一种基于紫外光谱快速测定郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程
多种成分含量的方法
技术领域
[0001] 本
发明属于中药生产过程分析领域，具体涉及一种快速测定郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程多种成分含量的方法。
背景技术
[0002] 郁金(Radix Curcumae)味辛、苦，性寒，具有行
气化瘀、清心解郁、利胆退黄的功效，倍半萜类挥发性成分是其中的重要有效成分。栀子(Fructus Gardeniae)味苦，性寒，具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒的作用，其挥发性成分被认为是重要的药效物质。郁金、栀子两味中药在多种中成药(醒脑静注射液)
处方中被广泛使用。水蒸气蒸馏法提取郁金-栀子中挥发性成分是醒脑静注射液的重要生产工序，但该工序存在提取时间长、能耗高、提取物批次间
质量差异大等问题。为了合理判断提取过程终点，提升生产过程质量监控水平，需要建立水蒸气蒸馏提取过程的快速分析方法。
[0003] 虽然报道郁金、栀子成分分析方法的文献很多，但大多数方法采用耗时的色谱分析，无法在提取过程中及时得到分析结果。在快速分析方面，有文献(
近红外光谱法测定温郁金中吉
马酮含量，中国新药杂志，2013，22(13)，1582-1586)报道了郁金药材中吉马酮含量的近红外光谱快速测定方法，公开号为CN105548026A的
专利公开了郁金药材中莪术二酮、吉马酮、莪术醇含量的近红外光谱快速测定方法。而对栀子中成分的快速分析方法，目前报道的均为测定栀子苷等非挥发性成分(如文献：近红外光谱快速测定栀子逆流提取过程中栀子苷含量，南京中医药大学学报，2014，30(1)，72-75)，对栀子中挥发性成分的快速分析方法尚无文献报道。对于郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程，目前只有公开号为CN102928352A的专利公开了近红外光谱快速测定莪术二醇、吉马酮、莪术醇3种成分的方法。因此，为了在郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程中测定更多成分的含量，以更好地开展相关中药制剂(如醒脑静注射液)生产过程监测与质量控制，很有必要在
现有技术基础之上研究设计出能快速、准确且低成本地测定郁金-栀子蒸馏液中多种成分含量的方法。
[0004] 紫外光谱是一种快速、无损的分析方法，与近红外光谱相比，具有灵敏度高、仪器价格便宜的优点。紫外光谱结合多元定量校正模型的分析方法，已被用于多种中药的生产过程。由于郁金-栀子蒸馏液中各成分浓度较低，比较适合采用灵敏度较高的紫外光谱进行分析。
发明内容
[0005] 本发明的目的是为了解决上述问题，基于紫外光谱和多元定量校正模型，提供一种能在郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程中快速、准确且低成本地测定蒸馏液中异佛尔酮、4-亚甲基-异佛尔酮、莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇和吉马酮9种成分含量的方法。该方法具有操作简便、分析迅速、分析成本低、不破坏样品、不消耗化学
试剂等优点，有助于生产过程监测与质量控制。
[0006] 为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
[0008] (1)样本的收集
[0009] 在多个批次的郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程的不同时间点收集蒸馏液，作为样本集，并将样本集划分为训练集和预测集两部分；
[0010] (2)样本中各成分的含量测定
[0011] 以高效液相色谱法测定样本集内各样本中异佛尔酮、4-亚甲基-异佛尔酮、莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇和吉马酮9种成分的含量，作为参考值；
[0012] (3)样本紫外光谱采集
[0013] 使用紫外光谱仪采集样本集中各样本的紫外光谱；
[0014] (4)定量校正模型的建立
[0015] (4-1)剔除异常样本后，使用多元统计建模方法分别建立训练集样本的紫外光谱与9种成分之间的定量校正模型；
[0016] (4-2)采用训练集内部交叉验证的方法，以交叉验证误差均方根(RMSECV)为指标，对模型参数进行优化；
[0017] (4-3)以预测集样本对模型预测能
力进行评价；
[0018] (5)定量校正模型的应用
[0019] 按步骤(3)的方法采集待测蒸馏液的紫外光谱，用步骤(4)所建模型计算得到待测蒸馏液中9种成分含量。
[0020] 步骤(1)中，样本收集的具体步骤为：将郁金、栀子药材分别
粉碎、过筛至5～200目，按质量比为1～9:3的比例取郁金、栀子粉末混匀，加入郁金粉末质量10～200倍的提取
溶剂，该提取溶剂可为水、体积分数为10％～30％的
乙醇溶液或质量分数为0.05％～0.2％的
盐酸溶液，浸泡0～48小时，以水蒸气蒸馏法进行提取，待药液
沸腾后每隔5～60分钟在冷凝管出口处接取蒸馏液样本。按上述提取条件开展同条件下不少于6个批次的提取实验，取样不少于50份，作为训练集。
[0021] 作为优选，步骤(2)中，所述高效液相色谱法的测定条件为：色谱柱：反相C18色谱柱；流动相：A相为体积分数0.1％
磷酸水溶液，B相为乙腈；洗脱程序为线性梯度洗脱；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；进样量：50μL；检测
波长：异佛尔酮，238nm；4-亚甲基-异佛尔酮，
275nm；莪术双环烯酮，256nm；莪术烯醇，261nm；莪术二酮，220nm；莪术酮，274nm；莪术呋喃二烯酮，274nm；莪术醇，210nm；吉马酮，210nm。上述洗脱程序中磷酸水溶液占流动相体积比为：0min，30％；10min，55％；24min，55％；24.1min，70％；35min，70％；40min，100％。
[0022] 步骤(3)中，紫外光谱采集方式为透射模式，波长范围为200～400nm，波长间隔为1～3nm，
石英比色皿光程为1～10mm。
[0023] 步骤(4)所使用的紫外光谱为紫外光谱仪测得的原始紫外光谱，或经预处理得到的紫外光谱。紫外光谱的预处理方法包括：标准化、平滑一阶导数和/或平滑二阶导数。
[0024] 步骤(4-1)中，所述的多元统计建模方法包括偏最小二乘(PLS)、最小二乘
支持向量机(LS-SVM)和/或径向基
人工神经网络(RBF-ANN)。
[0025] 步骤(4-2)中的模型参数由步骤(4-1)中采用的多元统计建模方法确定，模型参数包括PLS模型中的主成分数；LS-SVM模型中的径向基核函数参数σ2和正则化参数γ；RBF-ANN模型中的目标拟合误差均方根(RMSEC)、隐含层神经元个数最大值和径向基核函数扩展系数(spread)。
[0026] 步骤(4-2)中，以RMSECV最小化为目标，对模型参数进行优化。
[0027] 步骤(4-3)中，以预测误差均方根(RMSEP)为指标，对模型预测能力进行评价，RMSEP越小则模型预测能力越好。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0029] (1)本发明提供一种能在郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程中同时快速测定蒸馏液中异佛尔酮、4-亚甲基-异佛尔酮、莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇和吉马酮9种成分含量的方法，可以更全面地评价提取情况。
[0030] (2)本发明收集了大量样本，对定量校正模型进行了充分的优化，所建立的校正模型具有较好的预测能力，可较准确地测定各个成分含量。
[0031] (3)紫外光谱仪是实验室常用仪器，设备成本较低，紫外光谱的测定操作简便、分析迅速、分析成本低、不破坏样品、不消耗化学试剂，因此本方法检测成本低、实用性高，具有很好的应用前景和使用价值。
附图说明
[0032] 图1为
实施例1中本发明方法UV测定值与HPLC测定值的相关图(○为训练集，+为预测集)，其中，(a)异佛尔酮；(b)4-亚甲基-异佛尔酮；(c)莪术双环烯酮；(d)莪术烯醇；(e)莪术二酮；(f)莪术酮；(g)莪术呋喃二烯酮；(h)莪术醇；(i)吉马酮；
[0033] 图2为实施例1中应用本发明方法测定一个提取批次各时间点蒸馏液中9种成分含量的变化趋势图；
[0034] 图3为实施例2中应用本发明方法测定一个提取批次各时间点蒸馏液中9种成分含量的变化趋势图。
具体实施方式
[0035] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的
修改均落于本
申请所附
权利要求所限定的范围。
[0036] 实施例1
[0037] 一种基于紫外光谱快速测定郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程多种成分含量的方法，该方法包括以下步骤：
[0038] (1)样本的收集
[0039] 将郁金、栀子药材分别粉碎、过筛至20～80目，各取30g粉末混匀，加蒸馏水1500mL，浸泡12小时，以水蒸气蒸馏法进行提取。待药液沸腾，开始计时，在第15和30分钟分别在冷凝管出口处接取5mL蒸馏液样品，之后每隔30分钟取样5mL，至蒸馏液总体积(包含取样体积)为1000mL时停止取样。按上述条件开展11个批次的提取实验，所得样本作为训练集。
[0040] 分别对上述提取条件之一进行改变后，开展5个批次提取实验(称为批次12～16)，所得样本作为预测集。提取条件的具体变化如下：批次11药材颗粒大小改为10～20目，批次12改为提取前不浸泡，批次13提取溶剂改为体积分数10％～30％乙醇溶液，批次14提取溶剂改为质量分数0.05％～0.2％盐
酸溶液，批次15药材投入量改为60g郁金和30g栀子。
[0041] 共进行16个批次实验，取样166份，作为样本集，并将全部样本划分为训练集和预测集，训练集具体指批次1～11得到的111个样本，预测集指批次12～16得到的55个样本。
[0042] (2)样本集中各成分的含量测定
[0043] 以高效液相色谱法测定各样本中异佛尔酮、4-亚甲基-异佛尔酮、莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇、吉马酮9种成分含量，作为参考值。
[0044] 具体测定方法如下：仪器：Waters e2695高效液相色谱仪；色谱柱：迪马钻石C18色谱柱(5μm，250×4.6mm)；流动相：A相为体积分数0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈；洗脱程序为线性梯度洗脱；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；进样量：50μL；检测波长：异佛尔酮，238nm；4-亚甲基-异佛尔酮，275nm；莪术双环烯酮，256nm；莪术烯醇，261nm；莪术二酮，220nm；莪术酮，274nm；莪术呋喃二烯酮，274nm；莪术醇，210nm；吉马酮，210nm。上述洗脱程序中磷酸水溶液占流动相体积比为：0min，30％A；10min，55％A；24min，55％A；24.1min，70％A；35min，70％A；40min，100％A。
[0045] (3)样本紫外光谱采集
[0046] 使用紫外光谱仪采集样品集内各样本紫外光谱，具体方法如下：仪器：UV-2600紫外光谱仪(上海尤尼科仪器有限公司)；参比溶液：蒸馏水；扫描波长范围：200～400nm；波长间隔：1nm；采集方式：透射模式；石英比色皿光程：2mm。
[0047] (4)定量校正模型的建立
[0048] 使用111个训练集样本，以紫外光谱仪测得的原始紫外光谱，或其经过标准化预处理(即通过预处理使各变量均值为0、标准差为1)、Savitsky-Golay平滑一阶导数或平滑二阶导数(窗口大小为7，3阶多项式)。
[0049] 预处理所得的紫外光谱作为自变量X，以步骤(2)测定的9种成分含量作为参考值Y，分别采用偏最小二乘(PLS)、最小二乘支持向量机(LS-SVM)和径向基人工神经网络(RBF-ANN)3种方法建立定量校正模型，其中以RBF-ANN建模时将RMSEC的目标设为0，隐含层神经元个数最大值设为30。
[0050] 采用7-fold交叉验证方法，以交叉验证误差均方根(RMSECV)为指标，对模型参数和光谱预处理方法进行优化，各模型优化结果见表1、表2、表3，其中，Rcal为拟合相关系数，Rval为交叉验证相关系数。对比3种建模方法，以RMSECV最小确定的9种成分最优定量校正模型及其参数见表4。
[0051] 根据表4的结果运用最优模型将训练集111个样本的紫外光谱与高效液相色谱法测得的9种成分含量进行回归关联，建立训练集样本的紫外光谱与9种成分之间的最优定量校正模型。
[0052] 将55个预测集样本的紫外光谱输入上述确定的最优定量校正模型，计算样本中9种成分的含量，即UV测定值，作为预测值，并与高效液相色谱法测定值进行比较，以RMSEP为指标评价模型预测能力，各成分的RMSEP见表4。RMSEP均小于RMSECV，表明模型没有过拟合。RMSEP值远小于各成分浓度变化范围，表明模型具有较好的预测能力。
[0053] 图1为本发明方法UV测定值与HPLC测定值的相关图，图中，UV测定值指将预测集样本的紫外光谱输入确定的最优定量校正模型，计算得到的样本中9种成分的含量，作为预测值，图中显示了本发明UV测定值与HPLC测定值之间的相关性，图中训练集样本的纵坐标为交叉验证值，预测集样本的纵坐标为预测值。结果表明，两种分析方法间相关性良好，说明本发明方法可代替高效液相色谱分析，在生产过程中快速测定各成分含量。
[0054] 表1 PLS模型优化结果
[0055]
[0056] 表2 LS-SVM模型优化结果
[0057]
[0058] 表3 RBF-ANN模型优化结果
[0059]
[0060]
[0061] 表4各成分的最优定量校正模型
[0062]
[0063] (5)定量校正模型的应用
[0064] 郁金、栀子药材分别粉碎、过筛至20～80目，各取30g粉末混匀，加蒸馏水1500mL，浸泡12小时，以水蒸气蒸馏法进行提取。待药液沸腾，开始计时，在第15和30分钟分别在冷凝管出口处接取5mL蒸馏液样品，之后每隔30分钟取样5mL，按步骤(3)的方法测定样品的紫外光谱，用步骤(4)所确定的最优定量校正模型计算得到蒸馏液中9种成分的含量。
[0065] (6)本发明方法与高效液相色谱法测定结果比较
[0066] 图2为本实施例中应用本发明方法测得的一个提取批次各提取时间点蒸馏液中9种成分含量的变化趋势图，其中，各成分含量中，UV表示采用本发明方法计算得到的预测值，HPLC表示实测值(采用步骤2的方法进行测定)，结果表明，结果显示，本发明方法测定结果与高效液相色谱法一致，表明本发明方法能在提取过程中快速测定蒸馏液中9种成分含量，可用于提取过程监测。
[0067] 实施例2
[0068] 一种基于紫外光谱快速测定郁金-栀子水蒸气蒸馏提取过程多种成分含量的方法，该方法包括以下步骤：
[0069] (1)样本的收集
[0070] (2)样本集中各成分的含量测定
[0071] (3)样本紫外光谱采集
[0072] (4)定量校正模型的建立
[0073] (5)定量校正模型的应用
[0074] 在本发明方法的开发过程中已完成步骤(1)～(4)，具体过程可参考实施例1步骤(1)～(4)，因此，在本发明方法的应用中，可直接开展步骤(5)如下：郁金、栀子药材分别粉碎、过筛至10～20目，各取30g粉末混匀，加蒸馏水1500mL，浸泡12小时，以水蒸气蒸馏法进行提取，待药液沸腾，开始计时，在第15和30分钟分别在冷凝管出口处接取5mL蒸馏液样品，之后每隔30分钟取样5mL，按步骤(3)的方法测定样品的紫外光谱，用步骤(4)所建模型计算得到蒸馏液中9种成分含量。
[0075] 图3为本实施例中应用本发明方法测得的一个提取批次各提取时间点蒸馏液中9种成分含量的变化趋势图，
[0076] (6)本发明方法与高效液相色谱法测定结果比较
[0077] 为了显示本发明方法的准确性，图3中同时标注了高效液相色谱法测定值(按步骤2测定)。结果显示，本发明方法测定结果与高效液相色谱法一致，表明本发明方法能在提取过程中快速测定蒸馏液中9种成分含量。将图3与图2对比可知，当药材颗粒变大时，提取液中莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、吉马酮的含量变低，表明本发明方法能有效地反映不同提取条件对各成分提取量的影响。
