008] 其中高山植物高山离子芥的DNA提取方法为：取0.3g离子芥再生苗地上部分，加入液氮研磨，2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热，加入700μl的2% CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度占管的三分之二；置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，60min后取出；冷却2 min后，加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇至满管，剧烈振荡3 min，使两者混合均匀；放入离心机中10000 rpm离心10 min，与此同时，将600μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； 60 sec后，直立离心管，加入720μl的质量分数为75%乙醇及80μl 5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 μl 质量分数为75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；5分钟后，直立离心管，自然风干或用风筒吹干DNA；加入50ul 0.5×TE 含RNase的缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱15 h，使RNA消解，放置冰箱备用。

[0009] 建立基于R语言的统计工具的广义线性模型（Generalized Linear Model），来评估DNA甲基化在不同的冷冻胁迫温度和每个时间点的变化程度，R 语言提供了一系列广义线性建模工具，来分析各个胁迫响度和时间段的DNA变化模式的差异程度，命令：eta = beta_1 x_1 + beta_2 x_2 + ... + beta_p x_p；拟似然模型的建立命令：> nlfit <- glm(y x1 + x2 - 1, family = quasi(link=inverse, variance=constant), data = ~biochem)，进行计算分析，结果汇集成表格。

[0010] 基于past统计工具对DNA甲基化的变化规律进行非度量多维度NMDS的多重二维分析，来分析和阐明DNA甲基化在不同冷冻胁迫温度下随时间的变化模式，直接将0/1矩阵代入软件，选择NMDC选项和选择杰卡德相似度算法分析。

[0011] 基于canoco统计工具对DNA甲基化的变化规律进行主成分分析PCA，来使得DNA甲基化的分异模式可视化，发现DNA甲基化在不同低温胁迫的变化规律，直接将0/1矩阵代入软件，选择PCA主成分分析，按照软件提示进行数据输入，结果可以直接成图。

[0012] 整个结果进行随机的CHIP-qPCR和转录本qPCR的验证，具体方法为：每个样品0.5g植物材料在液氮中充分研磨, 倒入有8mL提核缓冲液M1的15mL离心管中，上下颠倒混匀，在上述已混匀的每个样品中加入216μL 质量分数为37％的甲醛，使样品的最终质量浓度为1％，置于4℃冷室摇晃孵育10分钟，每个已交联的样品中加入543μL 2M的甘氨酸，使样品的最终浓度为0.125M，置于4度冷室摇晃孵育5分钟。12000转，4℃，离心10分钟，弃上清；将溶解于M3缓冲液中的细胞核，13200转，离心1分钟，去上清，每个样品用300uL核裂解和超声缓冲液吹吸混匀细胞核颗粒，细胞核裂解和超声缓冲液中1％的SDS会将细胞核膜裂解，至此染色质完全暴露，用超声打断染色质，抗原抗体结合反应，其中采用的是anti-5mC 抗体，进行染色质免疫共沉淀实验，去除非特异性沉淀后，进行解交联，纯化DNA后，对目标基因进行实时荧光定量PCR分析。

[0013] 将酶切产物搭配不同的引物进行选择性扩增，其中接头：H/M-I: 5’-GATCATGAGTCCTGCTC -3’，H/M-II: 5’-CGGAGCAGGACTCATGA-3’，EcoR-I: 5’- CTCGTAGACTGCGTACG-3’， EcoR -II:5’-AATTCGTACGCAGTC-3’；预扩增引物：EcoR+A:5’-GACTGCGTACGAATTC-3，H/M+0:5’-ATCATGAGTCCTGCTCCGG-3’；引物1：E-ACC: 5’-GACTGCGTACGAATTC ACC-3’，E-AAG: 5’- GACTGCGTACGAATTC AAG-3’，E-ACT:5’-GACTGCGTACGAATTC ACT-3’，E-ACC: 5’-GACTGCGTACGAATTC ACC-3’，E-ACG:5’-GACTGCGTACGAATTC ACG-3’，E-ACG: 5’-GACTGCGTACGAATTC ACG-3’，E-AGC: 5’-GACTGCGTACGAATTC AGC-3’；引物2：H/M-TCT: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCT -3’，H/M-TCC: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCC -3’，H/M-TTC: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TTC -3’，H/M-TTA:
5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TTA -3’，H/M-TAC: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TAC -3’，H/M-TCAA:
5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCAA -3’。

[0014] 研究表明，高山冰缘植物高山离子芥DNA甲基化水平随着不同的温度处理和不同的处理时期会呈现不同的变化模式。结果显示将高山离子芥冷处理30分钟，DNA甲基化修饰位点在4℃和﹣4℃部分重合，3小时完全重合，12小时部分分异，24小时完全分异。目前没有针对DNA甲基化对应冷胁迫变化规律的报道。对得到的规律进行进一步的验证，将随机抽取克隆的基因，进行基因组ChIP-qPCR和转录本qPCR的验证。根据5甲基胞嘧啶的富集情况和目标基因的转录量来进行分析，验证结果支持了DNA甲基化分析方法的可靠性。

[0015] 本发明的优点在于：本发明针对非模式植物，特别是极端生境下的植物类群的DNA甲基化研究提供了有效的参考，首次将气候环境变化与DNA甲基化修饰变化联系在一起进行系统的分析。相对于其他表观遗传学研究，药品廉价易得，成本低。所选分析软件容易操作，方法简便。并对结果进行验证，体系完整。

[0016]附图说明

[0017] 图1为本发明MS-AFLP甲基化敏感多态性分析 (EcoRI/HpaII 酶切数据)；图2为本发明非度量多维尺度（NMDC）分析DNA甲基化变化模式。

[0018] 图3为本发明主成分（PCA）分析DNA甲基化变化模式。

[0019] 图4 为本发明ChIP-qPCR和转录本qPCR对结果验证。

具体实施方式

[0020] 通过对高山冰缘植物高山离子芥两种不同低温的胁迫处理，观察抗冻性的差异，同时调查DNA甲基化的变化模式，从而发现DNA甲基化随不同冷胁迫强度和不同胁迫时间的变化规律，鉴定不同时期受DNA甲基化调控的相关基因，进行鉴定，分离和克隆。最后利用基因组ChIP-qPCR和转录本qPCR对结果进行验证。

[0021] 其中所述两种不同的低温胁迫处理，是指在4℃下处理0.5小时，3小时，12小时和24小时，在﹣4℃下处理0.5小时，3小时，12小时和24小时，从正午12点整开始计算时间，同时在适宜温度下正常生长的离子芥再生苗作为对照组，同时进行取样。

[0022] 1.长势均一的离子芥再生苗，通过不同程度的冷胁迫处理（4℃和﹣4℃），观察不同胁迫强度下的损伤程度，通过电导率和叶绿素测定进行量化。

[0023] 高山植物的DNA提取方法，取0.3g离子芥再生苗地上部分，加入液氮研磨，2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。加入700μl的2% CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，60min后取出；冷却2 min后，加入氯仿和异戊醇（体价比24：1）至满管，剧烈振荡3 min，使两者混合均匀；放入离心机中10000 rpm离心10 min，与此同时，将600μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； 60 sec后，直立离心管，加入720μl的质量分数为75%乙醇及80μl 5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 μl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；5分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；加入50ul 0.5×TE (含RNase) 缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解，放置冰箱备用。

[0024] 2．双酶切将提取的四管DNA分别进行Hap II和EcoRI 酶切过夜，将样品编号（附表1.）。

[0025] 表1.双酶切列表。

[0026] 3.PCR扩增将酶切产物搭配不同的引物进行选择性扩增。扩增体系每管为： ddH2O 18.8μl，buffer 2.5μl，DNTPs 0.5μl，Taq酶0.2μl，引物各1μl，DNA底物1μl，共计25μl。

[0027]接头： H/M-I:    5’-GATCATGAGTCCTGCTC -3’
              H/M-II:   5’-CGGAGCAGGACTCATGA-3’
              EcoR-I:   5’- CTCGTAGACTGCGTACG-3’
              EcoR-II:  5’-AATTCGTACGCAGTC-3’
预扩增引物：   EcoR+A: 5’-GACTGCGTACGAATTC-3’
              H/M+0:   5’-ATCATGAGTCCTGCTCCGG-3’
引物1：        E-ACC:    5’-GACTGCGTACGAATTC ACC-3’
              E-AAG:    5’- GACTGCGTACGAATTC AAG-3’
              E-ACT:    5’-GACTGCGTACGAATTC ACT-3’
              E-ACC:    5’-GACTGCGTACGAATTC ACC-3’
              E-ACG:    5’-GACTGCGTACGAATTC ACG-3’
              E-ACG:    5’-GACTGCGTACGAATTC ACG-3’
              E-AGC:    5’-GACTGCGTACGAATTC AGC-3’
引物2：      H/M-TCT:  5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCT -3’
              H/M-TCC:  5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCC -3’
              H/M-TTC:  5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TTC -3’
              H/M-TTA:  5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TTA -3’
              H/M-TAC:  5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TAC -3’
              H/M-TCAA: 5’-CATGAGTCCTGCTCCGG TCAA -3’
PCR扩增程序：使用降落PCR（touchdown PCR），预变性95℃ 180s，接下来程序：95℃
30s，60℃ 30s，72℃ 180s，5个循环；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 180s，5个循环；95℃ 30s，
56℃ 30s，72℃ 180s，5个循环；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 180s，5个循环；72℃ 600s，25℃停止。

[0028] 4.脂糖电泳检测扩增产物将扩增的产物按编号顺序进行1％琼脂糖电泳。对比不同处理时间同一酶切的结果，切割下特异性条带。-20℃保存。

[0029] 5.回收条带将琼脂糖凝胶电泳特异性条带切下，装入1.5ml管中，加入300μl溶胶液，放入56℃水浴锅加热10min使其完全溶解。加入150μl异丙醇，震荡混匀。将上一步所得溶液加入吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。加入700μl漂洗液WB 12000rpm离心1min，弃废液。加入500μl漂洗液，12000离心1min，弃废液。之后再离心2min，除去漂洗液。将吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位加入50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，
12000rpm离心1min。

[0030] 6.体并导入感受态6.1连接T载体
利用pMD18 T载体试剂盒将特异性条带连入T载体中，反应体系：pMD18 T载体 0.5μl，回收DNA片段 5μl，Solution I 4.5μl，20℃连接过夜。

[0031] 6.2 大肠杆菌感受态制备将DH5α以1:100接种于新鲜LB液体培养基中，LB 液体培养基配置方法：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L, NaCl 10g/L。120℃灭菌锅灭菌20min。接种好的大肠杆菌置于37℃剧烈震荡培养至OD600=0.4-0.6。将摇好的菌液倒入1.5ml管中（事先预冷），在4℃和8000rpm离心1min，弃上清，在超净台内加入0.1 mol CaCl2 200μl，轻轻用枪头将管内菌体沉淀吹起，置于冰上10min，再4℃8000rpm 离心1min，弃上清。在超净台内向管内加入CaCl2 200μl，加连接产物10μl，置于冰上30min，42℃水浴90s后迅速置于冰上5min，之后即可涂板。

[0032] 6.3涂Amp抗性平板并进行蓝白斑筛选在Amp板上滴入40μl X-gal（20mg/ml），7μl IPTG(25mg/ml)，避光涂布均匀，并放置至其完全晾干。取100μl感受态涂布于上述平板上，倒置平皿37℃培养过夜。

[0033] 6.4 菌落PCR及测序挑白色菌落，放入3mlAmp液体培养基中过夜培养，并进行菌落PCR，选部分进行测序。

[0034] 菌落PCR体系：菌液（底物）3μl，Buffer 2.5μl，Taq酶 0.2μl，引物各1μl，DNTP 0.5μl，ddH2O 16.8μl。

[0035] 菌落PCR程序同2.3 PCR程序。

[0036] 7.聚丙烯酰胺电泳检测扩增产物7.1 8％聚丙烯酰胺凝胶配置
30％聚丙烯酰胺2.66ml，ddH2O 5.27ml，5×TBE 2ml，尿素 4.2g，待完全溶解后加入
10％AP 70μl，TEMED 5μl。摇匀，立刻灌胶，插入梳子，待其完全聚合。试剂配制方法见表2。

[0037] 表2.聚丙烯酰胺凝胶配置列表7.2 DNA扩增产物处理并跑电泳
将PCR扩增的1号至8号产物以及核酸marker 置于沸水中5min，之后立即放在冰上使其变性。将变性产物加样到聚丙烯酰胺凝胶中，80V电泳5h。

[0038] 7.3 聚丙烯酰胺电泳图显色将跑完电泳的凝胶置于10％醋酸中固定1h，ddH2O 漂洗2次，每次3min。20ml ddH2O,
0.02g AgNO3,30μl甲醛染色30min。ddH2O 迅速洗涤3-4s，之后至于事先预冷的Na2CO3溶液中显色直至颜色清晰。（溶液配置方法：0.6g Na2CO3，20ml ddH2O，4℃冷却，临用前加入30μl甲醛和4μl Na2S2SO3）
8．挑取聚丙烯酰胺凝胶特异性条带
将特异性条带用小刀切出，捣碎，泡于水中过夜，使其DNA溶解后PCR扩增。

[0039] PAGE PCR体系：溶解DNA的水溶液 3μl，Buffer 2.5μl，Taq酶 0.2μl，引物各1μl，DNTP 0.5μl，ddH2O 16.8μl。

[0040] PAGE PCR扩增程序：预变性 95℃ 180s，接下来程序：95℃ 30s，52℃ 45s，72℃ 60s，3个循环；95℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 60s，5个循环；95℃ 30s，46℃ 45s，72℃ 60s，17个循环；72℃ 300s，25℃停止。

[0041] 9．比对将测定序列在NCBI上比对，对比对结果进行分析。

[0042] 10．多重统计学分析对page胶片进行扫描，清晰可见的条带设为1，肉眼不可见或模糊不清的条带设为0，将统计的条带记为数字矩阵（0/1矩阵）。根据矩阵数据广义线性模型（GLM）评估了DNA甲基化在不同的冷冻胁迫温度和每个时间点的变化程度。在分析中，首先统一0/1赋值原则：每个点重复5次实验，如果3个以上包含3个是赋值为1，这个点的变量为1，同样适用于0的赋值。
并且在计算的过程中，利用广义相似率Generalized likelihood ratio test (GLRT)作为修正。为了保证分析的正确性，相似度分析也用G test和Fisher's exact test进行再次分析。所有的分析都是由R语言来完成（版本2.15.2）。

[0043] 建立基于R语言的统计工具的广义线性模型（Generalized Linear Model），来评估DNA甲基化在不同的冷冻胁迫温度和每个时间点的变化程度。R 语言提供了一系列广义线性建模工具，来分析各个胁迫响度和时间段的DNA变化模式的差异程度。命令：eta = beta_1 x_1 + beta_2 x_2 + ... + beta_p x_p。拟似然模型的建立命令：> nlfit <- glm(y x1 + x2 - 1, family = quasi(link=inverse, variance=constant), data = ~biochem)，进行计算分析，结果汇集成表格。

[0044] 基于past统计工具对DNA甲基化的变化规律进行非度量多维度（NMDS）的多重二维分析，来分析和阐明DNA甲基化在不同冷冻胁迫温度下随时间的变化模式。直接将0/1矩阵代入软件，选择NMDC选项和选择杰卡德相似度算法分析。

[0045] 通过多维尺度法将多维空间的研究对象简化到低维空间进行定位，来分析DNA甲基化在不同冷冻胁迫温度下随时间的变化模式(4°C and -4°C for 0, 0.5, 3, 12 and 24 h)。将赋值清楚的0/1矩阵代入excel，用Past软件（版本1.91）打开保存好的文件，执行NMDS功能进行计算，所得结果带入excel或者ORIGIN软件进行作图。

[0046] 基于canoco统计工具对DNA甲基化的变化规律进行主成分分析（PCA），来使得DNA甲基化的分异模式可视化，容易发现DNA甲基化在不同低温胁迫的变化规律，直接将0/1矩阵代入软件，选择PCA（主成分分析），按照软件提示进行数据输入，结果可以直接成图。将赋值清楚的0/1矩阵代入于Canoco（版本4.5）统计工具对DNA甲基化的变化规律进行主成分分析（PCA），来使得DNA甲基化随时间变化(0.5, 3, 12 and 24 h)的分异模式可视化。 canoco软件可以直接出图。

[0047] 11．最后整个结果进行随机的CHIP-qPCR和转录本qPCR的验证。每个样品0.5g植物材料在液氮中充分研磨, 倒入有8mL提核缓冲液M1的15mL离心管中，快速上下颠倒数次混匀。在上述已混匀的每个样品中加入216μL 37％的甲醛（样品最终质量浓度为1％），置于4℃冷室缓慢摇晃孵育10分钟。每个已交联的样品中加入543μL 2M的甘氨酸（样品最终浓度为0.125M），置于4度冷室摇晃孵育5分钟。12000转，4℃，离心10分钟，弃上清。12000转离心时细胞核因为比重较大会沉淀，而其他的植物组织位于上清液中，弃上清可以得到相对纯净的细胞核。将溶解于M3缓冲液中的细胞核，13200转，离心1分钟，去上清，每个样品用300uL核裂解和超声缓冲液吹吸混匀细胞核颗粒。细胞核裂解和超声缓冲液中1％的SDS会将细胞核膜裂解，至此染色质完全暴露。用超声打断染色质。抗原抗体结合反应（采用的是anti-5mC 抗体）。进行染色质免疫共沉淀实验，去除非特异性沉淀后，在所有处理溶液中加入20μL 5M 氯化钠溶液，65℃，静置6－8小时，交联的蛋白和DNA将解交联。纯化DNA后，对目标基因进行实时荧光定量PCR分析。

[0048] 提取总RNA，对目标序列的转录情况进行实时荧光定量PCR分析，检验是否与ChIP结果吻合。

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