黑皮质素－4受体基因及其作为动物脂肪含量、体重增加和/或饲料消耗的遗传标记的用途
阅读：274发布：2021-11-07
专利汇可以提供黑皮质素－4受体基因及其作为动物脂肪含量、体重增加和/或饲料消耗的遗传标记的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了猪黑皮质素－4受体(MC4R)基因中与脂肪含量、生长速度和 饲料 消耗相关的遗传标记。另外,公开了可用于PCR测试以筛选标记存在的该基因若干区域新的序列数据。该遗传标记可用来筛选具有脂肪含量、生长速度和饲料消耗等所需特征的动物用于育种的目的。本发明还公开了利用PCR测试的 试剂 盒 。，下面是黑皮质素－4受体基因及其作为动物脂肪含量、体重增加和/或饲料消耗的遗传标记的用途专利的具体信息内容。
1.一种鉴定具有预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗的代谢特征的基因型的动 物的方法，该方法包括：
a)获得该动物的核酸样品，和
b)鉴定样品MC4R基因中的多态性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中多态性的特征在于MC4R基因PCR产物 的核苷酸678位。
3.根据权利要求1所述的方法，其中动物是猪。
4.根据权利要求2所述的方法，其中核苷酸678位的多态性与脂肪含量有关。
5.根据权利要求2所述的方法，其中核苷酸678位的鸟嘌呤与较低的摄食量有 关。
6.根据权利要求2所述的方法，其中核苷酸678位的腺嘌呤与较快的体重增加 速度有关。
7.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定多态性的步骤是采用等位基因特异性 寡核苷酸的方法。
8.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定多态性的步骤选自限制性片段长度多 态性RFLP分析、异源双链体分析、单链构象多态性SSCP分析、变性梯度凝胶电泳 DGGE、温度梯度凝胶电泳TGGE以及采用连锁的基因标记。
9.根据权利要求8所述的方法，其中鉴定多态性的步骤包括RFLP分析。
10.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括扩增MC4R基因序列的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，它还包括用限制性内切核酸酶TaqI消化扩增 的区域的步骤。
12.根据权利要求10所述的扩增的基因序列，其中用于扩增的引物选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。
13.一种用于检测MC4R基因PCR产物核苷酸678的单链寡核苷酸引物，该引 物由具有SEQ ID NO：1的4-30个毗连碱基的核苷酸序列组成。
14.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO：6代表的 核苷酸序列。
15.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO：7代表的 核苷酸序列。
16.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO：8代表的 核苷酸序列。
17.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO：9代表的 核苷酸序列。
18.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO：10代表 的核苷酸序列。
19.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO：11代表 的核苷酸序列。
20.一种鉴定动物的方法，该动物具有预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗的代 谢特征的所需基因型，该方法包括：
a)获得基因组DNA样品，
b)鉴用TaqI消化该样品，获得片段，
c)分离消化所获得的片段，和
d)鉴定MC4R基因PCR产物的碱基678位是否存在TaqI位点。
21.根据权利要求20所述的方法，该方法还包括选择具有所需基因型的动物用 于育种的步骤。
22.根据权利要求20所述的方法，其中当使用切割与TaqI有相同的识别位点 的限制性酶时，当碱基678有鸟嘌呤时，位点可通过466、225和76碱基对的片段来 鉴定，当存在腺嘌呤时，位点可通过542和225碱基对的片段来鉴定。
23.根据权利要求20所述的方法，其中鉴定步骤包括通过扩增来检测TaqI位 点。
24.一种评价动物DNA样品的试剂盒，该试剂盒包含在容器内的鉴定MC4R基 因中多态性的试剂。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中试剂是扩增MC4R基因或其片段的引 物。
26.根据权利要求24所述的试剂盒，它还包含切割MC4R基因的DNA聚合酶、 正向引物和反向引物，其中引物能扩增含有多态性位点的MC4R基因区域。
27.一种用来测定MC4R基因中多态性TaqI位点的存在的引物，其中引物包含 选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和 SEQ IDNO：11的序列。
28.一种选择具有较低脂肪含量、较快生长速度、或较低饲料消耗的所需特征的 动物的方法，该方法包括下列步骤
a)获得动物的核酸样品，
b)鉴定特征在于MC4R基因PCR产物的678位核苷酸的多态性，和
c)选出678位具有与所需特征相关的核苷酸的动物。
29.一种间接选择MC4R中多态性的方法，其中用其它DNA标记的特异性等位 基因来进行间接选择，其中其它DNA标记是靠近MC4R的连锁标记。
30.根据权利要求29所述的方法，其中连锁的标记选自S0331、BHT0433和 S0313。
31.一种鉴定动物的方法，该动物具有预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗的代 谢特征的所需基因型，该方法包括
a)通过获得感兴趣的动物品系或品种的样品，确定MC4R基因型和感兴趣特征之 间的关联性，
b)制备样品中每种动物的基因组DNA，
c)测定MC4R基因的基因型，和
d)计算MC4R基因型和该特征之间的关联性。
32.一种选择动物的方法，该动物具有预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗的代 谢特征的所需MC4R基因型，该方法包括
a)获得动物的核酸样品，
b)鉴定动物MC4R基因的基因型，和
c)选出具有与所需特征相关的基因型的那些动物。
发明领域
本发明涉及遗传评价动物的方法，该方法是测定至少一个预示脂肪含量、生长速 度和饲料消耗等一种或多种特征的遗传标记的存在。具体地说，该方法是分析预示这 些特征的黑皮质素-4受体(MC4R)基因的差异。更具体地说，该方法分析的是MC4R 基因的多态性。
发明背景
消费者对低脂肪含量肉制品的需求正在增加。科学文献中积累的证据更刺激了这 一需求，因为这些证据表明，大量消耗动物脂肪(尤其是高比例的饱和脂肪酸)会有明 显的健康危害，包括患心血管疾病的危险。与高脂肪肉类有关的其它健康问题包括： 其胆固醇含量较高，且加入了较高量的盐(加入盐是为了改善结合特性，因为盐有助 于从肉中萃取出天然的水结合性组分肌球蛋白)。而且，大量消费者发现肉制品含有 诸如磷酸盐、乳化性添加剂以及抗氧化剂等不太能接受的化学添加剂。
面对寻求更健康的肉制品的消费者，肉制品生产商不断被迫要提供更廉价和健康 的肉制品。
更廉价的制品当然来自降低生产成本。生产商对提高动物生长速度和饲料消耗很 感兴趣。降低生产成本来源于在更短时间内到达市场以及喂养动物的成本更低。这能 提高牲畜业的边际利润，和/或导致给消费者的价格降低。
通过选出具有上述特征的动物，生产商能饲养出具有这些所需特征的动物。选择 所需特征的传统方法是采用育种技术。
个别产肉动物和动物群中存在遗传差异，育种技术可利用该差异来获得具有所需 特征的动物。例如，已知中国品种具有较早到达青春期以及幼崽体格大的特点，而美 国品种具有生长速度较高和瘦的特点。因此，希望将这两种品种的最佳特征组合起来， 以改进猪肉的生产。
然而，所需特征的遗传率通常很低。例如，幼崽体格的遗传率约为10-15％。标 准的育种方法是根据表型差异来选择个体的，该技术没有充分考虑到存在的遗传差异 或复杂的基因相互作用。因此，需要有一种方法在细胞或DNA水平上选择瘦肉、生 长速度和饲料消耗的特征。该方法将提供一种从基因上评价动物的方法，从而使饲养 者能更准确地选出不仅在表型上表现出所需特征、而且表现出有利的潜在基因标准的 那些动物。目前，这在很大程度上是通过标记辅助性选择来实现的。
几个研究小组已经用限制性片段长度多态性(RFLP)分析研究了猪DNA。Jung等 人(Theor.Appl.Genet，77：271-274(1989)，纳入本文作为参考)公开了用RFLP技术 来表明两种品种的猪之间的基因差异。证实这些品种中猪白细胞抗原(SLA)I类基因有 多态性。Hoganson等人(Abstract for Annual Meeting of Midwestem Section of the American Society of Animal Science，1990年3月26-28日，纳入本文作为参考)报道了 关于中国猪主要组织相容性复合体(MHC)基因的多态性，这也得到RFLP分析的证实。 Jung等人(Animal Genetics，26：79-91(1989)，纳入本文作为参考)报道了关于某些公猪 中SLA I类基因的RFLP分析。该文作者声称，这些结果表明猪SLA/MHC I类基因 与生产和行为表现特征之间有关联。他们还声称，将来可用SLAI类限制性片段作为 基因标记来改善猪生长的行为。
跟踪具体的有利的等位基因的能力涉及一种耗时很长的新方法，该方法是鉴定主 要效应基因DNA的分子标记。标记可与具有主要效应的单个基因连锁或与具有加性 效应的多个基因连锁。DNA标记具有几个优点：基因分离容易测定而且是明确的， DNA标记是共显性的，即可以区别地鉴定出杂合的和纯合的动物。一旦建立了标记 系统，就能非常容易地作出选择决定，因为DNA标记可在收集得到单个动物幼儿的 组织或血样后随时测定。
受体基因的基因差异已被用作一种有价值的用于选择的标记系统。例如，美国专 利5,550,024和5,374,526(授予Rothschild等人)公开了在猪雌激素受体基因中的多态 性(其与较大的幼崽体格相关)，该文内容纳入本文作为参考。美国专利申请08/812,208 公开了在猪促乳素受体基因中的多态性标记，它们与较大的幼崽体格以及整体繁殖效 率有关。
从前述内容可以看出，需要一种选出具有改善的代谢特征(如脂肪含量、生长速 度和饲料消耗)的动物的方法。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种基于MC4R基因或在MC4R基因内的基因标记， 该MC4R基因预示脂肪含量、生长速度和/或饲料消耗。
本发明的另一个目的是提供一种确定该基因标记存在的测定方法。
本发明还有一个目的是提供一种评价动物的方法，该方法提高了选择和育种方法 针对所需特征的准确性。
本发明还有一个目的是提供一种PCR扩增试验，该试验将大大加速标记存在的 测定。
本发明还有一个目的是提供一个用来评价动物DNA样品中待鉴定的基因标记的 试剂盒。
在阅读了本发明下面的描述和权利要求后，这些和其它目的、特征和优点将是显 而易见的。
本发明涉及一个发现，即，黑皮质素(melanocortin)4受体(MC4R)基因中存在与 动物脂肪含量、生长速度和饲料消耗特征相关的多态性。根据本发明，MC4R多态性 与特征的联系使得特定的品种或遗传系的基因标记能被鉴定。用鉴定该多态性的TaqI 限制图谱来测定与所需代谢特征相关的标记是否存在。品种依赖型标记基因型(即在 一些品种中是标记，在其它品种中不是标记)由MC4R内的多态性组成，PCR产物678 位的鸟嘌呤变为腺嘌呤(MC4R蛋白的298位氨基酸发生从天冬氨酸密码子(GAU)到 天冬酰胺密码子(AAU)的错义突变)。本发明包括检测标记以及多态性的序列特征的试 验，还包括MC4R基因中可设计用于该试验的扩增引物的新序列。另外，本发明还 包括一种在育种程序中用该试验选择动物的方法以及进行该试验的试剂盒。
定义
本文所用的术语“低脂肪含量”或“瘦的”指体内脂肪相对于给定群体的平均值 而言在生物学上明显减少。
附图简述
图1是猪中MC4R的序列表(SEQ ID NO：1)。“X”代表多态性位点。
图2表示人(SEQ ID NO：2)和猪(SEQ ID NO：3)MC4R基因之间的DNA序列比较。
图3表示人(SEQ ID NO：4)和猪(SEQ ID NO：5)MC4R基因之间的氨基酸序列比 较。
图4a，4b和4c是CRI-MAP的MC4R的连连锁报道。
图5显示了猪MC4R基因的部分核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。氨基酸 翻译显示出密码子298位有氨基酸置换。
图6是PCR产物的TaqI消化的电泳凝胶。每个泳道顶部指出了分子标记(M)和 MC4R基因型。
图7显示了猪MC4R的推定的第7个跨膜结构域与其它MCR和GPCR的多重 序列对比。“*”代表猪MC4R的预计的序列位置。其它氨基酸序列从GenBank数据 库获得(登录号为P32245，P70596，P41983，P56451，P34974，P41968，P33033，Q01718， Q01726，Q28031，AF011466，P21554，P18089，P30680，P47211)。猪MC4R中氨基酸N 被D置换的错义变化位置用箭头标出。Asp(D)残基在MCR中是高度保守的，Asn(N) 残基在其它大多数GPCR中是高度保守的。
较佳实施方案详述
肥胖是影响能量平衡的疾病。能量代谢的控制很简单：将过多的能量储藏为脂肪 以及控制能量以免过多的能量储藏，即肥胖。尽管几个基因和信号转导系统涉及肥胖， 但是对于能量稳态机理和基因多态性的相互联系还知之甚少。现已表明，黑皮质素-4 受体(MC4R)是长期体重稳态的重要调节者。MC4R拮抗剂在长期给予期间能增加摄 食量和体重。Skuladottir，G.V，等人“新的黑皮质素4受体选择性拮抗剂的长期增食欲 效应”，British J.of Pharm.126(1)：27-34(1999)。
Lu等人(1994)通过研究黑皮质素受体对刺豚鼠肥胖综合征的拮抗性，指出它参 与控制饲料摄入和能量平衡。Huszar等人(1997)发现黑皮质素-4受体基因(MC4R)的 失活导致小鼠产生成熟期发病的肥胖综合征，并证实MC4R蛋白在调节与刺豚鼠肥 胖综合征有关的能量平衡中起主要作用。另外，MC4R蛋白调节还传递瘦小蛋白(leptin) 的作用(能量稳态中的一种重要的信号转导分子)(Seeley等人，1997)。
本发明已经确定了MC4R基因中的变化或多态性的位置，该遗传(基因)差异与脂 肪含量、生长速度和/或饲料消耗等代谢特征的表型差别有关。
在本发明的一个实施方案中，提供了一个试验来检测所需基因型的存在。该试验 包括利用引物以及标准技术(如聚合酶链反应(PCR))来扩增从血液、组织、精液或遗 传物质的其它常规来源纯化的基因组DNA，然后用限制性酶(如TaqI)消化该DNA， 从而产生长度不同的基因片段，将至少一些片段与其它片段分离(例如用电泳)。
还可这样来检测片段，使含有所有或至少部分MC4R基因cDNA序列的核苷酸 探针(例如放射性标记的cDNA探针)与分离的片段杂交，然后将杂交结果与已知具有 标记的基因序列或已知不具有标记的基因序列的试验结果比较。根据已知的和已公开 的MC4R序列来选择和使用检测MC4R序列的探针是本领域技术人员通常所知道的。 探针可以是任何与分离的消化产物杂交并能被检测的序列。
本发明的另一个实施方案提供了一种用来测定MC4R基因序列中基因标记存在 的试剂盒。该标记能预示脂肪含量、生长速度和/或饲料消耗等可遗传的特征。在一 个较佳的实施方案中，该试剂盒还包括新的PCR引物，该引物具有在多态性(位点) 任一侧的4-30个毗连的碱基，从而提供了一个扩增系统，该系统可通过PCR以及PCR 产物的TaqI消化来检测TaqI多态性。较佳的引物是SEQID NO：8和SEQ ID NO：9。
另一个实施方案包括一种育种方法，该方法是对待选的不同动物或动物胚胎的多 个基因序列进行上述类型的试验，并根据结果将某些动物选出或排除在育种程序外。
本发明公开了可用TaqI限制图谱来鉴定的MC4R基因中的多态性。如本领域中 所知道的，限制图谱并不能确切地决定片段大小，它只是近似的。对于纯合基因型(等 位基因1)，多态性可通过PCR产物TaqI消化获得的三个条带(466、225和76碱基对 (bp))来鉴定；对于另一纯合基因型(等位基因2)，可通过两个条带(542和225碱基对) 来鉴定；对于杂合基因型，可通过四个条带(542、466、225和76碱基对)来鉴定。瘦 肉型和摄食量较少的标记可通过466/225/76碱基对来鉴定，但中国猪除外，其瘦肉型 的标记为542/225条带。体重增加较快的标记可通过542/225条带来鉴定。
另外，已经在核苷酸水平上鉴定了与图谱有关的多态性。对多态序列TaqI位点 以及整个周围区域进行了测序。见SEQ ID NO：1。多态性周围的序列有助于开发PCR 试验，从紧靠多态性的序列中取出大约4-30个毗连碱基作为用于聚合酶链反应的引 物，以便在TaqI限制酶处理前大量扩增该区域。引物无需完全互补；基本上等价的 序列是可接受的。
从序列数据观察到，在等位基因2中，PCR产物678位的鸟嘌呤被腺嘌呤置换， 或MC4R蛋白的298位氨基酸从天冬氨酸密码子(GAU)变为天冬酰胺密码子(AAU)。 多态性的PCR试验采用正向引物5′-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3′(SEQ ID NO：6)和反向引物5′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQ ID NO：7)。所用的猪 特异性引物是：正向引物5′-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3′(SEQ ID NO：8)和反向 引物5′CAT TAT GAC AGT TAA GCG G-3′(SEQ ID NO：9)。得到的扩增产物约有750 碱基对，当用TaqI消化后，得到466、225和76碱基对(等位基因1)的等位基因片段， 或542和225碱基对(等位基因2)的等位基因片段。
标记可用任何本领域普通技术人员已知的鉴定标记存在与否的方法来鉴定，这些 方法例如包括单链构象多态性分析(SSCP)、RFLP分析、异源双链分析、变性梯度凝 胶电泳、和温度梯度电泳、连接酶链反应或甚至是直接对MC4R基因进行测序，并 检查TaqIRFLP识别图谱。
还可采用一种或多种附加的限制酶和/或探针和/或引物。附加的酶、构建的探针 和引物可由本领域普通技术人员通过常规实验来确定。
其它可能采用的技术包括非凝胶系统，如TaqManTM(Perkin Elmer)。在该系统中， 设计出侧接感兴趣突变并能PCR扩增该区域的寡核苷酸PCR引物。然后，设计第三 个寡核苷酸探针与一区域杂交，该区域含有不同等位基因发生变化的碱基。该探针的 5′和3′端用荧光染料标记。选择这样的染料，当它们彼此接近时，其中之一的荧光被 另一个淬灭而不能被检测到。用Taq DNA聚合酶从模板上5′端的PCR引物相对于探 针进行延伸，结果导致与退火探针5′端相连的染料通过Taq DNA聚合酶的5′核酸酶 活性而断裂。这除去了淬灭效应，使得探针3′端的染料荧光能被检测。通过以下事实 可区分不同的DNA序列：如果探针与模板分子的杂交不完全，即有某种形式的错配， 则染料不会发生断裂。因此，只有当寡核苷酸探针的核苷酸序列与待与其结合的模板 分子完全互补时，淬灭效应才会除去。反应混合物可含有两种不同的探针序列，每一 序列针对不同的可能存在的等位基因进行设计，从而使得两种等位基因能在一个反应 中被检测到。
尽管采用RFLP是检测多态性的一种方法，但是也可用本领域普通技术人员已知 的其它方法。这些方法包括通过检测形成的基因产物的差别来分析多态性基因产物并 检测多态性的方法。
尽管分离限制性片段的较佳方法是凝胶电泳，但是也可采用本领域技术人员已知 的其它方法来分离并测定限制性片段的大小。
可用其它DNA标记来间接地选择多态性。可在其它DNA标记的特异性等位基 因与已知和上述表明与特定特征有关的MC4R基因相关的DNA标记的等位基因之间 建立连锁关系。与MC4R基因连锁的已公开的PiGMaP染色体图上的标记例子包括 S0331，BHT0433和S0313。
可将适合采用本发明方法的试剂包装成合适的试剂盒。该试剂盒提供了所需的材 料，这些材料包装在合适的容器内。该试剂盒最少含有鉴定与感兴趣的特征(脂肪含 量、生长速度和饲料消耗)有关的MC4R基因中多态性的试剂。较佳的，鉴定多态性 的试剂是与MC4R基因或其片段杂交的PCR系列(一套引物、DNA聚合酶和四种三 磷酸核苷)。较佳的，试剂盒中包括PCR系列以及在至少一处切割MC4R基因的限制 酶。较佳的，该试剂盒还包含其它手段，例如用来检测或测定可检出物或提供对照的 试剂。如果需要，还可包括用于杂交、预杂交、DNA萃取、显色和相似目的的其它 试剂。
本发明的基因标记、方法和试剂盒可用于育种程序来改善动物品种、品系或群体 中的脂肪含量、生长速度和饲料消耗等特征。对与特定特征相关的所需多态性至少呈 杂合(较佳的是纯合的)的动物进行连续选择和育种，将会产生具有所需特征的品种、 品系或群体。因此该标记是选择工具。
提供下列实施例的目的是为了描述，而非限制本发明。
实施例1
黑皮质素4受体PCR-RFLP测试-MC4R基因的
TaqI多态性和基因连锁图谱
引物：
用来自人和大鼠MC4R序列的同源区(GenBank登录号分别为s77415和u67863) 设计引物。用这些引物来扩增猪MC4R基因的750bp序列。
MC4R1：5′-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3′(SEQ ID NO：6)
MC4R4：5′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQ ID NO：7)
PCR条件：
混合物1： 10X Promega缓冲液 1.0微升
25mM MgCl2 0.6微升
dNTP混合物(各为2.5mM) 0.5微升
25皮摩尔/微升MC4R1 0.1微升
25皮摩尔/微升MC4R4 0.1微升
dd无菌水 7.5微升
Taq聚合酶(5U/微升) 0.07微升
基因组DNA(12.5毫微克/微升) 1.0微升
将10微升混合物1与DNA混合在反应试管中，然后覆盖上矿物油。进行下列 PCR程序：94℃2分钟；35轮的94℃30秒，58℃1分钟，和72℃1分30秒；最 后在72℃下延伸15分钟。
在标准的1％琼脂糖凝胶上检查5微升PCR反应产物，以确认扩增成功，并清除 负对照。产物大小约为750碱基对。用下列程序进行消化。
TaqI消化反应 10微升反应物
PCR产物 5.0微升
10XTaqINE缓冲液 1.0微升
BSA(10毫克/毫升) 0.1微升
TaqI酶(20U/微升) 0.5微升
dd无菌水 3.4微升
制得缓冲液、酶、BSA和水的混合物。在每个含有DNA的反应管中加入5微升。 然后65℃培育混合物至少4小时至过夜。将加载染料与消化反应物混合，将全部体 积上样于3％琼脂糖凝胶上。等位基因1的主要条带约为466、225和76bp。等位基 因2基因型的条带为542和225bp。杂合基因型具有等位基因1和2。
结果
扩增的PCR产物约为750bp。PCR产物的序列确PCR产物是MC4R基因，在 氨基酸和DNA水平上与对应的人序列分别有97.6％和92.2％的相同性(见图2和3)。
PCR产物的TaqI消化产生了466、225和76bp的等位基因片段(等位基因1)， 或542和225bp的片段(等位基因2)。杂合的基因组具有两种等位基因。在用来通过 连锁分析描绘该基因图谱的三种三代国际参照家族中观察到孟德尔遗传。
PCR产物678位的G到A的转换所导致的等位基因1和等位基因2之间的多态 性解释了MC4R蛋白298位氨基酸从天冬氨酸密码子(GAU)到天冬酰胺(AAU)的错义 突变(见图1，SEQ ID NO：1)。
通过少数不同品种的动物的DNA样品的基因型，确定等位基因频率(表1)。发 现等位基因1在Meishan中的频率为1，而在Hampshire和Yorkshire中没有或频率很 低。等位基因1在Landrace和Chester White中的频率分别为0.5。
图2和图3描述了人和猪MC4R基因的DNA和氨基酸序列之间的差别(SEQ ID NO：2-5)。
表1
不同猪品种中等位基因1的频率 品种 动物数 等位基因1的频率 Meishan 8 1 Large White 8 0.56 Yorkshire 6 0.08 Hampshire 5 0 Landrace 4 0.5 Chester White 4 0.5 Minzu 2 1 Wild Boar 2 1
连锁分析
对国际参照家族的基因型进行两点和多点连锁分析。见图4a-4c。用CRI-MAP 程序分析数据。MC4R明显与猪染色体(SSC)1上的几个标记连锁。通过两点连锁分析， 连锁最接近的标记(重组分数，括号内是LOD评分)是S0331(0.02，21.97)、 BHT0433(0.02，21.32)和S0313(0.00，17.76)。多点连锁分析产生了标记和MC4R的最佳 图谱次序(距离为Kosambi cM)：KGF-5.8-CAPN3-2.5-MEF2A-6.1-MC4R-5.6-S0313。
用一组猪和啮齿类动物的体细胞杂交体为MC4R分配一个细胞遗传学区域。猪 特异性引物的PCR产物在克隆7、8、16、18和19中进行扩增。MC4R的位置在 SSClq22-27。
实施例2
用猪特异性引物和猪MC4R基因的基因连锁图谱
进行MC4R受体PCR-RFLP测试
猪特异性引物序列
正向引物：5′-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3′(SEQ ID NO：8)
反向引物：5′-CAT TAT GAC AGT TAA GCGG-3′(SEQ ID NO：9)
消化方法
用在10微升最终体积中的下列物质进行PCR反应。
猪基因组DNA 12.5ng
lxPCR缓冲液
MgCl2 1.5mM
dNTP 0.125mM
正向引物 0.3μM
反向引物 0.3μM
Taq DNA聚合酶(Promega) 0.35U
PCR过程包括，在Robocycler(Statagene，La Jolla，CA)中，94℃2分钟；35轮的 94℃30秒，56℃1分钟，72℃1分30秒；以及72℃15分钟。在10微升总体积中用 10U的TaqI65℃培育过夜，消化一份5.0微升PCR产物。在3％琼脂糖凝胶上对消 化产物进行电泳。
多态性的描述
PCR产物的Taq I消化产生了466、225和76bp的片段(在等位基因1中)，以及 542和225bp的片段(在等位基因2中)。杂合的基因型具有等位基因1和2的片段。
遗传方式
在三种三代欧洲PiGMaP家族中发现孟德尔遗传的常染色体分离(Archibald等 人，1995)。
等位基因频率
通过欧洲PiGMaP家族的祖代动物与ISU参照家族的不相关的动物的的基因型， 确定等位基因频率。发现等位基因1具有下列频率。
表2
不同猪品种中等位基因1的频率 品种 动物数 等位基因1的频率 Meishan 8 1 Large White 8 0.56 Yorkshire 10 0.15 Hampshire 12 0 Landrace 8 0.56 Chester White 8 0.56 Minzu 2 1 Wild Boar 2 1
染色体位置
用CRI-MAP程序(Green等人，1990)对三个PiGMaP家族的基因型进行两点和多 点连锁分析。MC4R明显与猪染色体1(SSC1)上的几个标记连锁。通过两点连锁分析， 连锁最接近的标记(重组分数，括号内是LOD评分)是S0331(0.02，21.97)、 BHT0433(0.02，21.32)和S0313(0.00，17.76)。多点连锁分析产生的MC4R相对于其它连 锁标记的最佳图谱次序如下(距离为Kosambi cM)：KGF-5.8-CAPN3-2.5-MEF2A-6.1- MC4R-5.6-S0313。
评价
黑皮质素4-受体是表达在脑中的与G-蛋白偶联的7个跨膜的受体。Huszar等人 (1997)发现MC4R基因的失活导致小鼠中的成熟期发病的肥胖综合征，并证实MC4R 蛋白在调节能量平衡中起主要作用。经图谱确定，MC4R基因位于人染色体 18q21.3(Gantz等人，1993)。MC4R基因位于SSC1的位置与以前染色体染色数据相符， 表明该染色体与HSA18和15之间的同线性(Goureau等人，1996)。然而，以前从 HSA18和15到SSC1测得的数个基因(包括CAPN3、KGF和MEF2A)的基因次序对 MC4R并不保守。因此，MC4R在SSC1中的图谱位置可能鉴定了HSA18和15相对 于SSC1之间的进化断点。
实施例3
标记与增强的代谢特征相关
在确定哪个等位基因与哪个特征相关且在哪个品种中的初步研究中，将几个动物 品系的基因型与长至110千克的天数、背部脂肪测定、每日体重增加和平均每日摄食 量关联起来。用于该研究的猪来自Pig Improvement Company(PIC)的品系。
用上述PCR测试累积MC4R基因的等位基因1和2的数据。收集的数据归纳在 下表3-8中。
根据结果，等位基因1在所有品系中明显为瘦肉型等位基因(见P2背部脂肪测 定)，除在中国猪中是脂肪型等位基因。在测试的商用品系中，等位基因2与明显较 快的增重速度(测试日增重)相关。整体等位基因1与较低的摄食量相关。
表3
观察数 MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 88 30 32 150 20 12 57 54 56 74 241 67 22 12 31 254 33 330 37
总共721 MC4R基因型： 11＝纯合等位基因1 12＝杂合 22＝纯合等位基因2
表4 观察数(雄性/雌性) MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 9/79 12/18 15/17 36/114 0/20 12 9/48 37/17 12/44 44/30 102/139 0/67 22 3/9 28/3 89/165 21/12 141/189 0/37
表5
至110kg的天数 MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 169.7 172.4 169.6 168.5 219.1 12 170.2 171.5 165.0 171.2 168.7 212.2 22 165.3 173.4 162.9 170.3 167.1 211.4 p＜.23 p＜.75 p＜.15 p＜.76 p＜.31 p＜.27
表6
P2背部脂肪(毫米) MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 10.8 11.9 9.7 11.1 22.8 12 11.3 12.5 12.2 10.5 11.8 21.5 22 12.1 12.7 12.6 10.7 12.1 20.3 p＜.10 p＜.43 p＜.34 p＜.17 p＜.006 p＜.17
表7
测试日增重(克/天) MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 882.2 811.0 881.8 871.9 688.8 12 891.2 820.5 875.6 873.0 876.3 676.2 22 969.1 819.5 906.7 906.2 906.9 692.5 p＜.01 p＜.96 p＜.05 p＜.24 p＜.006 p＜.66
表8
平均每天摄食量(千克/天)，仅仅公猪，除仅仅是小母猪的L95外 MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 2.31 1.78 1.75 1.89 2.05 12 2.11 1.90 1.97 1.90 1.96 2.03 22 2.15 1.97 2.00 1.97 2.02 2.08 p＜.84 p＜.14 p＜.56 p＜.14 p＜.16 p＜.36
实施例4
猪黑皮质素-4受体(MC4R)基因的错义变体
与脂肪、生长和摄食量特征有关
为了确定该MC4R多态性是否与表型差异有关，测试了几个不同猪品系的大量 动物个体中的突变。生长和行为测试记录的分析表明，MC4R基因型与许多品系的背 部脂肪、生长速度和摄食量显著相关。MC4R突变的不同氨基酸残基可能使MC4R 功能显著变化。这些结果证实了猪MC4R错义突变的功能意义，并提示模型物种的 基因组对比应用于农场动物与人体医学同样重要。
对在leptin和leptin受体中突变的鉴定已经提供了涉及能量平衡调节的一些遗传 成分的信息(Zhang等人，1994；Tartaglia等人，1995)。用动物模型进行基因研究有助于 鉴定肥胖的主要遗传原因(Andersson1996；Pomp1997；Giridharan，1998)。另外，已经 鉴定出其它几个参与能量稳态神经信号转导途径的基因(Flier和Maratos-Flier1998； Schwartz等人，1999)。在参与能量稳态调节的候选信号分子中，最感兴趣的是黑皮质 素-4受体(MC4R)。MC4R对于leptin信号的应答是摄食量与体重之间的关联(Seeley， 等人，1997；Marsh等人，1999)。中枢神经系统中的神经肽Y(NPY)信号也由MC4R蛋 白介导(Kask等人，1998)。MC4R中的数个突变(包括移码和无意义突变)与人显性遗 传的肥胖有关(Vaisse等人，1998；Yeo，等人，1998)。人的其它一些MC4R错义突变也 已鉴定出来(Gotoda等人，1997；Hinney等人，1999)，但是这些突变的功能意义还未确 定。
根据生长特征来选择对于养猪工业非常重要，因为成本与饲养有关，且消费者偏 好瘦肉。这些数量性状的有效的基因改进可通过使用标记辅助选择(MAS)并用高密度 基因图谱来增强(Dekkers和van Arendonk1998；Rothschild和Plastow1999)。在该方 法中，重要的工具是用熟悉的人和小鼠基因图谱来进行比较作图，它能帮助鉴定猪中 对应的控制生长和行为特征的基因组区域或主要基因。人或动物模型中复杂特征的生 物学知识为牲畜中有经济价值的特征的基因鉴定提供了其它方法。对于脂肪和生长特 征，已经成功进行了几个用表型趋异的品种和候选基因分析的数量性状基因座(QTL) 连锁扫描(Yu等人，1995；Casas-Carrillo等人，1997；Knorr等人，1997；Knott等人， 1998；Rohrer等人，1998；Wang等人，1998；Paszek等人，1999)，但对商用动物群还没 有确定对生长和行为特征有主要作用的单个基因。MC4R在摄食量和肥胖中的作用提 示，它可能是猪中生长有关的性状的重要基因标记。
材料和方法
动物。猪在正常生产条件下由美国和欧洲的nucleus农场中的PIC雇员喂养长大。 约70天大时，对猪进行行为测试，13周后停止测试。在试验的最后，用超声波实时 (B模式)在第10跟肋骨距中线2厘米处测定背部脂肪。将增加的重量除以测试天数， 计算出测试期内平均的日增重(生长)。用标准程序估计长至110千克市场重量的天数， 每一个用电子测定设备测定摄食量。
PCR扩增猪MC4R基因片段。从人和大鼠MC4R序列(GenBank登录号分别为 s77415和u67863的同源区)设计引物。引物是正向引物：5′-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3′(SEQ ID NO：6)和反向引物：5′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQ ID NO：7)。用12.5ng猪基因组DNA、1xPCR缓冲液、1.5mM MgCl2、0.125mM dNTP 0.3mM各引物、和0.35U Taq DNA聚合酶(Promega)在10微升的最终体积内进行PCI 反应。PCR的条件如下：在Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)中，94℃2分钟，35 轮的94℃30秒，56℃1分钟，92℃1分30秒，最后72℃延伸15分钟。
测序和突变检测。对不同品种的几头猪进行PCR产物测序，并比较序列以检测 任何的核苷酸变化。测序在ABI测序仪377(Applied Biosystems)上进行。猪MC4R序 列已经提交给GenBank，登录号为AF087937。序列分析揭示一个核苷酸置换位于Taq I限制酶识别位点内(Kim等人，1999)。然后设计一系列引物，以产生较小的MC4R 基因片段，该片段只含有一个有信息的TaqI限制性位点，以指定多态性位点并有助 于PCR-RFLP测试。这些引物是：正向引物5′-TAC CCT GAC CAT CTT GAT TG 3′(SEQ ID NO：10)和反向引物：5′-ATA GCA ACA GAT GAT CTC TTT G-3′(SEQ ID NO：11)。
统计学分析。方差分析的程序采用说明农场、测试期、动物性别、MC4R基因型 和部位(随机)的固定影响的混合模型。集合所有美国/欧洲品系(品系A-D)的动物用于 整个分析，在该分析中，包括原始品系。估计每个基因型的平均效应，结果列于表 9-15中。用总体F检验来测定显著性水平。
结果
猪MC4R基因中错义突变的鉴定。MC4R基因由包含在一个外显子中的大约1kb 的编码序列组成。PCR产生了猪MC4R基因片段的大约750碱基对(Kim等人，1999)。 PCR产物的序列确证PCR产物是MC4R基因，它在核苷酸和氨基酸水平上与人MC4R 序列分别有92.2％和97.6％的相同性。几个品种的单个动物的序列多重对比鉴定出有 一个核苷酸置换(G→A；图5)。多态性揭示有一个错义突变，在与人MC4R蛋白的氨 基酸298位相同的位置处，天冬氨酸(GAU)被天冬酰胺(AAU)代替。为了确认这一碱 基改变，我们设计侧接多态性位点的猪特异性引物，用TaqIPCR-RFLP凝胶分析多 态性(图6)。图6显示了用琼脂糖凝胶电泳分析得到的PCR产物的TaqI消化结果。 等位基因1产生了156和70bp的片段作为PCR-RFLP，等位基因2产生了226bp的 片段作为PCR-RFLP。杂合体具有等位基因1和2片段。分子标记(M)和MC4R基因 型标在每一泳道的顶部。
MC4R错义突变在黑皮质素受体(MCR)中高度保守的区域内。MCR是偶联G蛋 白受体(GPCR)的亚族，它含有大多数其它GPCR所共有的某些保守的结构元件，但 是MCR和其它GPCR之间的整体氨基酸相同性很低(Tatro 1996)。将猪MC4R蛋白的 预期的氨基酸序列与其它动物种类、其它MCR蛋白或典型的GPCR作多重序列对比， 结果显示第7个跨膜结构域298位的天冬氨酸在MCR蛋白中高度保守(图7)。然而， 感兴趣地注意到，大多数其它GPCR中该位置为天冬酰胺。MCR蛋白彼此间显示出 有40-80％的氨基酸相同性(Tatro 1996)，但是第二个胞质内环和第7个跨膜结构域在 MCR蛋白中是高度保守的(Gantz等人，1993)。通过在人和小鼠中的天然和实验突变 的研究(Robbins等人，1993；Valverde，等人，1995；Frandberg，等人，1998)，已经发现 MCR结构与功能之间的一些关系。这些研究表明，在高度保守区域内的一些突变导 致结构变化并改变受体的功能。Asp298Asn置换突变对受体的功能有影响。然而，这 需要进一步测试，但是已知在MC1R中的同源残基变化(Asp294His)与人的白色皮肤 以及红色头发有关(Valverde，等人，1995)。
MC4R错义突变与肥胖相关特征有关。为了研究错义突变的影响，在PIC(一家 国际养猪公司)的几个商业猪品系总共1800头猪中，分析MC4R基因型和对生长速度、 背部脂肪和饲料消耗差异的影响的关系。动物来自封闭的欧洲/美国品种的商业品系 (品系A-D)，还有来自欧洲和中国品种杂交的品系(品系E)。在品系A-D中，发现所 有行为特征均与MC4R基因型明显相关。等位基因1纯合的动物平均的背部脂肪 (P＜.001)、日增重(P＜.001)和摄食量(P＜.01)明显少于纯合的22基因型动物(表11、13 和15)。总之，具有11基因型的猪的背部脂肪比22基因型猪少大约9％(表11)，而22 基因型的猪明显比11基因型的猪生长得快(37克/天)(表13)。这些结果看来与食欲有 关，因为22基因型动物消耗的比食入的多得多(表15)。在欧洲/美国品种中，清楚地 确立了MC4R基因的错义突变与相关的行为特征之间的联系。虽然测试动物的数量 小得多，但是在相当肥胖的中国杂交系(品系E)中没有发现这些结果。令人感兴趣的 是，品系E显示出背部脂肪的趋势方向与其它品系所观察到的相反(表11)。
讨论
本研究清楚地证实，猪MC4R错义突变与猪的几个行为特征明显相关。表现为 Asp298(在其它MCR亚型和其它动物种类的MC4R中高度保守的氨基酸)的等位基因 1与较小的背部脂肪厚度、较慢的生长速度和较少的摄食量相关联，表现为Asn298 的等位基因2则与较肥的、摄食量较高且生长较快的动物相关。由于黑皮质素受体蛋 白中的高度保守的残基对于配体结合或胞内信号传递起重要的作用(Tatro 1996)， MC4R变体可能在调节食物摄入和体重中发挥功能上不同的能力。进一步验证该假设 将会为MCR功能的结构基础以及治疗人肥胖症的分子靶标提供重要的信息。
等位基因1与品系E中最胖的动物有关，该动物是Chinese Large White品种与 Meishan品系杂交获得的。如果突变引起高度保守区域中发生显著的氨基酸变化，那 么这令人惊奇。结果可能是由取样引起的。然而，如果我们假设当更多的结果加入时， 该结果是显著的，这可能有几种解释。一个可能性或许是背景基因效应(上位性)的不 同。由于生长和肥胖是复杂的多基因特征，因此很有可能中国品种具有数百年分离衍 生的某些不同的等位基因相互作用，而这些推定的相互作用可能在与相差很大的品系 之间的杂交中使多基因特征产生变化(Frankel和Schork 1996)。已经用趋异的品系对 肥胖和生长特征进行了几个QTL分析(Cases-Carrillo等人，1997；Knott等人，1998； Rohrer等人，1998；Wang等人，1998；Paszek等人，1999)，但是没有报道说QTL靠近 C4R基因座(其图谱位置在染色体1上距离连锁图谱约80cm(数据未显示))。它可能意 味着，品系E提示的MC4R等位基因的上位效应使得难以在大多数涉及中国品系和 欧洲/美洲品系间杂交的QTL实验中观察到MC4R基因座。有可能某些等位基因的效 应会在不同的背景下变化，并且难以在涉及基因趋异品种的QTL实验中检测到。
MC4R变体的效应可通过对该突变在其它猪品种和品系中引起的生物学效应的 进一步研究来解释。然而，如果MC4R变体与瘦肉、生长和摄食量有密切的关系， 则该突变可被立即用于标记辅助选择(Meuwissen和Goddard 1996)，以开发出满足特 定消费者需求的猪品系。例如，在产小猪后食欲通常减退的母猪品系中，MC4R等位 基因2的选择能帮助提高摄食量。另外，在一些认为太肥的品系中，可以利用等位基 因1的选择，在认为生长太慢的品系中可以利用等位基因2的选择。因此，在猪育种 品系中选择MC4R突变的基因型将提高选择与摄食有关的生产特征(包括生长和瘦肉) 的效率。候选基因方法也被用来调查猪leptin基因的作用(Jiang和Gibson 1999)。然而， 就leptin而言，尽管在商用品种与未改进品系之间杂交的品种中存在leptin多态性与 背部脂肪厚度相关的证据，但是在测试的不同的商用品系中却没有清楚的关联(Jiang 和Gibson 1999)。因此，不应认为由于找到了一个基因，就可以假定存在一种关系。 相反，对于MC4R，我们已经确定，在该候选基因中的变化能够解释猪商用品系中背 部脂肪、生长速度和摄食量的明显差异。MC4R的这些结果描述了在牲畜基因组中采 用候选基因的对比性基因分析的潜在价值。
MC4R基因型对猪几个生产特征的影响
表9
长至110kg的天数以及背部脂肪的观察数(雄性/雌性/总数) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 9/212/221 12/94/106 37/17/54 58/323/381 0/20/20 12 9/150/159 37/96/133 12/158/170 152/30/182 210/434/644 0/67/67 22 3/16/19 28/36/64 89/356/445 155/12/167 275/420/695 0/37/37
表10
长至110kg的天数 MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 166.3+/-0.8 168.4+/-1.4 170.0+/-2.4 167.9+/-0.9 219.1+/-4.8 12 165.6+/-0.9 166.8+/-1.1 163.9+/-1.0 170.2+/-1.8 166.9+/-0.8 212.2+/-3.4 22 162.3+/-2.3 166.8+/-1.5 161.5+/-0.8 167.0+/-1.9 164.6+/-0.9 211.4+/-4.0 p＜.24 p＜.47 p＜.007 p＜.10 p＜.001 p＜.27
表11
第10根肋骨的背部脂肪(毫米) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 10.7+/-0.2 12.1+/-0.2 9.8+/-0.5 11.1+/-0.2 22.8+/-1.2 12 11.2+/-0.2 12.5+/-0.2 12.3+/-0.2 10.5+/-0.4 11.6+/-0.2 21.5+/-0.9 22 12.5+/-0.5 12.6+/-0.3 12.7+/-0.2 10.9+/-0.4 12.0+/-0.2 20.3+/-1.0 p＜0.2 p＜.31 p＜.06 p＜.05 p＜.00l p＜.17
表12
测试日增重的观察数(雄性/雌性/总数) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 9/105/114 12/38/50 37/17/54 58/160/218 0/20/20 12 9/65/74 37/35/72 12/97/109 152/30/182 210/227/437 0/67/61 22 3/13/15 28/15/43 89/225/314 155/12/167 275/265/539 0/37/37
表13
测试日增重(克/天) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 892.6+/-l0.4 841.7+/-13.8 882.2+/-18.4 871.9+/-10.2 688.8+/-24.5 12 913.3+/-11.6 868.4+/-12.1 882.2+/-12.9 883.7+/-14.3 885.1+/-8.9 676.2+/-17.6 22 982.8+/-22.8 862.4+/-15.1 913.4+/-10.5 904.6+/-15.1 908.8+/-9.3 692.5+/-20.4 p＜.001 p＜.28 p＜.006 p＜.20 p＜.001 p＜.66
表14
平均日摄食量的观察数(雄性/雌性/总数) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 7/0/7 11/0/11 13/0/13 31/0/31 0/18/18 12 8/0/8 31/0/31 9/0/9 34/0/34 82/0/82 0/63/63 22 3/0/3 25/0/25 74/0/74 16/0/16 118/0/118 0/32/32
表15
平均日摄食量(千克/天)，仅仅是公猪，除品系E仅为小母猪外 MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 2.31+/-0.2 1.78+/-0.09 1.75+/-0.06 1.94+/-0.07 2.05+/-0.10 12 2.11+/-0.3 1.90+/-0.07 1.97+/-0.10 1.90+/-0.07 2.03+/-0.06 2.03+/-0.07 22 2.15+/-0.4 1.97+/-0.06 2.00+/-0.07 1.97+/-0.08 2.11+/-0.06 2.08+/-0.08 p＜.84 p＜.14 p＜.56 p＜.14 p＜.01 p＜.36
在参照特定组成、效果理论等描述了本发明后，本领域技术人员显然能明了，本 发明并不局限于这些描述性的实施方案或机理，可不脱离所附权利要求所定义的本发 明范围或精神进行改动。预计所有这些明显的改动和变化均包括在所附权利要求的本 发明范围内。权利要求意味着覆盖了所要求的组分以及能有效满足其目的的任何次序 的步骤，除非本文有相反的具体内容。
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相关申请交叉文献
本申请要求了1998年7月27日提交的美国临时申请No.60/094,287和1999年1 月15日提交的美国临时申请No.60/116,186的优先权，这些文献的公开内容纳入本文 作为参考。
补助金参考条款
本发明至少部分得到美国农业部通过衣阿华农业和家庭经济实验站(IaHees)以及 IOW03148项目(Hatch Funds)拨款的支持。美国政府在本发明中享有一定的权利。
序列表 <110>衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司 <120>黑皮质素-4受体基因及其作为动物脂肪含量、体重增加和/或饲料消耗的遗传标记的用途 <130>rothshcild mc4r2 <140>PCT/US99/16862 <141>1999-07-26 <150>60/094，287 <151>1998-07-27 <150>60/116，196 <151>1999-01-15 <160>26 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>745 <212>DNA <213>猪 <220> <221>差异 <222>(678) <223>G/A <400>1 acaagaatct gcattcaccc atgtactttt tcatctgtag cctggctgtg gctgatatgc 60 tggtgagcgt ttccaatggg tcagaaacca ttgtcatcac cctattaaac agcacggaca 120 cggacgcaca gagtttcaca gtgaatattg ataatgtcat tgactcagtg atctgtagct 180 ccttactcgc ctcaatttgc agcctgcttt cgattgcagt ggacaggtat tttactatct 240 tttatgctct ccagtaccat aacattatga cagttaagcg ggttggaatc atcatcagtt 300 gtatctgggc agtctgcacg gtgtcgggtg ttttgttcat catttactca gatagcagtg 360 ctgttattat ctgcctcata accgtgttct tcaccatgct ggctctcatg gcttctctct 420 atgtccacat gttcctcatg gccagactcc acattaagag gatcgccgtc ctcccaggca 480 ctggcaccat ccgccaaggt gccaacatga agggggcaat taccctgacc atcttgattg 540 gggtctttgt ggtctgctgg gcccccttct tcctccactt aatattctat atctcctgcc 600 cccagaatcc atactgtgtg tgcttcatgt ctcactttaa tttgtatctc atcctgatca 660 tgtgtaattc catcatcgat cccctgattt atgcactccg gagccaagaa ctgaggaaaa 720 ccttcaaaga gatcatctgt tgctat 746 <210>2 <211>840 <212>DNA <213>智人 <400>2 atatcttagt gattgtggca atagccaaga acaagaatct gcattcaccc atgtactttt 60 tcatctgcag cttggctgtg gctgatatgc tggtgagcgt ttcaaatgga tcagaaacca 120 ttatcatcac cctattaaac agtacagata cggatgcaca gagtttcaca gtgaatattg 180 ataatgtcat tgactcggtg atctgtagct ccttgcttgc atccatttgc agcctgcttt 240 caattgcagt ggacaggtac tttactatct tctatgctct ccagtaccat aacattatga 300 cagttaagcg ggttgggatc agcataagtt gtatctgggc agcttgcacg gtttcaggca 360 ttttgttcat catttactca gatagtagtg ctgtcatcat ctgcctcatc accatgttct 420 tcaccatgct ggctctcatg gcttctctct atgtccacat gttcctgatg gccaggcttc 480 acattaagag gattgctgtc ctccccggca ctggtgccat ccgccaaggt gccaatatga 540 agggagcgat taccttgacc atcctgattg gcgtctttgt tgtctgctgg gccccattct 600 tcctccactt aatattctac atctcttgtc ctcagaatcc atattgtgtg tgcttcatgt 660 ctcactttaa cttgtatctc atactgatca tgtgtaattc aatcatcgat cctctgattt 720 atgcactccg gagtcaagaa ctgaggaaaa ccttcaaaga gatcatctgt tgctatcccc 780 tgggaggcct ttgtgacttg tctagcagat attaaatggg gacagagcac gcaatatagg 840 <210>3 <211>311 <212>蛋白质 <213>智人 <400>3 Gln Leu Phe Val Ser Pro Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Val Ile Ser 1 5 10 15 Leu Leu Glu Asn Ile Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Lys Asn Lys Asn
20 25 30 Leu His Ser Pro Met Tyr Phe Phe Ile Cys Ser Leu Ala Val Ala Asp
35 40 45 Met Leu Val Ser Val Ser Asn Gly Ser Glu Thr Ile Ile Ile Thr Leu
50 55 60 Leu Asn Ser Thr Asp Thr Asp Ala Gln Ser Phe Thr Val Asn Ile Asp 65 70 75 80 Asn Val Ile Asp Ser Val Ile Cys Ser Ser Leu Leu Ala Ser Ile Cys
85 90 95 Ser Leu Leu Ser Ile Ala Val Asp Arg Tyr Phe Thr Ile Phe Tyr Ala
100 105 110 Leu Gln Tyr His Asn Ile Met Thr Val Lys Arg Val Gly Ile Ser Ile
115 120 125 Ser Cys Ile Trp Ala Ala Cys Thr Val Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile
130 135 140 Tyr Ser Asp Ser Ser Ala Val Ile Ile Cys Leu Ile Thr Met Phe Phe 145 150 155 160 Thr Met Leu Ala Leu Met Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe Leu Met
165 170 175 Ala Arg Leu His Ile Lys Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr Gly Ala
180 185 190 Ile Arg Gln Gly Ala Asn Met Lys Gly Ala Ile Thr Leu Thr Ile Leu
195 200 205 Ile Gly Val Phe Val ValCys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His Leu Ile
210 215 220 Phe Tyr Ile Ser Cys Pro Gln Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe Met Ser 225 230 235 240 His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile Ile Asp
245 250 255 Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Arg Lys Thr Phe Lys
260 265 270 Glu Ile Ile Cys Cys Tyr Pro Leu Gly Gly Leu Cys Asp Leu Ser Ser
275 280 285 Arg Tyr Ala Pro Pro Glu Asn Asp Ile Xaa Val Ile Cys Asn Phe Ile
290 295 300 Asp Glu Asn Thr Ile Ala Leu 305 310 <210>4 <211>248 <212>蛋白质 <213>猪 <400>4 Lys Asn Leu His Ser Pro Met Tyr Phe Phe Ile Cys Ser Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala Asp Met Leu Val Ser Val Ser Asn Gly Ser Glu Thr Ile Val Ile
20 25 30 Thr Leu Leu Asn Ser Thr Asp Thr Asp Ala Gln Ser Phe Thr Val Asn
35 40 45 Ile Asp Asn Val Ile Asp Ser Val Ile Cys Ser Ser Leu Leu Ala Ser
50 55 60 Ile Cys Ser Leu Leu Ser Ile Ala Val Asp Arg Tyr Phe Thr Ile Phe 65 70 75 80 Tyr Ala Leu Gln Tyr His Asn Ile Met Thr Val Lys Arg Val Gly Ile
85 90 95 Ile Ile Ser Cys Ile Trp Ala Val Cys Thr Val Ser Gly Val Leu Phe
100 105 110 Ile Ile Tyr Ser Asp Ser Ser Ala Val Ile Ile Cys Leu Ile Thr Val
115 120 125 Phe Phe Thr Met Leu Ala Leu Met Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe
130 135 140 Leu Met Ala Arg Leu His Ile Lys Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr 145 150 155 160 Gly Thr Ile Arg Gln 6ly Ala Asn Met Lys 6ly Ala Ile Thr Leu Thr
165 170 175 Ile Leu Ile Gly Val Phe Val Val Cys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His
180 185 190 Leu Ile Phe Tyr Ile Ser Cys Pro Gln Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe
195 200 205 Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile
210 215 220 Ile Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Arg Lys Thr 225 230 235 240 Phe Lys Glu Ile Ile Cys Cys Tyr
245 <210>5 <211>20 <212>DNA <213>猪 <400>5 tggcaatagc caagaacaag 20 <210>6 <211>20 <212>DNA <213>猪 <400>6 caggggatag caacagatga 20 <210>7 <211>18 <212>DNA <213>猪 <400>7 ttaagtggag gaagaagg 18 <210>8 <211>19 <212>DNA <213>猪 <400>8 cattatgaca gttaagcgg 19 <210>9 <211>20 <212>DNA <213>猪 <400>9 taccctgacc atcttgattg 20 <210>10 <211>22 <212>DNA <213>猪 <400>10 atagcaacag atgatctctt tg 22 <210>11 <211>24 <212>蛋白质 <213>猪 <400>1l Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu
20 <210>12 <211>24 <212>蛋白质 <213>智人 <400>12 Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu
20 <210>13 <211>24 <212>蛋白质 <213>大鼠 <400>13 Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ala Val 1 5 10 15 Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu
20 <210>14 <211>23 <212>蛋白质 <213>智人 <400>14 Met Ser His Phe Asn Met Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val 1 5 10 15 Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala
20 <210>15 <211>23 <212>蛋白质 <213>哺乳动物 <400>15 Met Ser His Phe Asn Met Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val 1 5 10 15 Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala
20 <210>16 <211>24 <212>蛋白质 <213>智人 <400>16 Met Ser Leu Phe Gln Val Asn Gly Val Leu Ile Met Cys Asn Ala Ile 1 5 10 15 Ile Asp Pro Phe Ile Tyr Ala Leu
20 <210>17 <211>22 <212>蛋白质 <213>牛腺病毒1类 <400>17 Ala His Phe Asn Thr Tyr Leu Val Leu Ile Met Cys Asn Ser Val Ile 1 5 10 15 Asp Pro Leu Ile Tyr Ala
20 <210>18 <211>22 <212>蛋白质 <213>智人 <400>18 Ala His Phe Asn Thr Tyr Leu Val Leu Ile Met Cys Asn Ser Val Ile 1 5 10 15 Asp Pro Leu Ile Tyr Ala
20 <210>19 <211>23 <212>蛋白质 <213>智人 <400>19 Met Ser His Phe Asn Met Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val 1 5 10 15 Met Asp Pro Leu Ile Tyr Ala
20 <210>20 <211>22 <212>蛋白质 <213>智人 <400>20 Ser Tyr Phe Asn Leu Phe Leu Ile Leu Ile Ile Cys Asn Ser Val Val 1 5 10 15 Asp Pro Leu Ile Tyr Ala
20 <210>21 <211>25 <212>蛋白质 <213>牛腺病毒1类 <400>21 Leu Ala Tyr Glu Lys Phe Phe Leu Leu Leu Ala Glu Phe Asn Ser Ala 1 5 10 15 Met Asn Pro Ile Ile Tyr Ser Tyr Arg
20 25 <210>22 <211>19 <212>蛋白质 <213>智人 <400>22 Phe Leu Leu Leu Ala Glu Ala Asn Ser Leu Val Asn Ala Ala Val Tyr 1 5 10 15 Ser Cys Arg <210>23 <211>22 <212>蛋白质 <213>智人 <400>23 Val Phe Ala Phe Cys Ser Met Leu Cys Leu Leu Asn Ser Thr Val Asn 1 5 10 15 Pro Leu Ile Tyr Ala Leu
20 <210>24 <211>21 <212>蛋白质 <213>智人 <400>24 Phe Gln Phe Phe Phe Trp Ile Gly Tyr Cys Asn Ser Ser Leu Asn Pro 1 5 10 15 Val Ile Tyr Thr Ile
20 <210>25 <211>22 <212>蛋白质 <213>大鼠 <400>25 Phe Asp Phe Val Val Ile Leu Thr Tyr Ala Asn Ser Cys Ala Asn Pro 1 5 10 15 Ile Leu Tyr Ala Phe Leu
20 <210>26 <211>16 <212>蛋白质 <213>智人 <400>26 Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Val Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Leu 1 5 10 15
面对寻求更健康的肉制品的消费者，肉制品生产商不断被迫要提供更廉价和健康 的肉制品。
更廉价的制品当然来自降低生产成本。生产商对提高动物生长速度和饲料消耗很 感兴趣。降低生产成本来源于在更短时间内到达市场以及喂养动物的成本更低。这能 提高牲畜业的边际利润，和/或导致给消费者的价格降低。
通过选出具有上述特征的动物，生产商能饲养出具有这些所需特征的动物。选择 所需特征的传统方法是采用育种技术。
个别产肉动物和动物群中存在遗传差异，育种技术可利用该差异来获得具有所需 特征的动物。例如，已知中国品种具有较早到达青春期以及幼崽体格大的特点，而美 国品种具有生长速度较高和瘦的特点。因此，希望将这两种品种的最佳特征组合起来， 以改进猪肉的生产。
然而，所需特征的遗传率通常很低。例如，幼崽体格的遗传率约为10-15％。标 准的育种方法是根据表型差异来选择个体的，该技术没有充分考虑到存在的遗传差异 或复杂的基因相互作用。因此，需要有一种方法在细胞或DNA水平上选择瘦肉、生 长速度和饲料消耗的特征。该方法将提供一种从基因上评价动物的方法，从而使饲养 者能更准确地选出不仅在表型上表现出所需特征、而且表现出有利的潜在基因标准的 那些动物。目前，这在很大程度上是通过标记辅助性选择来实现的。
几个研究小组已经用限制性片段长度多态性(RFLP)分析研究了猪DNA。Jung等 人(Theor.Appl.Genet，77：271-274(1989)，纳入本文作为参考)公开了用RFLP技术 来表明两种品种的猪之间的基因差异。证实这些品种中猪白细胞抗原(SLA)I类基因有 多态性。Hoganson等人(Abstract for Annual Meeting of Midwestem Section of the American Society of Animal Science，1990年3月26-28日，纳入本文作为参考)报道了 关于中国猪主要组织相容性复合体(MHC)基因的多态性，这也得到RFLP分析的证实。 Jung等人(Animal Genetics，26：79-91(1989)，纳入本文作为参考)报道了关于某些公猪 中SLA I类基因的RFLP分析。该文作者声称，这些结果表明猪SLA/MHC I类基因 与生产和行为表现特征之间有关联。他们还声称，将来可用SLAI类限制性片段作为 基因标记来改善猪生长的行为。
跟踪具体的有利的等位基因的能力涉及一种耗时很长的新方法，该方法是鉴定主 要效应基因DNA的分子标记。标记可与具有主要效应的单个基因连锁或与具有加性 效应的多个基因连锁。DNA标记具有几个优点：基因分离容易测定而且是明确的， DNA标记是共显性的，即可以区别地鉴定出杂合的和纯合的动物。一旦建立了标记 系统，就能非常容易地作出选择决定，因为DNA标记可在收集得到单个动物幼儿的 组织或血样后随时测定。
受体基因的基因差异已被用作一种有价值的用于选择的标记系统。例如，美国专 利5,550,024和5,374,526(授予Rothschild等人)公开了在猪雌激素受体基因中的多态 性(其与较大的幼崽体格相关)，该文内容纳入本文作为参考。美国专利申请08/812,208 公开了在猪促乳素受体基因中的多态性标记，它们与较大的幼崽体格以及整体繁殖效 率有关。
从前述内容可以看出，需要一种选出具有改善的代谢特征(如脂肪含量、生长速 度和饲料消耗)的动物的方法。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种基于MC4R基因或在MC4R基因内的基因标记， 该MC4R基因预示脂肪含量、生长速度和/或饲料消耗。
本发明的另一个目的是提供一种确定该基因标记存在的测定方法。
本发明还有一个目的是提供一种评价动物的方法，该方法提高了选择和育种方法 针对所需特征的准确性。
本发明还有一个目的是提供一种PCR扩增试验，该试验将大大加速标记存在的 测定。
本发明还有一个目的是提供一个用来评价动物DNA样品中待鉴定的基因标记的 试剂盒。
在阅读了本发明下面的描述和权利要求后，这些和其它目的、特征和优点将是显 而易见的。
本发明涉及一个发现，即，黑皮质素(melanocortin)4受体(MC4R)基因中存在与 动物脂肪含量、生长速度和饲料消耗特征相关的多态性。根据本发明，MC4R多态性 与特征的联系使得特定的品种或遗传系的基因标记能被鉴定。用鉴定该多态性的TaqI 限制图谱来测定与所需代谢特征相关的标记是否存在。品种依赖型标记基因型(即在 一些品种中是标记，在其它品种中不是标记)由MC4R内的多态性组成，PCR产物678 位的鸟嘌呤变为腺嘌呤(MC4R蛋白的298位氨基酸发生从天冬氨酸密码子(GAU)到 天冬酰胺密码子(AAU)的错义突变)。本发明包括检测标记以及多态性的序列特征的试 验，还包括MC4R基因中可设计用于该试验的扩增引物的新序列。另外，本发明还 包括一种在育种程序中用该试验选择动物的方法以及进行该试验的试剂盒。
定义
本文所用的术语“低脂肪含量”或“瘦的”指体内脂肪相对于给定群体的平均值 而言在生物学上明显减少。
附图简述
图1是猪中MC4R的序列表(SEQ ID NO：1)。“X”代表多态性位点。
图2表示人(SEQ ID NO：2)和猪(SEQ ID NO：3)MC4R基因之间的DNA序列比较。
图3表示人(SEQ ID NO：4)和猪(SEQ ID NO：5)MC4R基因之间的氨基酸序列比 较。
图4a，4b和4c是CRI-MAP的MC4R的连连锁报道。
图5显示了猪MC4R基因的部分核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。氨基酸 翻译显示出密码子298位有氨基酸置换。
图6是PCR产物的TaqI消化的电泳凝胶。每个泳道顶部指出了分子标记(M)和 MC4R基因型。
图7显示了猪MC4R的推定的第7个跨膜结构域与其它MCR和GPCR的多重 序列对比。“*”代表猪MC4R的预计的序列位置。其它氨基酸序列从GenBank数据 库获得(登录号为P32245，P70596，P41983，P56451，P34974，P41968，P33033，Q01718， Q01726，Q28031，AF011466，P21554，P18089，P30680，P47211)。猪MC4R中氨基酸N 被D置换的错义变化位置用箭头标出。Asp(D)残基在MCR中是高度保守的，Asn(N) 残基在其它大多数GPCR中是高度保守的。
较佳实施方案详述
肥胖是影响能量平衡的疾病。能量代谢的控制很简单：将过多的能量储藏为脂肪 以及控制能量以免过多的能量储藏，即肥胖。尽管几个基因和信号转导系统涉及肥胖， 但是对于能量稳态机理和基因多态性的相互联系还知之甚少。现已表明，黑皮质素-4 受体(MC4R)是长期体重稳态的重要调节者。MC4R拮抗剂在长期给予期间能增加摄 食量和体重。Skuladottir，G.V，等人“新的黑皮质素4受体选择性拮抗剂的长期增食欲 效应”，British J.of Pharm.126(1)：27-34(1999)。
Lu等人(1994)通过研究黑皮质素受体对刺豚鼠肥胖综合征的拮抗性，指出它参 与控制饲料摄入和能量平衡。Huszar等人(1997)发现黑皮质素-4受体基因(MC4R)的 失活导致小鼠产生成熟期发病的肥胖综合征，并证实MC4R蛋白在调节与刺豚鼠肥 胖综合征有关的能量平衡中起主要作用。另外，MC4R蛋白调节还传递瘦小蛋白(leptin) 的作用(能量稳态中的一种重要的信号转导分子)(Seeley等人，1997)。
本发明已经确定了MC4R基因中的变化或多态性的位置，该遗传(基因)差异与脂 肪含量、生长速度和/或饲料消耗等代谢特征的表型差别有关。
在本发明的一个实施方案中，提供了一个试验来检测所需基因型的存在。该试验 包括利用引物以及标准技术(如聚合酶链反应(PCR))来扩增从血液、组织、精液或遗 传物质的其它常规来源纯化的基因组DNA，然后用限制性酶(如TaqI)消化该DNA， 从而产生长度不同的基因片段，将至少一些片段与其它片段分离(例如用电泳)。
还可这样来检测片段，使含有所有或至少部分MC4R基因cDNA序列的核苷酸 探针(例如放射性标记的cDNA探针)与分离的片段杂交，然后将杂交结果与已知具有 标记的基因序列或已知不具有标记的基因序列的试验结果比较。根据已知的和已公开 的MC4R序列来选择和使用检测MC4R序列的探针是本领域技术人员通常所知道的。 探针可以是任何与分离的消化产物杂交并能被检测的序列。
本发明的另一个实施方案提供了一种用来测定MC4R基因序列中基因标记存在 的试剂盒。该标记能预示脂肪含量、生长速度和/或饲料消耗等可遗传的特征。在一 个较佳的实施方案中，该试剂盒还包括新的PCR引物，该引物具有在多态性(位点) 任一侧的4-30个毗连的碱基，从而提供了一个扩增系统，该系统可通过PCR以及PCR 产物的TaqI消化来检测TaqI多态性。较佳的引物是SEQID NO：8和SEQ ID NO：9。
另一个实施方案包括一种育种方法，该方法是对待选的不同动物或动物胚胎的多 个基因序列进行上述类型的试验，并根据结果将某些动物选出或排除在育种程序外。
本发明公开了可用TaqI限制图谱来鉴定的MC4R基因中的多态性。如本领域中 所知道的，限制图谱并不能确切地决定片段大小，它只是近似的。对于纯合基因型(等 位基因1)，多态性可通过PCR产物TaqI消化获得的三个条带(466、225和76碱基对 (bp))来鉴定；对于另一纯合基因型(等位基因2)，可通过两个条带(542和225碱基对) 来鉴定；对于杂合基因型，可通过四个条带(542、466、225和76碱基对)来鉴定。瘦 肉型和摄食量较少的标记可通过466/225/76碱基对来鉴定，但中国猪除外，其瘦肉型 的标记为542/225条带。体重增加较快的标记可通过542/225条带来鉴定。
另外，已经在核苷酸水平上鉴定了与图谱有关的多态性。对多态序列TaqI位点 以及整个周围区域进行了测序。见SEQ ID NO：1。多态性周围的序列有助于开发PCR 试验，从紧靠多态性的序列中取出大约4-30个毗连碱基作为用于聚合酶链反应的引 物，以便在TaqI限制酶处理前大量扩增该区域。引物无需完全互补；基本上等价的 序列是可接受的。
从序列数据观察到，在等位基因2中，PCR产物678位的鸟嘌呤被腺嘌呤置换， 或MC4R蛋白的298位氨基酸从天冬氨酸密码子(GAU)变为天冬酰胺密码子(AAU)。 多态性的PCR试验采用正向引物5′-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3′(SEQ ID NO：6)和反向引物5′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQ ID NO：7)。所用的猪 特异性引物是：正向引物5′-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3′(SEQ ID NO：8)和反向 引物5′CAT TAT GAC AGT TAA GCG G-3′(SEQ ID NO：9)。得到的扩增产物约有750 碱基对，当用TaqI消化后，得到466、225和76碱基对(等位基因1)的等位基因片段， 或542和225碱基对(等位基因2)的等位基因片段。
标记可用任何本领域普通技术人员已知的鉴定标记存在与否的方法来鉴定，这些 方法例如包括单链构象多态性分析(SSCP)、RFLP分析、异源双链分析、变性梯度凝 胶电泳、和温度梯度电泳、连接酶链反应或甚至是直接对MC4R基因进行测序，并 检查TaqIRFLP识别图谱。
还可采用一种或多种附加的限制酶和/或探针和/或引物。附加的酶、构建的探针 和引物可由本领域普通技术人员通过常规实验来确定。
其它可能采用的技术包括非凝胶系统，如TaqManTM(Perkin Elmer)。在该系统中， 设计出侧接感兴趣突变并能PCR扩增该区域的寡核苷酸PCR引物。然后，设计第三 个寡核苷酸探针与一区域杂交，该区域含有不同等位基因发生变化的碱基。该探针的 5′和3′端用荧光染料标记。选择这样的染料，当它们彼此接近时，其中之一的荧光被 另一个淬灭而不能被检测到。用Taq DNA聚合酶从模板上5′端的PCR引物相对于探 针进行延伸，结果导致与退火探针5′端相连的染料通过Taq DNA聚合酶的5′核酸酶 活性而断裂。这除去了淬灭效应，使得探针3′端的染料荧光能被检测。通过以下事实 可区分不同的DNA序列：如果探针与模板分子的杂交不完全，即有某种形式的错配， 则染料不会发生断裂。因此，只有当寡核苷酸探针的核苷酸序列与待与其结合的模板 分子完全互补时，淬灭效应才会除去。反应混合物可含有两种不同的探针序列，每一 序列针对不同的可能存在的等位基因进行设计，从而使得两种等位基因能在一个反应 中被检测到。
尽管采用RFLP是检测多态性的一种方法，但是也可用本领域普通技术人员已知 的其它方法。这些方法包括通过检测形成的基因产物的差别来分析多态性基因产物并 检测多态性的方法。
尽管分离限制性片段的较佳方法是凝胶电泳，但是也可采用本领域技术人员已知 的其它方法来分离并测定限制性片段的大小。
可用其它DNA标记来间接地选择多态性。可在其它DNA标记的特异性等位基 因与已知和上述表明与特定特征有关的MC4R基因相关的DNA标记的等位基因之间 建立连锁关系。与MC4R基因连锁的已公开的PiGMaP染色体图上的标记例子包括 S0331，BHT0433和S0313。
可将适合采用本发明方法的试剂包装成合适的试剂盒。该试剂盒提供了所需的材 料，这些材料包装在合适的容器内。该试剂盒最少含有鉴定与感兴趣的特征(脂肪含 量、生长速度和饲料消耗)有关的MC4R基因中多态性的试剂。较佳的，鉴定多态性 的试剂是与MC4R基因或其片段杂交的PCR系列(一套引物、DNA聚合酶和四种三 磷酸核苷)。较佳的，试剂盒中包括PCR系列以及在至少一处切割MC4R基因的限制 酶。较佳的，该试剂盒还包含其它手段，例如用来检测或测定可检出物或提供对照的 试剂。如果需要，还可包括用于杂交、预杂交、DNA萃取、显色和相似目的的其它 试剂。
本发明的基因标记、方法和试剂盒可用于育种程序来改善动物品种、品系或群体 中的脂肪含量、生长速度和饲料消耗等特征。对与特定特征相关的所需多态性至少呈 杂合(较佳的是纯合的)的动物进行连续选择和育种，将会产生具有所需特征的品种、 品系或群体。因此该标记是选择工具。
提供下列实施例的目的是为了描述，而非限制本发明。
实施例1
黑皮质素4受体PCR-RFLP测试-MC4R基因的
TaqI多态性和基因连锁图谱
引物：
用来自人和大鼠MC4R序列的同源区(GenBank登录号分别为s77415和u67863) 设计引物。用这些引物来扩增猪MC4R基因的750bp序列。
MC4R1：5′-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3′(SEQ ID NO：6)
MC4R4：5′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQ ID NO：7)
PCR条件：
混合物1： 10X Promega缓冲液 1.0微升
25mM MgCl2 0.6微升
dNTP混合物(各为2.5mM) 0.5微升
25皮摩尔/微升MC4R1 0.1微升
25皮摩尔/微升MC4R4 0.1微升
dd无菌水 7.5微升
Taq聚合酶(5U/微升) 0.07微升
基因组DNA(12.5毫微克/微升) 1.0微升
将10微升混合物1与DNA混合在反应试管中，然后覆盖上矿物油。进行下列 PCR程序：94℃2分钟；35轮的94℃30秒，58℃1分钟，和72℃1分30秒；最 后在72℃下延伸15分钟。
在标准的1％琼脂糖凝胶上检查5微升PCR反应产物，以确认扩增成功，并清除 负对照。产物大小约为750碱基对。用下列程序进行消化。
TaqI消化反应 10微升反应物
PCR产物 5.0微升
10XTaqINE缓冲液 1.0微升
BSA(10毫克/毫升) 0.1微升
TaqI酶(20U/微升) 0.5微升
dd无菌水 3.4微升
制得缓冲液、酶、BSA和水的混合物。在每个含有DNA的反应管中加入5微升。 然后65℃培育混合物至少4小时至过夜。将加载染料与消化反应物混合，将全部体 积上样于3％琼脂糖凝胶上。等位基因1的主要条带约为466、225和76bp。等位基 因2基因型的条带为542和225bp。杂合基因型具有等位基因1和2。
结果
扩增的PCR产物约为750bp。PCR产物的序列确PCR产物是MC4R基因，在 氨基酸和DNA水平上与对应的人序列分别有97.6％和92.2％的相同性(见图2和3)。
PCR产物的TaqI消化产生了466、225和76bp的等位基因片段(等位基因1)， 或542和225bp的片段(等位基因2)。杂合的基因组具有两种等位基因。在用来通过 连锁分析描绘该基因图谱的三种三代国际参照家族中观察到孟德尔遗传。
PCR产物678位的G到A的转换所导致的等位基因1和等位基因2之间的多态 性解释了MC4R蛋白298位氨基酸从天冬氨酸密码子(GAU)到天冬酰胺(AAU)的错义 突变(见图1，SEQ ID NO：1)。
通过少数不同品种的动物的DNA样品的基因型，确定等位基因频率(表1)。发 现等位基因1在Meishan中的频率为1，而在Hampshire和Yorkshire中没有或频率很 低。等位基因1在Landrace和Chester White中的频率分别为0.5。
图2和图3描述了人和猪MC4R基因的DNA和氨基酸序列之间的差别(SEQ ID NO：2-5)。
表1
不同猪品种中等位基因1的频率 品种 动物数 等位基因1的频率 Meishan 8 1 Large White 8 0.56 Yorkshire 6 0.08 Hampshire 5 0 Landrace 4 0.5 Chester White 4 0.5 Minzu 2 1 Wild Boar 2 1
连锁分析
对国际参照家族的基因型进行两点和多点连锁分析。见图4a-4c。用CRI-MAP 程序分析数据。MC4R明显与猪染色体(SSC)1上的几个标记连锁。通过两点连锁分析， 连锁最接近的标记(重组分数，括号内是LOD评分)是S0331(0.02，21.97)、 BHT0433(0.02，21.32)和S0313(0.00，17.76)。多点连锁分析产生了标记和MC4R的最佳 图谱次序(距离为Kosambi cM)：KGF-5.8-CAPN3-2.5-MEF2A-6.1-MC4R-5.6-S0313。
用一组猪和啮齿类动物的体细胞杂交体为MC4R分配一个细胞遗传学区域。猪 特异性引物的PCR产物在克隆7、8、16、18和19中进行扩增。MC4R的位置在 SSClq22-27。
实施例2
用猪特异性引物和猪MC4R基因的基因连锁图谱
进行MC4R受体PCR-RFLP测试
猪特异性引物序列
正向引物：5′-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3′(SEQ ID NO：8)
反向引物：5′-CAT TAT GAC AGT TAA GCGG-3′(SEQ ID NO：9)
消化方法
用在10微升最终体积中的下列物质进行PCR反应。
猪基因组DNA 12.5ng
lxPCR缓冲液
MgCl2 1.5mM
dNTP 0.125mM
正向引物 0.3μM
反向引物 0.3μM
Taq DNA聚合酶(Promega) 0.35U
PCR过程包括，在Robocycler(Statagene，La Jolla，CA)中，94℃2分钟；35轮的 94℃30秒，56℃1分钟，72℃1分30秒；以及72℃15分钟。在10微升总体积中用 10U的TaqI65℃培育过夜，消化一份5.0微升PCR产物。在3％琼脂糖凝胶上对消 化产物进行电泳。
多态性的描述
PCR产物的Taq I消化产生了466、225和76bp的片段(在等位基因1中)，以及 542和225bp的片段(在等位基因2中)。杂合的基因型具有等位基因1和2的片段。
遗传方式
在三种三代欧洲PiGMaP家族中发现孟德尔遗传的常染色体分离(Archibald等 人，1995)。
等位基因频率
通过欧洲PiGMaP家族的祖代动物与ISU参照家族的不相关的动物的的基因型， 确定等位基因频率。发现等位基因1具有下列频率。
表2
不同猪品种中等位基因1的频率 品种 动物数 等位基因1的频率 Meishan 8 1 Large White 8 0.56 Yorkshire 10 0.15 Hampshire 12 0 Landrace 8 0.56 Chester White 8 0.56 Minzu 2 1 Wild Boar 2 1
染色体位置
用CRI-MAP程序(Green等人，1990)对三个PiGMaP家族的基因型进行两点和多 点连锁分析。MC4R明显与猪染色体1(SSC1)上的几个标记连锁。通过两点连锁分析， 连锁最接近的标记(重组分数，括号内是LOD评分)是S0331(0.02，21.97)、 BHT0433(0.02，21.32)和S0313(0.00，17.76)。多点连锁分析产生的MC4R相对于其它连 锁标记的最佳图谱次序如下(距离为Kosambi cM)：KGF-5.8-CAPN3-2.5-MEF2A-6.1- MC4R-5.6-S0313。
评价
黑皮质素4-受体是表达在脑中的与G-蛋白偶联的7个跨膜的受体。Huszar等人 (1997)发现MC4R基因的失活导致小鼠中的成熟期发病的肥胖综合征，并证实MC4R 蛋白在调节能量平衡中起主要作用。经图谱确定，MC4R基因位于人染色体 18q21.3(Gantz等人，1993)。MC4R基因位于SSC1的位置与以前染色体染色数据相符， 表明该染色体与HSA18和15之间的同线性(Goureau等人，1996)。然而，以前从 HSA18和15到SSC1测得的数个基因(包括CAPN3、KGF和MEF2A)的基因次序对 MC4R并不保守。因此，MC4R在SSC1中的图谱位置可能鉴定了HSA18和15相对 于SSC1之间的进化断点。
实施例3
标记与增强的代谢特征相关
在确定哪个等位基因与哪个特征相关且在哪个品种中的初步研究中，将几个动物 品系的基因型与长至110千克的天数、背部脂肪测定、每日体重增加和平均每日摄食 量关联起来。用于该研究的猪来自Pig Improvement Company(PIC)的品系。
用上述PCR测试累积MC4R基因的等位基因1和2的数据。收集的数据归纳在 下表3-8中。
根据结果，等位基因1在所有品系中明显为瘦肉型等位基因(见P2背部脂肪测 定)，除在中国猪中是脂肪型等位基因。在测试的商用品系中，等位基因2与明显较 快的增重速度(测试日增重)相关。整体等位基因1与较低的摄食量相关。
表3
观察数 MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 88 30 32 150 20 12 57 54 56 74 241 67 22 12 31 254 33 330 37
总共721 MC4R基因型： 11＝纯合等位基因1 12＝杂合 22＝纯合等位基因2
表4 观察数(雄性/雌性) MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 9/79 12/18 15/17 36/114 0/20 12 9/48 37/17 12/44 44/30 102/139 0/67 22 3/9 28/3 89/165 21/12 141/189 0/37
表5
至110kg的天数 MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 169.7 172.4 169.6 168.5 219.1 12 170.2 171.5 165.0 171.2 168.7 212.2 22 165.3 173.4 162.9 170.3 167.1 211.4 p＜.23 p＜.75 p＜.15 p＜.76 p＜.31 p＜.27
表6
P2背部脂肪(毫米) MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 10.8 11.9 9.7 11.1 22.8 12 11.3 12.5 12.2 10.5 11.8 21.5 22 12.1 12.7 12.6 10.7 12.1 20.3 p＜.10 p＜.43 p＜.34 p＜.17 p＜.006 p＜.17
表7
测试日增重(克/天) MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 882.2 811.0 881.8 871.9 688.8 12 891.2 820.5 875.6 873.0 876.3 676.2 22 969.1 819.5 906.7 906.2 906.9 692.5 p＜.01 p＜.96 p＜.05 p＜.24 p＜.006 p＜.66
表8
平均每天摄食量(千克/天)，仅仅公猪，除仅仅是小母猪的L95外 MC4R基因型 L02 L03 L19 L65 总共 L95 11 2.31 1.78 1.75 1.89 2.05 12 2.11 1.90 1.97 1.90 1.96 2.03 22 2.15 1.97 2.00 1.97 2.02 2.08 p＜.84 p＜.14 p＜.56 p＜.14 p＜.16 p＜.36
实施例4
猪黑皮质素-4受体(MC4R)基因的错义变体
与脂肪、生长和摄食量特征有关
为了确定该MC4R多态性是否与表型差异有关，测试了几个不同猪品系的大量 动物个体中的突变。生长和行为测试记录的分析表明，MC4R基因型与许多品系的背 部脂肪、生长速度和摄食量显著相关。MC4R突变的不同氨基酸残基可能使MC4R 功能显著变化。这些结果证实了猪MC4R错义突变的功能意义，并提示模型物种的 基因组对比应用于农场动物与人体医学同样重要。
对在leptin和leptin受体中突变的鉴定已经提供了涉及能量平衡调节的一些遗传 成分的信息(Zhang等人，1994；Tartaglia等人，1995)。用动物模型进行基因研究有助于 鉴定肥胖的主要遗传原因(Andersson1996；Pomp1997；Giridharan，1998)。另外，已经 鉴定出其它几个参与能量稳态神经信号转导途径的基因(Flier和Maratos-Flier1998； Schwartz等人，1999)。在参与能量稳态调节的候选信号分子中，最感兴趣的是黑皮质 素-4受体(MC4R)。MC4R对于leptin信号的应答是摄食量与体重之间的关联(Seeley， 等人，1997；Marsh等人，1999)。中枢神经系统中的神经肽Y(NPY)信号也由MC4R蛋 白介导(Kask等人，1998)。MC4R中的数个突变(包括移码和无意义突变)与人显性遗 传的肥胖有关(Vaisse等人，1998；Yeo，等人，1998)。人的其它一些MC4R错义突变也 已鉴定出来(Gotoda等人，1997；Hinney等人，1999)，但是这些突变的功能意义还未确 定。
根据生长特征来选择对于养猪工业非常重要，因为成本与饲养有关，且消费者偏 好瘦肉。这些数量性状的有效的基因改进可通过使用标记辅助选择(MAS)并用高密度 基因图谱来增强(Dekkers和van Arendonk1998；Rothschild和Plastow1999)。在该方 法中，重要的工具是用熟悉的人和小鼠基因图谱来进行比较作图，它能帮助鉴定猪中 对应的控制生长和行为特征的基因组区域或主要基因。人或动物模型中复杂特征的生 物学知识为牲畜中有经济价值的特征的基因鉴定提供了其它方法。对于脂肪和生长特 征，已经成功进行了几个用表型趋异的品种和候选基因分析的数量性状基因座(QTL) 连锁扫描(Yu等人，1995；Casas-Carrillo等人，1997；Knorr等人，1997；Knott等人， 1998；Rohrer等人，1998；Wang等人，1998；Paszek等人，1999)，但对商用动物群还没 有确定对生长和行为特征有主要作用的单个基因。MC4R在摄食量和肥胖中的作用提 示，它可能是猪中生长有关的性状的重要基因标记。
材料和方法
动物。猪在正常生产条件下由美国和欧洲的nucleus农场中的PIC雇员喂养长大。 约70天大时，对猪进行行为测试，13周后停止测试。在试验的最后，用超声波实时 (B模式)在第10跟肋骨距中线2厘米处测定背部脂肪。将增加的重量除以测试天数， 计算出测试期内平均的日增重(生长)。用标准程序估计长至110千克市场重量的天数， 每一个用电子测定设备测定摄食量。
PCR扩增猪MC4R基因片段。从人和大鼠MC4R序列(GenBank登录号分别为 s77415和u67863的同源区)设计引物。引物是正向引物：5′-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3′(SEQ ID NO：6)和反向引物：5′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQ ID NO：7)。用12.5ng猪基因组DNA、1xPCR缓冲液、1.5mM MgCl2、0.125mM dNTP 0.3mM各引物、和0.35U Taq DNA聚合酶(Promega)在10微升的最终体积内进行PCI 反应。PCR的条件如下：在Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)中，94℃2分钟，35 轮的94℃30秒，56℃1分钟，92℃1分30秒，最后72℃延伸15分钟。
测序和突变检测。对不同品种的几头猪进行PCR产物测序，并比较序列以检测 任何的核苷酸变化。测序在ABI测序仪377(Applied Biosystems)上进行。猪MC4R序 列已经提交给GenBank，登录号为AF087937。序列分析揭示一个核苷酸置换位于Taq I限制酶识别位点内(Kim等人，1999)。然后设计一系列引物，以产生较小的MC4R 基因片段，该片段只含有一个有信息的TaqI限制性位点，以指定多态性位点并有助 于PCR-RFLP测试。这些引物是：正向引物5′-TAC CCT GAC CAT CTT GAT TG 3′(SEQ ID NO：10)和反向引物：5′-ATA GCA ACA GAT GAT CTC TTT G-3′(SEQ ID NO：11)。
统计学分析。方差分析的程序采用说明农场、测试期、动物性别、MC4R基因型 和部位(随机)的固定影响的混合模型。集合所有美国/欧洲品系(品系A-D)的动物用于 整个分析，在该分析中，包括原始品系。估计每个基因型的平均效应，结果列于表 9-15中。用总体F检验来测定显著性水平。
结果
猪MC4R基因中错义突变的鉴定。MC4R基因由包含在一个外显子中的大约1kb 的编码序列组成。PCR产生了猪MC4R基因片段的大约750碱基对(Kim等人，1999)。 PCR产物的序列确证PCR产物是MC4R基因，它在核苷酸和氨基酸水平上与人MC4R 序列分别有92.2％和97.6％的相同性。几个品种的单个动物的序列多重对比鉴定出有 一个核苷酸置换(G→A；图5)。多态性揭示有一个错义突变，在与人MC4R蛋白的氨 基酸298位相同的位置处，天冬氨酸(GAU)被天冬酰胺(AAU)代替。为了确认这一碱 基改变，我们设计侧接多态性位点的猪特异性引物，用TaqIPCR-RFLP凝胶分析多 态性(图6)。图6显示了用琼脂糖凝胶电泳分析得到的PCR产物的TaqI消化结果。 等位基因1产生了156和70bp的片段作为PCR-RFLP，等位基因2产生了226bp的 片段作为PCR-RFLP。杂合体具有等位基因1和2片段。分子标记(M)和MC4R基因 型标在每一泳道的顶部。
MC4R错义突变在黑皮质素受体(MCR)中高度保守的区域内。MCR是偶联G蛋 白受体(GPCR)的亚族，它含有大多数其它GPCR所共有的某些保守的结构元件，但 是MCR和其它GPCR之间的整体氨基酸相同性很低(Tatro 1996)。将猪MC4R蛋白的 预期的氨基酸序列与其它动物种类、其它MCR蛋白或典型的GPCR作多重序列对比， 结果显示第7个跨膜结构域298位的天冬氨酸在MCR蛋白中高度保守(图7)。然而， 感兴趣地注意到，大多数其它GPCR中该位置为天冬酰胺。MCR蛋白彼此间显示出 有40-80％的氨基酸相同性(Tatro 1996)，但是第二个胞质内环和第7个跨膜结构域在 MCR蛋白中是高度保守的(Gantz等人，1993)。通过在人和小鼠中的天然和实验突变 的研究(Robbins等人，1993；Valverde，等人，1995；Frandberg，等人，1998)，已经发现 MCR结构与功能之间的一些关系。这些研究表明，在高度保守区域内的一些突变导 致结构变化并改变受体的功能。Asp298Asn置换突变对受体的功能有影响。然而，这 需要进一步测试，但是已知在MC1R中的同源残基变化(Asp294His)与人的白色皮肤 以及红色头发有关(Valverde，等人，1995)。
MC4R错义突变与肥胖相关特征有关。为了研究错义突变的影响，在PIC(一家 国际养猪公司)的几个商业猪品系总共1800头猪中，分析MC4R基因型和对生长速度、 背部脂肪和饲料消耗差异的影响的关系。动物来自封闭的欧洲/美国品种的商业品系 (品系A-D)，还有来自欧洲和中国品种杂交的品系(品系E)。在品系A-D中，发现所 有行为特征均与MC4R基因型明显相关。等位基因1纯合的动物平均的背部脂肪 (P＜.001)、日增重(P＜.001)和摄食量(P＜.01)明显少于纯合的22基因型动物(表11、13 和15)。总之，具有11基因型的猪的背部脂肪比22基因型猪少大约9％(表11)，而22 基因型的猪明显比11基因型的猪生长得快(37克/天)(表13)。这些结果看来与食欲有 关，因为22基因型动物消耗的比食入的多得多(表15)。在欧洲/美国品种中，清楚地 确立了MC4R基因的错义突变与相关的行为特征之间的联系。虽然测试动物的数量 小得多，但是在相当肥胖的中国杂交系(品系E)中没有发现这些结果。令人感兴趣的 是，品系E显示出背部脂肪的趋势方向与其它品系所观察到的相反(表11)。
讨论
本研究清楚地证实，猪MC4R错义突变与猪的几个行为特征明显相关。表现为 Asp298(在其它MCR亚型和其它动物种类的MC4R中高度保守的氨基酸)的等位基因 1与较小的背部脂肪厚度、较慢的生长速度和较少的摄食量相关联，表现为Asn298 的等位基因2则与较肥的、摄食量较高且生长较快的动物相关。由于黑皮质素受体蛋 白中的高度保守的残基对于配体结合或胞内信号传递起重要的作用(Tatro 1996)， MC4R变体可能在调节食物摄入和体重中发挥功能上不同的能力。进一步验证该假设 将会为MCR功能的结构基础以及治疗人肥胖症的分子靶标提供重要的信息。
等位基因1与品系E中最胖的动物有关，该动物是Chinese Large White品种与 Meishan品系杂交获得的。如果突变引起高度保守区域中发生显著的氨基酸变化，那 么这令人惊奇。结果可能是由取样引起的。然而，如果我们假设当更多的结果加入时， 该结果是显著的，这可能有几种解释。一个可能性或许是背景基因效应(上位性)的不 同。由于生长和肥胖是复杂的多基因特征，因此很有可能中国品种具有数百年分离衍 生的某些不同的等位基因相互作用，而这些推定的相互作用可能在与相差很大的品系 之间的杂交中使多基因特征产生变化(Frankel和Schork 1996)。已经用趋异的品系对 肥胖和生长特征进行了几个QTL分析(Cases-Carrillo等人，1997；Knott等人，1998； Rohrer等人，1998；Wang等人，1998；Paszek等人，1999)，但是没有报道说QTL靠近 C4R基因座(其图谱位置在染色体1上距离连锁图谱约80cm(数据未显示))。它可能意 味着，品系E提示的MC4R等位基因的上位效应使得难以在大多数涉及中国品系和 欧洲/美洲品系间杂交的QTL实验中观察到MC4R基因座。有可能某些等位基因的效 应会在不同的背景下变化，并且难以在涉及基因趋异品种的QTL实验中检测到。
MC4R变体的效应可通过对该突变在其它猪品种和品系中引起的生物学效应的 进一步研究来解释。然而，如果MC4R变体与瘦肉、生长和摄食量有密切的关系， 则该突变可被立即用于标记辅助选择(Meuwissen和Goddard 1996)，以开发出满足特 定消费者需求的猪品系。例如，在产小猪后食欲通常减退的母猪品系中，MC4R等位 基因2的选择能帮助提高摄食量。另外，在一些认为太肥的品系中，可以利用等位基 因1的选择，在认为生长太慢的品系中可以利用等位基因2的选择。因此，在猪育种 品系中选择MC4R突变的基因型将提高选择与摄食有关的生产特征(包括生长和瘦肉) 的效率。候选基因方法也被用来调查猪leptin基因的作用(Jiang和Gibson 1999)。然而， 就leptin而言，尽管在商用品种与未改进品系之间杂交的品种中存在leptin多态性与 背部脂肪厚度相关的证据，但是在测试的不同的商用品系中却没有清楚的关联(Jiang 和Gibson 1999)。因此，不应认为由于找到了一个基因，就可以假定存在一种关系。 相反，对于MC4R，我们已经确定，在该候选基因中的变化能够解释猪商用品系中背 部脂肪、生长速度和摄食量的明显差异。MC4R的这些结果描述了在牲畜基因组中采 用候选基因的对比性基因分析的潜在价值。
MC4R基因型对猪几个生产特征的影响
表9
长至110kg的天数以及背部脂肪的观察数(雄性/雌性/总数) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 9/212/221 12/94/106 37/17/54 58/323/381 0/20/20 12 9/150/159 37/96/133 12/158/170 152/30/182 210/434/644 0/67/67 22 3/16/19 28/36/64 89/356/445 155/12/167 275/420/695 0/37/37
表10
长至110kg的天数 MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 166.3+/-0.8 168.4+/-1.4 170.0+/-2.4 167.9+/-0.9 219.1+/-4.8 12 165.6+/-0.9 166.8+/-1.1 163.9+/-1.0 170.2+/-1.8 166.9+/-0.8 212.2+/-3.4 22 162.3+/-2.3 166.8+/-1.5 161.5+/-0.8 167.0+/-1.9 164.6+/-0.9 211.4+/-4.0 p＜.24 p＜.47 p＜.007 p＜.10 p＜.001 p＜.27
表11
第10根肋骨的背部脂肪(毫米) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 10.7+/-0.2 12.1+/-0.2 9.8+/-0.5 11.1+/-0.2 22.8+/-1.2 12 11.2+/-0.2 12.5+/-0.2 12.3+/-0.2 10.5+/-0.4 11.6+/-0.2 21.5+/-0.9 22 12.5+/-0.5 12.6+/-0.3 12.7+/-0.2 10.9+/-0.4 12.0+/-0.2 20.3+/-1.0 p＜0.2 p＜.31 p＜.06 p＜.05 p＜.00l p＜.17
表12
测试日增重的观察数(雄性/雌性/总数) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 9/105/114 12/38/50 37/17/54 58/160/218 0/20/20 12 9/65/74 37/35/72 12/97/109 152/30/182 210/227/437 0/67/61 22 3/13/15 28/15/43 89/225/314 155/12/167 275/265/539 0/37/37
表13
测试日增重(克/天) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 892.6+/-l0.4 841.7+/-13.8 882.2+/-18.4 871.9+/-10.2 688.8+/-24.5 12 913.3+/-11.6 868.4+/-12.1 882.2+/-12.9 883.7+/-14.3 885.1+/-8.9 676.2+/-17.6 22 982.8+/-22.8 862.4+/-15.1 913.4+/-10.5 904.6+/-15.1 908.8+/-9.3 692.5+/-20.4 p＜.001 p＜.28 p＜.006 p＜.20 p＜.001 p＜.66
表14
平均日摄食量的观察数(雄性/雌性/总数) MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 7/0/7 11/0/11 13/0/13 31/0/31 0/18/18 12 8/0/8 31/0/31 9/0/9 34/0/34 82/0/82 0/63/63 22 3/0/3 25/0/25 74/0/74 16/0/16 118/0/118 0/32/32
表15
平均日摄食量(千克/天)，仅仅是公猪，除品系E仅为小母猪外 MC4R基因型 品系A 品系B 品系C 品系D 总共 品系E 11 2.31+/-0.2 1.78+/-0.09 1.75+/-0.06 1.94+/-0.07 2.05+/-0.10 12 2.11+/-0.3 1.90+/-0.07 1.97+/-0.10 1.90+/-0.07 2.03+/-0.06 2.03+/-0.07 22 2.15+/-0.4 1.97+/-0.06 2.00+/-0.07 1.97+/-0.08 2.11+/-0.06 2.08+/-0.08 p＜.84 p＜.14 p＜.56 p＜.14 p＜.01 p＜.36
在参照特定组成、效果理论等描述了本发明后，本领域技术人员显然能明了，本 发明并不局限于这些描述性的实施方案或机理，可不脱离所附权利要求所定义的本发 明范围或精神进行改动。预计所有这些明显的改动和变化均包括在所附权利要求的本 发明范围内。权利要求意味着覆盖了所要求的组分以及能有效满足其目的的任何次序 的步骤，除非本文有相反的具体内容。
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相关申请交叉文献
本申请要求了1998年7月27日提交的美国临时申请No.60/094,287和1999年1 月15日提交的美国临时申请No.60/116,186的优先权，这些文献的公开内容纳入本文 作为参考。
补助金参考条款
本发明至少部分得到美国农业部通过衣阿华农业和家庭经济实验站(IaHees)以及 IOW03148项目(Hatch Funds)拨款的支持。美国政府在本发明中享有一定的权利。
序列表 <110>衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司 <120>黑皮质素-4受体基因及其作为动物脂肪含量、体重增加和/或饲料消耗的遗传标记的用途 <130>rothshcild mc4r2 <140>PCT/US99/16862 <141>1999-07-26 <150>60/094，287 <151>1998-07-27 <150>60/116，196 <151>1999-01-15 <160>26 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>745 <212>DNA <213>猪 <220> <221>差异 <222>(678) <223>G/A <400>1 acaagaatct gcattcaccc atgtactttt tcatctgtag cctggctgtg gctgatatgc 60 tggtgagcgt ttccaatggg tcagaaacca ttgtcatcac cctattaaac agcacggaca 120 cggacgcaca gagtttcaca gtgaatattg ataatgtcat tgactcagtg atctgtagct 180 ccttactcgc ctcaatttgc agcctgcttt cgattgcagt ggacaggtat tttactatct 240 tttatgctct ccagtaccat aacattatga cagttaagcg ggttggaatc atcatcagtt 300 gtatctgggc agtctgcacg gtgtcgggtg ttttgttcat catttactca gatagcagtg 360 ctgttattat ctgcctcata accgtgttct tcaccatgct ggctctcatg gcttctctct 420 atgtccacat gttcctcatg gccagactcc acattaagag gatcgccgtc ctcccaggca 480 ctggcaccat ccgccaaggt gccaacatga agggggcaat taccctgacc atcttgattg 540 gggtctttgt ggtctgctgg gcccccttct tcctccactt aatattctat atctcctgcc 600 cccagaatcc atactgtgtg tgcttcatgt ctcactttaa tttgtatctc atcctgatca 660 tgtgtaattc catcatcgat cccctgattt atgcactccg gagccaagaa ctgaggaaaa 720 ccttcaaaga gatcatctgt tgctat 746 <210>2 <211>840 <212>DNA <213>智人 <400>2 atatcttagt gattgtggca atagccaaga acaagaatct gcattcaccc atgtactttt 60 tcatctgcag cttggctgtg gctgatatgc tggtgagcgt ttcaaatgga tcagaaacca 120 ttatcatcac cctattaaac agtacagata cggatgcaca gagtttcaca gtgaatattg 180 ataatgtcat tgactcggtg atctgtagct ccttgcttgc atccatttgc agcctgcttt 240 caattgcagt ggacaggtac tttactatct tctatgctct ccagtaccat aacattatga 300 cagttaagcg ggttgggatc agcataagtt gtatctgggc agcttgcacg gtttcaggca 360 ttttgttcat catttactca gatagtagtg ctgtcatcat ctgcctcatc accatgttct 420 tcaccatgct ggctctcatg gcttctctct atgtccacat gttcctgatg gccaggcttc 480 acattaagag gattgctgtc ctccccggca ctggtgccat ccgccaaggt gccaatatga 540 agggagcgat taccttgacc atcctgattg gcgtctttgt tgtctgctgg gccccattct 600 tcctccactt aatattctac atctcttgtc ctcagaatcc atattgtgtg tgcttcatgt 660 ctcactttaa cttgtatctc atactgatca tgtgtaattc aatcatcgat cctctgattt 720 atgcactccg gagtcaagaa ctgaggaaaa ccttcaaaga gatcatctgt tgctatcccc 780 tgggaggcct ttgtgacttg tctagcagat attaaatggg gacagagcac gcaatatagg 840 <210>3 <211>311 <212>蛋白质 <213>智人 <400>3 Gln Leu Phe Val Ser Pro Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Val Ile Ser 1 5 10 15 Leu Leu Glu Asn Ile Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Lys Asn Lys Asn
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85 90 95 Ile Ile Ser Cys Ile Trp Ala Val Cys Thr Val Ser Gly Val Leu Phe
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