利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸的方法
阅读：765发布：2020-05-11
专利汇可以提供利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及利用固定化的疏 棉 状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和 脂肪酸 的方法，所述方法包括：(1)在抽 真空 或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生酯化反应；(2)从反应后的产物中分离出富集的游离型长链多不 饱和脂肪酸 。所述方法利用固定化脂肪酶在催化脂肪酸和醇类酯化过程中对不同链长脂肪酸的选择性催化酯化，实现了一种从深海鱼油或 微 生物 油脂中富集长链多不饱和脂肪酸的新方法。，下面是利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用固定化脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的方法，所述方法包括：
(1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应；
(2) 从反应后的产物中分离出富集游离型PUFAs的游离脂肪酸；
所述固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为固定于离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶；
其中，所述离子交换树脂为弱碱性离子交换树脂。
2.一种利用固定化脂肪酶纯化长链多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：
(1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应；
(2) 从反应后的产物中分离出含有游离型PUFAs的游离脂肪酸；
所述固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为固定于离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶；
其中，所述离子交换树脂为弱碱性离子交换树脂。
3.一种利用固定化脂肪酶降低游离脂肪酸中短碳链脂肪酸含量的方法，所述方法包括：
在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应；
所述固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为固定于离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶；
其中，所述离子交换树脂为弱碱性离子交换树脂。
4.一种利用固定化脂肪酶提高游离脂肪酸中长链多不饱和脂肪酸含量的方法，所述方法包括：
在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应；
所述固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为固定于离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶；
其中，所述离子交换树脂为弱碱性离子交换树脂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述游离的脂肪酸通过碱催化水解、酶法水解或高压高温水解含有PUFAs的油脂获得。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述游离的脂肪酸通过以下步骤制备：
(a) 在抽真空或保护气氛下，对含有PUFAs的油脂进行碱催化水解；
(b) 加入萃取剂进行萃取，并将所得水层进行酸化后再次萃取，获得游离的脂肪酸。
7.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述固定于弱碱性离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶通过以下方式制得：(i) 将离子交换树脂与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶接触，以获得固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还进一步包括以下步骤：(ii)将固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶干燥。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤（i）中，所述弱碱性离子交换树脂与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，在25-35℃，150-300转/分钟条件下，接触2-8小时。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，每ml 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶液中加入
0.1-5g弱碱性离子交换树脂。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述弱碱性离子交换树脂为0.4-2.5g。
利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和脂肪
酸的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸的方法，所述方法利用固定化脂肪酶在催化脂肪酸和醇类酯化过程中对不同链长脂肪酸的选择性催化酯化，实现了一种从深海鱼油或微生物油脂中富集长链多不饱和脂肪酸的新方法。技术背景
[0002] 近些年来，EPA、DHA、DPA和ARA等长链多不饱和脂肪酸（PUFAs）因其独特的生理功能一直能为研究的热点。由于天然存在的PUFAs含量不高，为了提高PUFAs的医疗和保健价值，越来越多的研究工作开始致力于PUFAs的富集纯化方面。
[0003] 目前PUFAs分离纯化方法主要采用传统的化学法，如低温结晶法、尿素包合法、银离子络合分离法等。这些方法提纯富集PUFAs需要用到大量的有机试剂，对环境造成极大的污染，同时工艺繁琐、比较耗时，易造成PUFAs的氧化。
[0004] 脂肪酶催化法反应效率高，酶使用量少，反应条件温和，且固定化酶能重复利用，在水解、醇解、酸解、酯酯交换和酯化等反应有着广泛应用。近年来，关于运用脂肪酶来富集PUFAs的研究工作也取得一定进展。CN101161819A利用酶法制备了EPA和DHA总含量达50%～80%的甘油酯；CN101348807B利用柱层析方法分离提纯EPA和DHA，用脂肪酶催化提纯后的EPA和DHA与甘油进行酯化反应，得到富含EPA和DHA的甘油酯。以上专利方法及目前大多数文献报道均先将水解或醇解后的脂肪酸（游离型或乙酯型）进行化学法富集纯化PUFAs，然后用脂肪酶催化酯化或酯交换等反应，得到纯度较高的PUFAs甘油酯。该种方法的弊端在于，工序较为繁琐，其关键步骤还在于化学方法提纯，使用尿素包合等方法会浪费大量的有机试剂，得率较低，同时会造成尿素等成分的残留。
[0005] 关于脂肪酶选择性水解来富集ω-3PUFAs的研究国内外也有一定的报道，如冈田智子（Tomoko Okada）等人通过筛选脂肪酶来水解富集沙丁鱼油中ω-3PUFAs，DHA含量仅从13.62%提升到29.94%。脂肪酶选择性水解富集法的关键是筛选出良好选择性的脂肪酶和控制好水解过程参数，目前文献报道的能用于催化鱼油选择性水解的脂肪酶主要有假单胞菌（Pseudomonas sp.）、皱褶假丝酵母（Candida rugosa）和柱状假丝酵母（Candida cylindracea）等价格昂贵的脂肪酶。脂肪酶选择性水解方法主要缺点是：因水解酶来源限制造成生产成本较高，水解反应进程难于控制，富集纯度偏低，无法满足高含量ω-3PUFAs的市场需求。
[0006] CN200380106326.2公开了在基本不含有机溶剂的条件下，在脂酶催化剂存在下，使含有游离酸或己酯形式EPA和DHA的海产品油与乙醇进行酯化，并进行蒸馏分离。其中使用了固定的MML酶(米黑根毛酶脂酶)和固定于硅胶颗粒上的新型Novozyme脂酶(疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶（TL脂肪酶）)。但其转化率不高，其中固定于硅胶颗粒上的新型Novozyme脂酶的转化率仅仅43％。此外，WO2008SE290A公开了多不饱和脂肪酸富集的海洋石油可用于形成具有水富集组分的乳液(用于形成例如调味品和沙司)，它包括二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸以及甘油一酸酯和甘油二酯。其中，使用了固定于聚丙烯MP1000上的TL酶。但其对PUFAs的富集效果仍旧不高，还不如固定的米黑根毛酶脂酶(Rhizo-mucor miehei，RM)、PS(Pseudomonas sp.)和PF(Pseudomonas fluorescens)。
[0007] 因此，现有技术急需一种新的富集PUFAs的方法，具有操作简便、成本低廉、富集纯度更高的特点。
发明内容
[0008] 为了实现上述目的，本发明人经过深入的研究，提供一种利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶（TL脂肪酶）富集长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的方法，所述方法包括：
[0009] (1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生酯化反应，所述游离的脂肪酶含有PUFAs；
[0010] (2)从反应后的产物中分离出富集的游离型PUFAs。
[0011] 本发明还提供了一种利用固定化脂肪酶纯化长链多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：
[0012] (1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应；
[0013] (2)从反应后的产物中分离出含有游离型PUFAs的游离脂肪酸。
[0014] 本发明还提供了一种利用固定化脂肪酶降低游离脂肪酸中短碳链脂肪酸含量的方法，所述方法包括：
[0015] (1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应。
[0016] 本发明还提供了一种利用固定化脂肪酶提高游离脂肪酸中长链多不饱和脂肪酸含量的方法，所述方法包括：
[0017] (1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应。
[0018] 在本发明的一个实施方式中，使用的游离的脂肪酸通过碱催化水解、酶法水解或高压高温水解含有PUFAs的油脂获得。
[0019] 在本发明的一个实施方式中，本发明所述方法还包括提供游离的脂肪酸的步骤：
[0020] (a)在抽真空或保护气氛下，对含有PUFAs的油脂进行碱催化水解；
[0022] 在本发明中，含有PUFAs的油脂包括鱼油和微生物油脂，优选的，所述鱼油包括沙丁鱼油、金枪鱼油、鲱鱼油、鳕鱼肝油、三文鱼油、鲔鱼油、鲑鱼油、鳝鱼油、鲭鱼油以及它们的组合；所述微生物油脂包括DHA藻油、ARA油脂以及它们的组合。
[0023] 在本发明一个实施方式中，步骤(a)的保护气氛选自氮气保护气氛、氩气保护气氛、氦气保护气氛。
[0024] 在本发明一个实施方式中，步骤(a)使用选自KOH醇-水溶液、NaOH醇-水溶液的碱溶液进行碱催化水解。优选地，所述碱催化水解在40-80℃下、在搅拌条件下回流0.5-2小时。
[0025] 在本发明一个实施方式中，步骤(b)中，所述萃取剂选自正己烷、正庚烷、石油醚。所述酸化使用选自HCl、HNO3来进行。其中，所述酸化优选酸化至pH＝1～3。
[0026] 在本发明一个实施方式中，所述方法还包括将步骤(b)获得游离的脂肪酸进行干燥，并去除萃取剂。其中，用于干燥的干燥剂选自无水Na2SO4、无水MgSO4、无水CuSO4、P2O5。所述去除萃取剂的方法包括旋蒸、氮吹除法、真空干燥。
[0027] 在本发明一个实施方式中，步骤(1)的保护气氛选自氮气保护气氛、氩气保护气氛、氦气保护气氛。
[0028] 在本发明一个实施方式中，所述醇包括碳原子数为1～12的一元醇、二元醇和三元醇。优选，所述醇包括碳原子数为2～12的一元醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇。更优选，所述醇包括碳原子数为3～12的一元醇和丙三醇。
[0029] 在本发明一个实施方式中，步骤(1)中醇和游离脂肪酸的摩尔比为10:1～1:10。
[0030] 在本发明一个实施方式中，所述固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为固定于离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。
[0031] 在本发明一个实施方式中，所述固定于离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶通过以下方式制得：(i)将离子交换树脂与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶接触，以获得固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶；在一个更优选的实施例中，所述方法还进一步包括以下步骤：(ii)将固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶干燥。
[0032] 在本发明一个实施方式中，所述离子交换树脂与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，在25-35℃，150-300转/分钟（rpm）条件下，接触2-8小时；在一个更优选的实施例中，每ml所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶液中加入0.1-5g离子交换树脂，优选为0.4-2.5g离子交换树脂。
[0033] 在本发明一个实施方式中，所述离子交换树脂为苯乙烯系树脂、丙烯酸系树脂、阳离子树脂或阴离子树脂，优选的，所述离子交换树脂为弱碱性离子交换树脂。
[0034] 在本发明一个实施方式中，步骤(1)中所述固定于离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的使用量为醇和脂肪酸总质量(下文中，醇和脂肪酸称为反应底物)的1%～20%。
[0035] 在本发明一个实施方式中，抽真空条件下，反应容器内压强为0.1～1KPa。
[0036] 在本发明一个实施方式中，步骤(1)中，脂肪酸与醇反应4～24小时。
[0037] 在本发明的一个实施例中，在酯化反应中加入带水剂，优选的带水剂为分子筛。
[0038] 在本发明一个实施方式中，步骤(1)中，脂肪酸与醇在20-80℃的温度范围内进行2-24小时。其中，在步骤(1)中，碳数小于20的脂肪酸与醇类发生反应生成脂肪酸酯，而PUFAs依然以游离脂肪酸形式存在，从而实现PUFAs的分离和富集。
[0039] 本发明的上述方法与传统富集PUFAs的物理化学方法相比，除具有酶法反应的一系列优势外，大大减少了有机试剂的使用，简化了工艺；与现有文献报道的脂肪酶选择性水解富集PUFAs的方法相比，本发明所采用富集方法的原理是基于选择性酯化而非选择性水解，富集纯度较高，而且Thermomyces lanuginosus脂肪酶来源于工业化生产，价格较为低廉，大大节约了成本。附图说明
[0040] 图1是本发明利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸方法的一个实例的示意图。
具体实施方式
[0041] 以下，发明人结合附图对本发明利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus)富集长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的方法进行详细的说明，但需要注意的是，这些说明并不意图用于限制本申请要求的范围。
[0042] 不同于现有技术中采用了包括选择性水解的富集长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的方法，本发明所述方法实际采用了包括选择性酯化的富集长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的方法。具体来说，本发明提供一种利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的方法。将含有PUFAs的游离脂肪酸，在脂肪酶催化作用下与醇类进行酯化反应，短碳链脂肪酸（碳数小于20）优先发生反应生成酯类，而PUFAs仍以游离脂肪酸形式存在，进而达到富集效果。本发明通过筛选对比不同的固定化脂肪酶（包括本发明所述固定于离子交换树脂的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TL脂肪酶))和商品酶），发现本发明固定化TL脂肪酶最为适合本工艺方法，酯化选择性较好，PUFAs富集纯度较高。
[0043] 本发明还提供了一种利用固定化脂肪酶纯化长链多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：(1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应；(2)从反应后的产物中分离出含有游离型PUFAs的游离脂肪酸。该方法将含有PUFAs游离脂肪酸，在脂肪酶催化作用下与醇类进行酯化反应，短碳链脂肪酸（碳数小于20）优先发生反应生成酯类，而PUFAs仍以游离脂肪酸形式存在，从而提高PUFAs的纯度，进而达到纯化效果。
[0044] 本发明还提供了一种利用固定化脂肪酶降低游离脂肪酸中短碳链脂肪酸含量的方法，所述方法包括：(1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应。该方法将含有PUFAs游离脂肪酸，在脂肪酶催化作用下与醇类进行酯化反应，短碳链脂肪酸（碳数小于20）优先发生反应生成酯类，进而达到降低游离脂肪酸中短碳链脂肪酸含量的效果。
[0045] 本发明还提供了一种利用固定化脂肪酶提高游离脂肪酸中长链多不饱和脂肪酸含量的方法，所述方法包括：(1)在抽真空或保护气氛下，在固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶存在下，使游离的脂肪酸与醇发生反应。该方法将含有PUFAs游离脂肪酸，在脂肪酶催化作用下与醇类进行酯化反应，短碳链脂肪酸（碳数小于20）优先发生反应生成酯类，而PUFAs仍以游离脂肪酸形式存在，进而达到提高游离脂肪酸中长链多不饱和脂肪酸含量的效果。
[0046] 参见图1，在该实例中，本发明利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus)富集长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的方法可以包括以下步骤：
[0047] 1）碱催化水解：在氮气保护下，一定量的KOH醇-水溶液和含有PUFA的油脂在60℃磁力搅拌条件下回流1小时，使油脂水解。反应结束后，加入一定量的水，用正己烷萃取出未皂化物，水化层用HCl酸化至pH=1，用正己烷萃取出游离脂肪酸，然后用无水Na2SO4干燥后，旋蒸或氮吹除去溶剂，得到游离脂肪酸。
[0048] 2）酶催化选择性酯化：按照一定比例，以醇类和步骤1）所得游离脂肪酸为底物，加入固定化TL脂肪酶，在抽真空或充氮环境下，反应，则碳数小于20的脂肪酸与醇类发生反应生成脂肪酸酯，而PUFAs依然以游离脂肪酸形式存在，从而达到将PUFAs与其他脂肪酸分离的效果。
[0049] 在本发明中，提供游离的脂肪酸的方法是现有技术人员熟知的方法，除图1所示的碱催化水解外，还可以包括但不限于酶法水解、高压高温水解等方法。
[0050] 在本发明中，“碱催化水解”是指一种制备游离脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入碱溶液，如NaOH-醇溶液，以催化油脂水解。
[0051] 在本发明中，“酶法水解”是指一种制备游离脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入水，并使用酶（包括但不限于固定化酶），例如脂肪酶、磷脂酶等作为催化剂在低温条件下使该混合物反应。本领域的技术人员清楚，固定化酶指的是固定在载体上的酶，例如固定化脂肪酶等。
[0052] 在本发明中，“高压高温水解”是指一种制备脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入水并使该混合物在高温高压条件下反应。
[0053] 在本发明中，要水解的原料油脂为富含长链多不饱和脂肪酸的油脂，包括但不限于深海鱼油、微生物油脂或其混合物，含有PUFAs的鱼油包括但不限于：沙丁鱼油、金枪鱼油、鲱鱼油、鳕鱼肝油、三文鱼油、鲔鱼油、鲑鱼油、鳝鱼油、鲭鱼油，微生物油脂包括蛋白限于DHA藻油和ARA油脂。
[0054] 在本发明中，所用醇类包括：碳数为1～12的一元醇类、乙二醇、丙二醇、甘油等。
[0055] 在本发明中，脂肪酸和醇的比例为摩尔比10:1～1:10。
[0056] 在本发明中，固定化酶可通过以下方法制备：称取40-100g弱碱性离子交换树脂于三角瓶(例如，容量为250-500ml)中，加入40-100ml TL酶液，在25-35℃摇床中150-300转/分钟（rpm）振荡2-8小时，然后将酶取出放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，得到固定化酶。
[0057] 在本发明中，固定化TL脂肪酶的使用量为反应底物质量（醇和脂肪酸质量）的1%～20%。
[0058] 在本发明中，抽真空条件下，反应容器内压强为0.1～1KPa。
[0059] 在本发明中，在充氮条件下，需要在反应1～3小时后，加入分子筛除水。
[0060] 在本发明中，反应温度为20～80℃。
[0061] 在本发明中，反应时间为2～24小时。
[0062] 在本发明中，所述离子交换树脂包括苯乙烯系树脂、丙烯酸系树脂、阳离子树脂(强酸性阳离子树脂和弱酸性阳离子树脂)、阴离子树脂(强碱性阴离子树脂和弱碱性阴离子树脂)等等。优选的，本发明所述离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂。在本发明中，所述弱碱性阴离子交换树脂主要交换基团为伯、仲、叔胺基的阴离子交换树脂。这类树脂含有弱碱性基团，如伯胺基(亦称一级胺基)-NH2、仲胺基(二级胺基)-NHR、或叔胺基(三级胺基)-NR2，它们在水中能离解出OH－而呈弱碱性。这种树脂的正电基团能与溶液中的阴离子吸附结合，从而产生阴离子交换作用。这种树脂在多数情况下是将溶液中的整个其他酸分子吸附。它只能在中性或酸性条件(如pH1～9)下工作。它可用Na2CO3、NH4OH进行再生。所述弱碱性阴离子交换树脂可从市场购买，如可从上海树脂有限公司、南开化工厂、浙江争光实业股份有限公司、晨光化工研究院树脂厂、江苏色可赛思树脂有限公司、美国Rohm&Hass公司、Success公司、Dow化学公司等购买获得。
[0063] 在本发明中，“长链多不饱和脂肪酸”指的是：碳链长度为20碳以上，不饱和度大于3的脂肪酸，包括但不限于二十二碳六烯酸（DHA）、和二十碳五烯酸（EPA）。
[0065] 在本发明的下述实施例中，使用的固定化TL脂肪酶采用以下方法制备：
[0066] 称取10-50g弱碱性离子交换树脂于250ml三角瓶中，加入10-50ml TL酶液，在4-60℃摇床中以10-200转/分钟（rpm）的速度振荡0.5-16小时，然后将酶取出放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥。
[0067] 其中，弱碱性离子交换树脂可以使用但不限于Amberlite IRA900C1，Amberlite FPA91C1，Amberlite FPA54，D301R，D392，D380，D382，D284，D280，JK206，NKX-8，DuoliteA-161，LX1000HA，Dowex1*2。
[0068] 在本发明的下述实施例中，甲酯化方法参考GB-T17376-2008；气相色谱分析条件参考GB-T17377-2008；
[0070] 实施例1DHA藻油中PUFAs的富集纯化
[0071] (1)碱催化水解：首先将36.8gKOH溶于70.4mL水和422.4mL95%乙醇，配制成KOH醇-水溶液，在氮气保护下，加入160g DHA藻油，50℃磁力搅拌条件下回流1小时，使油脂水解。反应结束后，加入381mL水，用500mL×2正己烷萃取出未皂化物，水化层用3N的HCl酸化至pH=1，用300mL×2正己烷萃取出游离脂肪酸，然后用无水Na2SO4干燥后，旋蒸除去溶剂，得到游离脂肪酸。
[0072] (2)称取9.57g步骤（1）中制备的游离脂肪酸和3g甘油（游离脂肪酸和甘油的摩尔比约为1:1）于50mL反应器内，加入10%固定化TL脂肪酶（以反应底物(即游离脂肪酸和甘油的总质量)质量计），在60℃的抽真空条件下（表压读数为0.2kPa）以250rpm的搅拌速率进行反应。反应每隔4小时进行取样，用薄层色谱（TLC）方法（展开剂为，正己烷:乙醚:甲酸=80:20:2）分离后，刮下游离脂肪酸条带，进行甲酯化处理，气相色谱（GC）分析测定游离酸中PUFAs的含量变化。
[0073] 表1固定化TL脂肪酶TL脂肪酶在不同反应时间内富集PUFAs的效果
[0074]
[0075] 利用自制固定化TL脂肪酶TL脂肪酶催化反应至8小时左右，DHA、DPA的含量由原DHA藻油的36.87%和14.38%分别提高到60%以上和21%以上。
[0076] 利用市售的商品酶 TL IM(购自诺维信公司)、 RM IM(购自诺维信公司)和 435(购自诺维信公司)进行对照实验，反应24小时，分析游离脂肪酸中PUFAs的含量变化。
[0077] 表2不同商品化脂肪酶催化反应24小时的富集效果
[0078]
[0079]
[0080] 对比数据可以看出，利用商品脂肪酶催化反应时长达24小时，PUFAs含量仍无显著变化。这可能是因为以上脂肪酶在本发明条件下无酯化选择性，无法达到本发明方法的富集效果。
[0081] 实施例2金枪鱼油中PUFAs的富集纯化
[0082] (1)碱催化水解：首先将13.2gNaOH溶于35mL水和211mL95%乙醇配制成NaOH醇-水溶液，在氦气保护下，加入80g金枪鱼油，55℃磁力搅拌条件下回流1.5小时，使油脂水解。反应结束后，加入190mL水，用250mL×2正己烷萃取出未皂化物，水化层用3N的HNO3酸化至pH=2，用200mL×2正己烷萃取出游离脂肪酸，然后用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去溶剂，得到游离脂肪酸（经气相分析，DHA和EPA的含量分别为23.16%和6.04%）。
[0083] (2)称取9.82g步骤（1）制备的游离脂肪酸8份,分别和如表3所示的醇（酸和醇的摩尔比为1:1）于50mL反应器内，加入10%固定化TL脂肪酶（以反应底物质量计），充氮保护，反应温度为60℃，搅拌速率250rpm，反应1小时后，加入3g4A分子筛，继续反应11小时。反应结束后，用TLC方法(展开剂为，正己烷:乙醚:甲酸=80:20:2)分离后，刮下游离脂肪酸条带，进行甲酯化处理，GC分析测定游离酸中PUFAs的含量变化，结果如表3所示。
[0084] 表3固定化TL脂肪酶在不同反应底物中富集PUFAs的效果
[0085]
[0086]
[0087] 表3数据显示，不同反应底物会对PUFAs富集效果产生影响。在上述反应条件下，使用丙三醇作为反应底物，金枪鱼油中DHA和EPA的含量分别从23.16%和6.04%分别提高到72.53%和9.88%。
[0088] 实施例3沙丁鱼油中PUFAs的富集纯化
[0089] (1)碱催化水解：首先将18gKOH溶于35mL水和210mL95%乙醇配制成KOH醇-水溶液，在氩气保护下，加入70g沙丁鱼油，60℃磁力搅拌条件下回流0.5小时，使油脂水解。反应结束后，加入200mL水，用200mL×2正己烷萃取出未皂化物，水化层用3N的HNO3酸化至pH=1，用200mL×2正己烷萃取出游离脂肪酸，然后用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去溶剂，得到游离脂肪酸。
[0090] (2)称取9.75g步骤（1）制备的游离脂肪酸7份，分别和月桂醇（游离酸和月桂醇的摩尔比如表4所示）于50mL反应器内，加入10%固定化TL脂肪酶（以反应底物质量计），在60℃的抽真空条件下（表压读数为0.7kPa）以250rpm的搅拌速率进行反应12小时。反应结束后，用TLC方法(展开剂为，正己烷:乙醚:甲酸=80:20:2)分离后，刮下游离脂肪酸条带，进行甲酯化处理，GC分析测定游离酸中PUFAs的含量变化，结果如表4所示。分析结果显示，在游离酸和月桂醇的摩尔比为1:1～1:10时，沙丁鱼油中DHA和EPA的含量分别从15.16%和14.23%提高至43%以上和38%以上。
[0091] 表4固定化TL脂肪酶在不同底物摩尔比时的富集效果
[0092]
[0093]
[0094] 实施例4鳕鱼肝油中PUFAs的富集纯化
[0095] (1)碱催化水解：首先将26.3gNaOH溶于70.4mL水和422.4mL95%乙醇配制成KOH醇-水溶液，在氮气保护下，加入150g鳕鱼肝油，65℃磁力搅拌条件下回流1.5小时，使油脂水解。反应结束后，加入381mL水，用500mL×2正己烷萃取出未皂化物，水化层用3N的HCL酸化至pH=1，用300mL×2正己烷萃取出游离脂肪酸，然后用无水CuSO4干燥后，旋蒸除去溶剂，得到游离脂肪酸。
[0096] (2)称取9.70g步骤（1）制备的游离脂肪酸（通过将鳕鱼肝油碱催化水解制的）7份，和3g甘油（游离酸和甘油的摩尔比约为1:1）于50mL反应器内，加入固定化TL脂肪酶（以反应底物质量计），脂肪酶用量如表5所示，在60℃的抽真空条件下（表压读数为0.3kPa）以250rpm的搅拌速率进行反应12小时。反应结束后，用TLC方法(展开剂为，正己烷:乙醚:甲酸=80:20:2)分离后，刮下游离脂肪酸条带，进行甲酯化处理，GC分析测定游离酸中PUFAs的含量变化，结果如表5所示。在酶用量为10%时，鳕鱼肝油中DHA和EPA的含量分别从9.13%和
9.56%提高到47.22%和43.15%。
9.56%提高到47.22%和43.15%。
[0097] 表5不同酶用量时PUFAs的富集效果
[0098]
[0099]
[0100] 实施例5鲱鱼油中PUFAs的富集纯化
[0101] (1)碱催化水解：首先将36.8gKOH溶于70.4mL水和422.4mL95%乙醇配制成KOH醇-水溶液，在氮气保护下，加入150g鲱鱼油，70℃磁力搅拌条件下回流2小时，使油脂水解。反应结束后，加入381mL水，用500mL×2正己烷萃取出未皂化物，水化层用3N的HCl酸化至pH=1，用300mL×2正己烷萃取出游离脂肪酸，然后用无水P2O5干燥后，旋蒸除去溶剂，得到游离脂肪酸。
[0102] (2)称取10.12g步骤（1）制备的游离脂肪酸5份，和3g甘油（游离脂肪酸和甘油的摩尔比约为1:1）于50mL反应器内，加入10%固定化TL脂肪酶（以反应底物质量计），在25℃～80℃的抽真空条件下（表压读数为0.3kPa）以250rpm的搅拌速率进行反应12小时。反应结束后，用TLC方法分离后，刮下游离脂肪酸条带，进行甲酯化处理，GC分析测定游离酸中PUFAs的含量变化，结果如表6所示。经气相色谱分析，原鲱鱼油中DHA和EPA的含量分别为8.24%和6.18%，在不同反应温度下，固定化TL脂肪酶的富集效果亦存在较大差别，温度太高会导致PUFAs的氧化。
[0103] 表6不同反应温度时固定化TL脂肪酶的富集PUFAs效果
[0104]
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