低温光显微镜和用于低温光显微术的浸没介质
阅读：755发布：2020-05-08
专利汇可以提供低温光显微镜和用于低温光显微术的浸没介质专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且乙 氧 基-九氟 丁烷 (C4F9OC2H5)用作用于浸没低温光 显微镜 的浸没物镜的浸没介质。低温光显微镜包括浸没物镜、保持浸没物镜的前透镜的前透镜安装件、样本保持件以及承载样本保持件的冷台，其还具有将热量流耦合到前透镜安装件中的加热装置。，下面是低温光显微镜和用于低温光显微术的浸没介质专利的具体信息内容。
1.一种用于在光显微术中浸没浸没物镜的浸没介质，其特征在于，浸没介质基本上利用氢氟醚制成。
2.一种将基本上利用氢氟醚制成的低温液体作为用于在光显微术中浸没浸没物镜的浸没介质的用途。
3.根据权利要求1所述的浸没介质或根据权利要求2所述的用途，其特征在于，氢氟醚选自乙氧基-九氟丁烷(C4F9OC2H5)和甲氧基-九氟丁烷(C4F9OCH3)。
4.根据权利要求3所述的浸没介质或用途，其特征在于，乙氧基-九氟丁烷(C4F9OC2H5)利用(CF3)2CFCF2OC2H5(CAS号163702-06-5)和/或CF3CF2CF2CF2CF2OC2H5(CAS号163702-05-4)制成。
5.根据权利要求2至4中的任一项所述的用途，其特征在于，待成像的样本在光显微术中保持在低温温度下。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，待成像的样本保持在从-130℃到-145℃的范围内的低温温度下。
7.根据权利要求2至6中的任一项所述的用途，其特征在于，热流在用于浸没物镜的前透镜的前透镜安装件处耦合到浸没流体。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，前透镜的背面利用干燥的氮气清理。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，热流被引导到承载样本保持件的冷台中。
10.一种低温光显微镜，所述低温光显微镜包括：
-浸没物镜，其包括物镜主体、浸没物镜、前透镜安装件以及加热装置，前透镜安装件在其外周处与物镜主体连接且在其中央处保持前透镜；
-样本保持件；以及
-冷台，其承载样本保持件，
其特征在于，加热装置被配置为能够将热流耦合到前透镜安装件的与物镜主体的连接结构附近。
11.根据权利要求10所述的低温光显微镜，其特征在于，前透镜安装件包括凸缘，凸缘保持前透镜并且覆盖前透镜的在前透镜的中央处的一部分，并且热流在前透镜的外周处通过加热装置耦合到凸缘。
12.根据权利要求11所述的低温光显微镜，其特征在于，在物镜透镜的未覆盖部分周围的区域中，凸缘被配置为能够在低温光显微镜的运行中浸没在浸没介质中。
13.根据权利要求11或12所述的低温光显微镜，其特征在于，凸缘利用具有不超过10-
5m/(m·K)的热膨胀系数和不超过10W/(m·K)的导热率的材料制成。
14.根据权利要求13所述的低温光显微镜，其特征在于，所述材料选自陶瓷、可加工陶瓷、玻璃陶瓷、可加工玻璃陶瓷、聚合物和聚酰胺-酰亚胺。
15.根据权利要求10至14中的任一项所述的低温光显微镜，其特征在于，加热装置连接到利用金属制成的物镜主体和前透镜安装件二者。
16.一种低温光显微镜，所述低温光显微镜包括：
-浸没物镜，
-样本保持件，
-冷台，其承载样本保持件，
其特征在于，冷台具有
-金属基部，样本保持件连接到金属基部的端面，
-隔热件，其围绕金属基部的端面，
-浸没流体储存器，其在样本保持件和隔热件之间径向延伸，并且具有在所述端面处围绕样本保持件的圆形开口，
-浸没流体供应通道，其延伸穿过隔热件。
17.根据权利要求16所述的低温光显微镜，其特征在于，温度传感器和台加热装置连接到金属基部，台加热装置比温度传感器更远离所述端面。
18.根据权利要求16或17所述的低温光显微镜，其特征在于，浸没物镜包括物镜主体、浸没物镜、前透镜安装件以及加热装置，前透镜安装件在其外周处与物镜主体连接且在其中央处保持前透镜，其中，加热装置被配置为能够将热流耦合到前透镜安装件的与物镜主体的连接结构附近。
19.根据权利要求18所述的低温光显微镜，其特征在于，前透镜安装件包括凸缘，凸缘保持前透镜并且覆盖前透镜的在前透镜的中央处的一部分，并且热流在前透镜的外周处通过加热装置耦合到凸缘。
20.根据权利要求19所述的低温光显微镜，其特征在于，在物镜透镜的未覆盖部分周围的区域中，凸缘被配置为能够在低温光显微镜的运行中浸没在浸没介质中。
21.根据权利要求19或20所述的低温光显微镜，其特征在于，凸缘利用具有不超过10-
5m/(m·K)的热膨胀系数和不超过10W/(m·K)的导热率的材料制成。
22.根据权利要求21所述的低温光显微镜，其特征在于，材料选自陶瓷、可加工陶瓷、玻璃陶瓷、可加工玻璃陶瓷、聚合物和聚酰胺-酰亚胺。
23.根据权利要求18至22中的任一项所述的低温光显微镜，其特征在于，加热装置连接到利用金属制成的物镜主体和前透镜安装件二者。
低温光显微镜和用于低温光显微术的浸没介质
技术领域
[0002] 此外，本发明涉及一种低温光显微镜。
背景技术
[0003] 闪速冻结细胞的低温荧光显微术由于无伪影固定和所用荧光团的极少的光漂白而脱颖而出。为了获得最高水平的分辨率，需要无像差浸没物镜以及精确匹配的浸没介质，而对于在水的玻璃化转变温度之下进行成像，两者都不存在。
[0004] 在低温温度下，荧光显微术本身具有显著的优势，并且对电子低温显微术提供重要补充1。特别是，在低温下漂白急剧减少2，同时许多荧光团的荧光产额增加3并且光谱带变窄4-7。在低温温度下的诸如STED8、PALM9、STORM或SIM10的现代超分辨率的应用具有这样的预期：以3D以分子分辨率对荧光蛋白成像并且将它们的定位与同一样本的电子低温显微术中所见的超微结构相关联2，3，11-16。与化学固定相比，低温固定提供原始状态的无偏、无畸变的表示。随着成像分辨率接近纳米级，这变得越来越重要。
[0005] 低温光显微术中的一个长期挑战是缺乏高数值孔径(NA：numerical aperture)显微镜物镜。物镜的数值孔径是决定其光收集效率和衍射极限分辨率的主要品质因数。大量的技术开发已经致力于基于为低温显微术优化的高NA空气物镜的用户友好平台17-19。然而，空气物镜在根本上局限于小于1的NA值。
[0006] 浸没物镜可以通过经由折射率大于1的浸没介质与样本物理接触而超越此限制。在室温下，这实际上是所有高分辨率光显微术的基础，但对于在水的玻璃化转变温度(～-
135℃)之下进行成像，没有令人满意的相配物。
135℃)之下进行成像，没有令人满意的相配物。
[0007] 仅适合于在-135℃之下的温度的浸没介质才能对包含生物样本的高压冻结水进行成像，而不会改变冻结水或其中的样本的结构。在该温度之上，样本中的非晶态水将转化为结晶水。由于结晶水的体积增加并且由于生物分子在固态水的结晶态和非晶态中的溶解度的变化，导致这种转化将影响样本；其也会改变样本的光学性能。
[0008] 特别是，对于在包含生物样本的高压冻结或急剧冻结水中不同深度的无像差成像，需要在135℃之下的温度具有折射率接近室温下的液态水的折射率的浸没介质。这特别适用于在低温光显微术中这种样本的位于样本表面下方的部分。
[0009] 过去已经提出了两种不同的低温浸没光显微术的方法。首先是将样本和物镜冷却至低温温度，从而避免系统中的热梯度。Larabell-小组20，21和Brecht7的小组遵循这种方法。两者均采用廉价的油浸物镜，油浸物镜可维持深层温度循环而不会损坏。然而，从未显示这种方法可用于复杂的生物成像浸没物镜。这些依赖于许多胶合且通常可调节的透镜组，这些透镜组需要针对在-135℃之下的温度进行复杂的重新设计。第二个挑战是对于该温度范围没有适当的折射率匹配介质可用。无像差成像需要折射率要在物镜设计值的至少～10-3RIU内(RIU＝折射率单位)。此外，介质需要光学透明、无荧光、无毒，并且在成像温度下具有低的蒸气压。此外，为了便于储存和处理，需要液态范围应扩展到室温之上。尽管Brecht小组发现1-丙醇(熔点-126℃)在-110℃下满足这些标准中的许多，但这仍显著高于水的玻璃化转变温度，并且不能推广到更低的温度。
[0010] 在文献中描述的第二种方法中，物镜保持温暖，同时样本与前透镜之间的温度下降保持＞150℃。Nahmani等通过在前透镜与置于低温冷却样本顶部上的盖玻片之间注入连续的温暖的乙醇/水混合物(70％乙醇)的流来完成此方法16。尽管成功地防止了冻结，但是乙醇/水混合物的折射率与物镜的设计不匹配。通常，由于存在热边界层和压力引起伪影的可能性，因此在此技术中获得准确且稳定的折射率匹配是很复杂的。
[0011] 根据https://en.wikipedia.org/wiki/Hydrofluoroether，氢氟醚(HFE：hydrofluoroether)是一种复合有机溶剂。作为不消耗臭氧的化学品，其最初被开发为CFC、HFC、HCFC和PFC的替代物。HFE不是自然产生的。其为无色、无气味、无味道、低毒性、低粘度且在室温下为液体。在室温下，其与水在视觉上无法区分开。
发明内容
[0014] 在一个方面中，本发明提供一种新的低温浸没介质，所述低温浸没介质基本上利用氢氟醚(HFE)制成，其与室温液态水的折射率和低温非晶态水的折射率相匹配。
[0015] 根据本发明的低温浸没介质是包括浸没介质和该浸没介质被设置用于浸没光显微术中的浸没物镜的标识的产品，浸没介质基本上利用氢氟醚制成。该浸没介质被设置用于浸没光显微术中的浸没物镜的标识可以特别是在供应有浸没介质的使用说明中或在保持浸没介质的容器上实施。
[0016] HFE可以特别是选自乙氧基-九氟丁烷(C4F9OC2H5)和甲氧基-九氟丁烷(C4F9OCH3)。如果HFE是乙氧基-九氟丁烷(C4F9OC2H5)，则其可以利用(CF3)2CFCF2OC2H5(CAS号163702-06-
5)和/或CF3CF2CF2CF2CF2OC2H5(CAS号163702-05-4)制成。
5)和/或CF3CF2CF2CF2CF2OC2H5(CAS号163702-05-4)制成。
[0017] HFE-7200或3MTM NovecTM 7200工程流体、见http://multimedia.3m.c om/mws/media/199819O/3mtm-novectm-7200-engineered-fluid.pdf是根据本发明的适合的浸没流体。其包括乙氧基-九氟丁烷(C4F9OC2H5)或特别是包括显示基本上相同性质的不可分离的异构体(CF3)2CFCF2OC2H5(CAS号163702-06-5)和CF3CF2CF2CF2CF2OC2H5(CAS号163702-05-4)中的一个或两个。在下文中，HFE-7200指的是本段中定义的乙氧基-九氟丁烷(C4F9OC2H5)。
[0018] 在约-140℃下，HFE-7200的折射率与室温下水的折射率基本相同。因此，HFE-7200可用作用于低温光显微术的具有商用水浸物镜的浸没介质。
[0019] HFE-7200或3MTM NovecTM 7200工程流体、见http://multimedia.3m.com/mws/media/199819O/3mtm-novectm-7200-engineer ed-fluid.pdf是根据本发明的另一适合的浸没流体。
[0020] 一种或两种以上的HFE的混合物或者一种或两种以上的HFE与其他低浓度物质的混合物、只要这些混合物仍满足折射率匹配的标准也是根据本发明的适合的浸没流体。这样的混合物的示例可以包括一种或两种以上的HFE与其他全氟化碳、常用溶剂或低温液体、包括2-甲基丁烷(异戊烷)、丙烷、乙烷、甲基环己烷、环己烷、甲基环戊烷。一般来说，根据本发明的浸没介质的非HFE含量不高于体积的33％；通常，其不高于体积的20％；多数情况下，其不高于体积的10％；通常，其不高于体积的3％；并且其可能非常接近于零，使得浸没介质可被视为纯HFE。
[0021] 在另一方面，本发明提供一种用于低温光显微镜的新技术构思，其中，物镜的主体和前透镜不处于热平衡。这个构思包括从前透镜安装件通过与前透镜接触的浸没介质向待被成像的样本提供热流。因此，特别是当在样本上使用玻璃盖时，浸没介质即使在其最靠近样本的部分中也处于至少略高于样本的温度。从而，样本甚至可以保持在浸没介质的冻结点或略低于冻结点，而不会冻结液体浸没介质。通常，用于低温光显微镜的新技术构思可适用于低至-196℃的低温温度。然而，这样低的样本温度可能需要对浸没物镜的工作距离和浸没介质的组成进行一些微调。
[0022] 在不进行任何微调而仅使用本发明的上述HFE浸没介质的情况下，待被成像的样本可以保持在从-130℃至-145℃的范围内的低温温度下。热流在用于浸没物镜的前透镜的前透镜安装件处耦合到浸没流体中。前透镜的背面可利用干燥的氮气来清理。热流可以被引导到承载样本保持件的冷台中。
[0023] 根据本发明的一种低温光显微镜包括：浸没物镜，其包括物镜主体、浸没物镜、前透镜安装件以及加热装置，前透镜安装件在其外周处与物镜主体连接且在其中央处保持前透镜；样本保持件；冷台，其承载样本保持件。加热装置将热流耦合到前透镜安装件的与物镜主体的连接结构附近。
[0024] 前透镜安装件可以包括凸缘，凸缘保持前透镜并且覆盖前透镜的在前透镜的中央处的一部分，并且热流在前透镜的外周处通过加热装置耦合到凸缘。凸缘利用具有不超过10-5m/(m·K)的热膨胀系数和不超过10W/(m·K)的导热率的材料制成。特别是，凸缘的材料选自陶瓷、可加工陶瓷、玻璃陶瓷、可加工玻璃陶瓷、聚合物和聚酰胺-酰亚胺。适合的陶瓷是 适合的聚合物是
[0025] 根据本发明的低温光显微镜中，加热装置连接到利用金属制成的物镜主体和前透镜安装件二者。
[0026] 在另一方面，根据本发明的一种低温光显微镜包括浸没物镜、样本保持件和承载样本保持件的冷台，冷台具有：金属基部，其优选地利用铝制成，样本保持件连接到金属基部的端面；隔热件，其围绕金属基部的端面；浸没流体储存器，其在样本保持件和隔热件之间径向延伸，并且具有在所述端面处围绕样本保持件的圆形开口；浸没流体供应通道，其延伸穿过隔热件。
[0028] 可以示出，本发明可以在表达荧光蛋白的大肠杆菌和酵母细胞中提供优异的对比度，并且在-140℃下解析在多色免疫标记人骨肉瘤上皮(U2OS：human bone osteosarcoma epithelial)细胞中的亚微米结构。
[0029] 在此指示的该温度和所有其他温度实际上是位于优选地利用铝制成的金属基部处的温度传感器的温度。因此，它们是附着到高导热金属部件的样本的温度，而不是准确的布置在样本与浸没物镜之间的浸没介质的最冷部分的温度。
[0031] 在下文中，针对附图中示出的优选示例性实施例进一步解释和描述本发明。
[0032] 图1示出了根据本发明的低温光显微镜的实施例的细节。(a)是具有用作隔热罩的利用可加工玻璃陶瓷 制成的前透镜安装件的浸没物镜的示意性剖面图。热量流过样本、盖玻片、浸没流体、前透镜和陶瓷安装件。可加工陶瓷的低热膨胀系数允许降低热应力。如图中所示， 的高热阻允许将大部分温度梯度限制在前透镜安装件中。(b)示出了用于实施低温浸没显微术的冷台被设计为通过结合加热和温度感应而将样本和低温浸没流体二者保持在稳定的温度。该台由底部的铜棒和顶部的阳极氧化铝柱两部分组成，底部的铜棒与液氮直接接触。样本放置在盖玻片下方的铝柱顶部上并与金属接触。盖玻片和样本通过使用铁垫圈和粘在铝柱内部的磁体而磁性固定到柱。浸没流体通过PTFE中的通道供应到储存器。PTFE中的开口允许在样本周围形成冷池。
[0033] 图2的(a)示出了利用针对浸没流体HFE-7200的低温浸没物镜在-140℃下测得的横向和轴向PSF。将PSF拟合到二维高斯(未示出)使得确定横向和轴向分辨率。强度被标准化并以对数标度示出。(b)示出了利用针对商用浸没流体W2010的低温浸没物镜在室温下测得的横向和轴向PSF。(c)示出了利用针对作为浸没流体的6％甘油(n＝1.337)的低温浸没物镜在室温下测得的横向和轴向PSF。折射率不匹配会产生正像差。(d)示出了利用针对浸没流体HFE-7200的低温浸没物镜在-90℃下测得的横向和轴向PSF。浸没流体在-90℃下的折射率小于水在室温下的折射率，从而产生负像差。(e)示出了利用0.75NA空气物镜在140℃下测得的横向和轴向PSF。(f)示出了利用空气物镜在室温下测得的横向和轴向PSF。(g)是在-140℃下测得的横向FWHM的2D热图。(h)是在-140℃下测得的轴向FWHM的2D热图。
[0034] 图3示出了利用原型低温浸没物镜的低温固定生物样本的成像。(a)示出了表达GFP的大肠杆菌的室温(左)和低温(右)宽场荧光图像。(b)示出了在大肠杆菌中表达的GFP的光漂白曲线。红色曲线示出了在室温下的衰减，蓝色曲线示出了在-140℃下的衰减。在低温条件下，GFP漂白被抑制约3.5倍。(c)示出了表达GFP标记的Pill的酵母细胞的室温(左)和低温(右)宽场荧光图像。(d)示出了在酵母细胞中表达的GFP的光漂白曲线。红色曲线示出了在室温下的衰减，蓝色曲线示出了在-140℃下的衰减。在低温条件下，GFP漂白被抑制约64倍。(e)示出了标记有AlexaFluor488(波形蛋白细胞骨架)、AlexaFluor594(Tom20线粒体蛋白)和DAPI(细胞核)的急剧冻结U2OS细胞的三色宽场低温荧光图像。
[0035] 图4比较了测得的PSF和对于NA＝1.15.26的水物镜的用PSFLab模拟的PSF。距玻璃载片的距离设置为0，并且玻璃载片上方和下方的折射率设置为图中报告的值。(a)示出了利用低温浸没物镜和HFE-7200浸没流体在-140℃下获得的横向和轴向PSF。强度被标准化并以对数标度示出。(b)示出了n＝1.334的模拟轴向PSF。(c)示出了利用低温浸没物镜和HFE-7200浸没流体在-130℃下获得的横向和轴向PSF。(d)示出了n＝1.329的模拟轴向PSF。(e)示出了利用低温浸没物镜和HFE-7200浸没流体在-90℃下获得的横向和轴向PSF。(f)示出了n＝1.329的模拟轴向PSF。(g)示出了利用低温浸没物镜和作为浸没流体的6％甘油(n＝1.337)在室温下获得的横向和轴向PSF。(h)示出了n＝1.337的模拟轴向PSF。
[0036] 图5示出了根据图1的低温光显微镜的低温台的其他细节。
具体实施方式
[0037] 本发明是一种在-140℃下进行浸没光显微术的新方法。在本发明中，新的浸没介质HFE-7200使低温温度下的室温水的折射率与物镜本身不处于热平衡的新技术构思相匹配。通过沿着陶瓷透镜安装件的与物镜主体的连接结构附近的周边主动加热陶瓷透镜安装件来保持温度下降(见图1)。这种方法的一个重要优点是：由于液体中的温度变化而导致的折射率梯度很小，并且不太可能使波前畸变。
[0038] 为了实现该方法，发明人从商业浸水生物成像物镜(Zeiss LD C-Apochromat 63×，NA＝1.15)开始，对低温浸没物镜进行原型设计。发明人选择该物镜主要是因为(I)它的长工作距离(600μm)，这有助于最小化向样本的热传递；以及(II)内置的校正环，其可用于校正剩余球差。为了防止冷凝和结霜，利用干燥的氮气连续清理物镜的内部。这是通过定制集成的通道实现的，这些通道穿过物镜主体并且终止于在利用可加工玻璃陶瓷制成的前透镜安装件中的孔。为了使物镜保持在25℃，所有热损失都通过电加热铜环来补偿，该铜环附接在物镜的金属壳体与陶瓷前透镜安装件之间的过渡处附近。
[0039] 为了寻找适合的浸没介质，发明人发现，部分氟化的液体乙氧基-九氟丁烷(HFE-7200：ethoxy-nonafluorobutane)在室温下具有令人惊讶的低折射率(1.28)以及从＞70℃到-140℃之下的液态范围。注意的是，HFE-7200还是便宜、无毒且对环境安全的。
[0040] 将新的低温浸没物镜与HFE-7200的光学性质相结合，发明人能够在-140℃下执行无球差的荧光低温显微术(图2(a))。
[0041] 为了找到最佳工作温度，发明人比较了其利用HFE-7200浸没的物镜的点扩散函数(PSF：point spread function)与在室温下使用标准介质(Zeiss W2010，n＝1.334)的PSF(图2(b))。作为参考，发明人还将该结果与在低温条件下和室温下的空气物镜(Zeiss LD Achroplan 63×/0.75，工作距离为2.8mm)的性能进行了比较(见图2(e)和(f)以及表1)。
[0042] 表1.使用原型低温浸没物镜(63×/1.15)在低温条件下(-140℃)和室温下测得的PSF的FWHM以及与空气物镜(63×/0.75)的比较。
[0043]
[0044] PSF的整体形状和对称性在-140℃(HFE-7200)下和在23℃(Zeiss W2010)下非常相似，这表明HFE-7200的折射率在该温度下与物镜的设计很好地匹配。重要的是，PSF在整个视场中都非常均匀(见图2中的2D热图)，这在宽视场和束扫描显微术中至关重要。PSF的对称性及其在整个场上的均匀性表明介质中不存在显著的横向折射率梯度。
[0045] 为了更定量地评估折射率匹配的水平，发明人对具有有意不匹配条件的PSF进行了各种测量。如图2(c)中所见，在室温下，使用6％甘油溶液(n＝1.337)会产生显著的正球差。在低温条件下，发明人观察到，当温度从-140℃升高到-130℃(图4)到-90℃(图2(d))时，负球差增加。
[0046] 浸没物镜相对于空气物镜的主要优点之一是其随～NA2增长的光收集效率。实际上，发明人测量到在-140℃下从63×/0.75空气物镜到根据本发明的63×/1.15浸没物镜，亮度增大5.7±0.6倍。这与宽场荧光成像的预期比例因子～NA4一致。
[0047] 作为本发明的可能应用的展示，发明人对表达绿色荧光蛋白(GFP：green fluorescent protein)的大肠杆菌细胞、表达GFP标记的Pil1的酵母细胞以及免疫染色的人骨肉瘤上皮细胞(U2OS)进行了成像(见图3)。在活的环境条件下和在低温条件下急剧冻结后对大肠杆菌和酵母细胞进行成像。
[0048] 低温条件下低温固定和成像的好处对于酵母细胞特别明显(图3(c))。在光漂白被抑制了约64倍的低温条件下，信噪比和图像质量都得到相当大的改善(图3(d))。在低温固定细胞中，荧光信号也出现在室温下较暗的位置。这可能是由于某些特定生物分子在低温下的自发荧光增加或者由于在样本制备和急剧冻结期间引入的变化而导致的。可观察到在活的大肠杆菌和低温固定的大肠杆菌的图像中没有特别的结构差异(图3(a))。在室温下，细菌中表达的GFP已经相对缓慢地漂白，并且在低温条件下该速率仅被抑制3.5倍(图3(b))。
[0049] 此外，发明人确立了通过使用本发明的多色低温荧光显微术解析亚微米细胞结构的可能性。图3示出了在-140℃下免疫染色的U2OS细胞在宽场荧光中可获得的图像质量。线粒体(用AlexaFluor594修饰抗体进行免疫标记的Tom20)和波形蛋白丝(AlexaFluor488)的网络被同时很好地解析。这一令人惊讶的发现表明，HFE-7200的色散也一定接近物镜的设计。然而，将需要更详细的测量来定量评估横向和轴向色差。
[0050] 总的来说，发明人展示了一种新的概念，以在利用可商购浸没物镜的高NA低温荧光显微术中实现衍射受限性能。为了实现这一点，发明人通过将物镜的金属前透镜安装件替换为围绕其周边进行加热的绝缘陶瓷安装件，在样本周围建立了隔热微环境。进一步的实现步骤是找到浸没介质HFE-7200，所述浸没介质在水的玻璃化转变温度之下的样本温度下提供精确的折射率匹配。令人惊讶的是，尽管物镜的前透镜利用通过粘合剂结合的两个单独的元件制成，但是发明人在数百小时的使用后未观察到任何损坏。前透镜与陶瓷透镜安装件之间的结合也保持稳定。这种情况可能是由于所有胶合的组件都具有非常相似的热膨胀系数并且尺寸仅为几毫米。
[0051] 一些限制仍有待解决。首先，发明人使用的物镜仅提供1.15的数值孔径。尽管可以预期的是本发明的热隔离前透镜的构思也将适用于NA＞1.4的油物镜，但是之后需要确定新的浸没介质。由于存在许多相比于HFE-7200具有更高折射率和宽液态范围的无毒流体，因此这可能是可行的。
[0052] 其次，低温下的轴向PSF为室温下的～1.7倍。在某种程度上，这可能是由于台的漂移和振动的结合导致的，台的漂移和振动在当前系统中都是很重要的。另一个因素可能是在整个浸没介质中存在小的轴向温度梯度。因为根据本发明的低温光显微镜固有地远离热平衡来运行，所以这是不可避免的。然而，仍然可以通过降低物镜主体的温度或通过进一步增大透镜安装件的热阻来减少温度下降。重要的是，有证据表明，来自物镜的连续热传递仍不会显著加热样本。当在浸没中成像时，由于在PSF表征中使用的荧光珠的强度意想不到的增大，因此可能能测量到大的温度升高。然而，这没有被观察到。
[0053] 本发明将使包括TIRF或STED在内的高级光显微术与电子低温光显微术相结合，以帮助阐明在亚细胞和分子尺寸下的结构与功能之间的联系。
[0054] 方法
[0055] 样本制备
[0056] 荧光纳米珠沉积
[0057] 将直径 且发射峰波长λem＝525nm的荧光珠(Merck Millipore，)沉积在直径为5mm的#1.5圆形盖玻片(德国埃德尔明德的Engelbrecht GmbH)的表面上。等离子体清洁盖玻片，将盖玻片在1％聚-L-赖氨酸(美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich)中培养5分钟，用去离子水冲洗盖玻片，然后用25μl的珠溶液(3.4×108pt/ml)覆盖盖玻片。将颗粒悬浮液在真空室中干燥2小时。
[0058] 大肠杆菌细胞制备
[0059] 为了蛋白质表达，将质粒pQE-31-GFP转移到大肠杆菌表达菌株BL21-CP-RIL中。将细菌在LB培养基琼脂平板中培养。选择荧光菌落，并在液体LB培养基中进一步培养荧光菌落。在Formvar/Carbonkely上在活体成像或急剧冻结的环境条件之前，用去离子水代替生长培养基，这是因为所有胶合的组件都涂覆有TEM网格(Plano GmbH)。将网格吸干并使用自制的冻结装置浸入液氮冷却的丙烷中。将样本浸没储存在液氮中，以供以后成像。
[0060] 酵母细胞制备
[0061] 在液体YPD培养基中培养表达Pil1-GFP的酵母细胞。在成像或急剧冻结的环境条件之前，用去离子水代替生长培养基。在将酵母细胞固定在聚-L-赖氨酸(美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich)覆盖的盖玻片上之后，执行室温显微术。为了制备低温显微术的样本，使用直径3mm、厚50μm的聚-L-赖氨酸覆盖的蓝宝石圆盘(瑞士森瓦德的Engineering Office M.Wohlwend GmbH)。通过在液氮冷却的丙烷中急剧冻结而使细胞玻璃化。用滤纸除去多余的水。将样本浸没储存在液氮中，以供以后成像。
[0062] U2OS细胞制备
[0063] 在37℃和5％的CO2下在DMEM、高葡萄糖、补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(德国达姆施塔特的Merck Millipore)的GlutaMAX培养基(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific)、1mM丙酮酸钠(美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich)和10％(v/v)的胎牛血清(Merck Millipore)中培养人类U2OS细胞。将细胞接种到蓝宝石晶体圆盘(瑞士森瓦德的Engineering Office M.Wohlwend GmbH)上并且过夜生长。在37℃下利用预热的PBS中4％甲醛(137mM NaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，pH 7.4)固定细胞10分钟，然后用PBS中0.5％(v/v)的Triton-X-100萃取细胞，用PBS中5％(w/v)牛血清白蛋白封闭细胞，并且与针对线粒体蛋白Tom20(美国加利福尼亚州圣克鲁斯的Santa Cruz Biotechnology)和波形蛋白(Sigma-Aldrich)的多克隆抗体一起培养1小时。在用PBS洗涤五次并用PBS中10％(w/v)BSA封闭后，利用以Alexa Fluor 594(Life Technologies)定制标记1小时的二次羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen)或羊抗兔抗体(美国宾夕法尼亚州西格罗夫的Jackson ImmunoResearch实验室)检测第一抗体。用PBS洗涤样本五次，并且用包含2.5μg/ml DAPI(Sigma-Aldrich)的PBS覆盖样本。通过在液氮冷却的丙烷中急剧冻结而使细胞玻璃化。将样本浸没储存在液氮中，以供以后成像。
[0064] 光学设置和图像采集
[0065] 所有实验均使用配备有紧凑型汞光源(HXP 120，LEJ)的立式显微镜(ZEISS Axio Scope.A1)执行。将显微镜的机械台替换为安装在30×15cm的模拟板上的压电台(3-AxisNanoMax台，Thorlabs)(见图5)。模拟板固定到显微镜载物台。在这种配置下，台可以沿x、y和z轴移动4mm的跨度。压电仅在成像期间用于驱动台沿z轴的移动。使用显微镜的聚焦驱动执行物镜接近和聚焦期间的轴向运动。压电台和相机二者通过μManager22控制。
[0067] 包括金属棒的冷台保持悬浮在用作散热器的液氮容器内。利用可加工玻璃陶瓷制成并粘在铜棒周围的板用于将棒磁性地固定到通过压电台移动的刚性铝悬臂。这种配置使通过沸腾的液氮传递到台的振动最小化，同时，使传递到压电台的热最小化，从而仅使金属棒保持冷却。
[0068] 支撑样本的金属棒由为铜的底部部分和为阳极氧化铝的顶部部分组成。在两个部分之间放置130μm厚的石墨片，以使接合处的热梯度最大化。使用PT100传感器和NiCr加热器控制顶部部分的温度。通过向加热器施加最大30W的功率，可以稳定保持最高-90℃的温度。
[0069] 将样本放置在与阳极氧化铝突出柱直接接触的位置。凹槽(直径3.2mm，深度100μm)允许将TEM网格和50μm厚的蓝宝石圆盘放置在盖玻片下方，并避免损坏生物样本。重要的是，当在TEM网格和蓝宝石圆盘上对生物样本进行成像时，用低温浸没流体填充样本载体和盖玻片之间的空间。使用放置在盖玻片顶部上的铁垫圈的磁性固定将样本固定到台。为此，在样本下方的铝棒内胶合磁体。低温固定样本恰好在成像之前从液氮转移到干燥箱内的台上。在转移期间，台的温度保持在约-180℃。在将样本固定到台后，将温度升至-150℃，并且浸没流体在预冷至-90℃后被供应到在PTFE杯与铝顶部棒之间打开的储存器中。液体在流入插入PTFE并与金属台接触的针内时被冷却到台的温度。围绕支撑样本的柱的杯的开口使得能够在样本顶部上形成液体冷池并与低温物镜接触。
[0070] 空气物镜(Zeiss LD Achroplan 63×，NA＝0.75，工作距离2.8mm)和低温浸没物镜( 前透镜安装件-Zeiss LD C-Apochromat 63×，NA＝1.15)二者在运行期间安装在显微镜转台上。低温浸没物镜安装在专门设计的贸易适配器上，所述适配器用熔融的二氧化硅倾斜窗密封，并配备有允许将氮气冲洗通过低温物镜主体的进气管。氮气从物镜的前透镜安装件中的孔离开物镜。通过控制安装在陶瓷前透镜安装件与金属物镜主体之间的连接结构处的加热环的温度，将物镜主体温度保持在25℃。
[0071] 在成像前，缓慢升高台，使前透镜物镜与浸没流体接触。当对低温固定的生物样本成像时，在该方法阶段过程中，台的温度保持在-150℃。在约10-15分钟之后，估计足以使前透镜冷却下来的时间，将台的温度升高至-140℃并执行聚焦。
[0072] 点扩散函数测量
[0073] 使用安装在2.5×扩束器上的2560×2160的6.48μm像素(Andor，Neo)的前照式CMOS相机和滤光器组38HE(Zeiss)获得直径 且发射峰波长λem＝525nm(Merck Millipore， )的亚分辨率聚苯乙烯珠的荧光图像。仅使用了相机框架的50％，并且所有测量的积分时间均设置为200ms。沿着z轴以200nm的步长对珠进行采样。在室温下测量W2010浸没流体和6％甘油的PSF。在低温条件下，在-90℃与-140℃之间的温度范围以10℃的步长测量HFE 7200的PSF。利用空气物镜(Zeiss LD Achroplan 63×，NA＝0.75，工作距离为2.8mm)测量空气的PSF。
[0074] 在同一样本点上测量PSF，用于比较强度值。遵循以下方法：(i)在环境条件下利用空气物镜成像；(ii)在低温条件下使台冷却并且利用空气物镜成像；(iii)在台中注射HFE-7200，并在低温条件下利用低温浸没物镜成像；(iv)将台加热至室温，并且利用具有W2010浸没流体的低温浸没物镜成像。当台达到室温时，HFE 7200会在几分钟内蒸发而不会留下任何痕迹，从而允许将W2010放在样本的顶部上以在室温下执行成像。使用Fiji进行图像处
23
理和分析 。在使用插件Deconvolutionlab2进行反解卷积以校正珠的有限尺寸后，使用插件GDSC SMLN测量FWHM值24。
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理和分析 。在使用插件Deconvolutionlab2进行反解卷积以校正珠的有限尺寸后，使用插件GDSC SMLN测量FWHM值24。
[0075] 对大肠杆菌和酵母细胞成像
[0076] 使用安装在2.5×扩束器上的512×512 16μm像素(Andor，IXON 987)的背照式EMCCD和滤光器组38HE(Zeiss)获得大肠杆菌和酵母细胞的荧光图像。对于大肠杆菌，发明人使用了10ms的积分时间和EM增益20。对于酵母细胞，积分时间提高到100ms且EM增益达到50。
[0077] 通过将样本连续暴露于显微镜灯下，在室温和-140℃下执行光漂白测定。以250ms的间隔记录图像，总曝光时间为2分钟。发明人从包含整个细胞的边界内的信号的平均强度中减去背景的平均强度。对于低温条件下的酵母细胞的图像，选择该边界以仅包含Pil1点。为了校正漂移，使用用于图像StakReg堆栈的递归对正的Fiji插件来对图像进行对正25。发明人将漂白率计算为定义为τ＝R t·I(t)dt/R I(t)dt的衰减曲线的积分τ。
[0078] 对U2OS细胞成像
[0079] 使用配备有CCD相机1262×10316.45μm像素(Clara，Andor)和滤光器组D/F/T(Dapi，FITC，Texas Red)的白光共聚焦显微系统(Revolution DSD，Andor)的宽场形式获得免疫标记的人类U2OS细胞的荧光图像。每个通道的积分时间设置为2s。使用Fiji进行图像处理和分析23。
[0080] 本发明的有利开发从权利要求书、说明书和附图得到。在说明书开始时提到的特征的优点和多个特征的组合的优点仅作为示例，并且可以可替代地或累积地使用，而根据本发明的实施例不是必须具备这些优点。在不改变所附权利要求所限定的保护范围的情况下，以下内容适用于原始申请和专利的公开内容：其他特征可以从附图中得出、特别是从示出的设计和多个组件相对于彼此的尺寸以及它们的相对布置和它们的有效连接结构中得出。本发明的不同实施例的特征的组合或独立于权利要求的所选择的引用的不同权利要求的特征的组合也是可能的，并且有动机这样做。这也涉及在不同的附图中所示出或在描述它们时所提到的特征。这些特征也可以与不同权利要求的特征组合。此外，可能的是，本发明的其他实施方式不具有权利要求中提到的特征。
[0081] 权利要求书中和说明书中提到的特征的数字将被理解为覆盖该确切数字和比所提到的数字大的数字，而不必须明确地使用副词“至少”。例如，如果提到元件，则这将理解为使得存在确切的一个元件或存在两个或更多的元件。可以将附加特征添加到这些特征中，或者这些特征可以是相应产品的唯一特征。
[0082] 参考资料
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