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一种维生素B12 发酵补料培养基及补料方法

阅读：898发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种维生素B12 发酵补料培养基及补料方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种B12 发酵补料培养基及补料方法，提供可维持发酵中后期菌体生长繁殖并持续合成维生素B12的发酵补料培养基及补料方法。通过在不同发酵阶段进不同的补料，在不同阶段将总糖、甜菜碱、溶氧量、甘氨酸控制到到最适宜的含量，平衡发酵中后期菌体生和代谢关系，充分改善菌体老化发空现象，提高发酵单位；解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学性质。，下面是一种维生素B12 发酵补料培养基及补料方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种维生素B12 发酵补料培养基补料方法，所述维生素B12发酵补料培养基用于以脱氮假单孢菌为生产菌种发酵生产维生素B12的发酵过程中，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：在发酵25-35小时，当总糖含量低于5.0％时补入补料A，所述补料A至少包括葡萄糖；
步骤2：在发酵35小时后，当甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B，所述补料B至少包括甜菜碱；
步骤3：从步骤1开始补入补料A到发酵70小时，控制总糖含量在4％-5％，发酵70小时后控制总糖含量3.0％-4.0％至放罐；
步骤4：从步骤2开始补入补料B到发酵至130-150小时，控制甜菜碱含量在3％-5％，发酵130-150小时后不再补加甜菜碱；
步骤5：在发酵过程的前20小时，将发酵液溶氧量控制在15％-25％，在发酵过程的20小时后，将发酵液溶氧量控制在5％-15％；
步骤6：从发酵到发酵至130-150小时，补加补料C，所述补料C至少包括甘氨酸和氯化胆碱，控制甘氨酸含量在0.2-0.5％。
2.根据权利要求1所述的维生素B12发酵补料培养基补料方法，其特征在于：所述补料A为葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，5-6二甲基苯并咪唑0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-
0.5g/L。
3.根据权利要求1所述的维生素B12发酵补料培养基补料方法，其特征在于：所述补料B为甜菜碱250-500g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，5-6二甲基苯并咪唑0.3-0.7g/L,消泡剂0.2-
0.5g/L。
4.根据权利要求1所述的维生素B12发酵补料培养基补料方法，其特征在于：所述补料C为甘氨酸300-600g/L，氯化胆碱20-50g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，5-6二甲基苯并咪唑0.3-
0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L。
5.一种维生素B12发酵补料培养基，其特征在于：所述维生素B12发酵补料培养基包括补料A、补料B及补料C，所述补料A至少包括葡萄糖、氯化钴、5-6二甲基苯并咪唑和消泡剂，所述补料B至少包括甜菜碱、氯化钴、5-6二甲基苯并咪唑和消泡剂，所述补料C至少包括甘氨酸、氯化胆碱、氯化钴、5-6二甲基苯并咪唑和消泡剂。

说明书全文

一种维生素B12发酵补料培养基及补料方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及B12发酵补料培养基及补料方法。

背景技术

[0002] 维生素B12又叫钴胺素，是唯一含金属元素的维生素。维生素B12是以脱氮假单孢菌为发酵菌株，发酵生产出来的一类维生素。维生素B12主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。是神经系统功能健全不可缺少的维生素。

[0003] 现有技术中，以脱氮假孢菌做出发菌株发酵过程中，需要补入甜菜碱。甜菜碱能促进细胞表面分泌代谢产物以刺激细菌产生维生素B12。此外，甜菜碱是维生素B12生产过程中的甲基供体，同时甜菜碱脱甲基后形成的甘氨酸作为氮源参与了菌体的生长代谢。

[0004] 但是维生素B12是一种初级代谢产物，它跟菌体的生长密切相关，高浓度甜菜碱会抑制菌体生长，不利于维生素B12的合成。因此，在脱氮假单胞菌发酵产维生素B12的过程中，一般采用分次补加工艺，以维持甜菜碱浓度又不致过大而对菌体生长产生负面影响。这种方式在菌体生长代谢旺盛的阶段可达到较好的效果，但是在130小时后的发酵中后期阶段，随着菌体的生长代谢减弱，菌体对甜菜碱的分解代谢减弱，甘氨酸和甲基的供给也随之减弱，这又进一步影响到菌体的生长和维生素B12的合成。

[0005] 因此在菌体生长后期如何在保证菌体生长不受抑制的情况下，又能保证甘氨酸和甲基的供应对菌体的生长和维生素B12的合成十分重要。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种可维持发酵中后期菌体生长繁殖并持续合成维生素B12的补料方法。同时平衡发酵中后期菌体生和代谢关系，充分改善菌体老化发空现象，提高发酵单位。

[0007] 本发明的技术方案为一种维生素B12发酵补料培养基补料方法，所述维生素B12发酵补料培养基用于以脱氮假单孢菌为生产菌种发酵生产维生素B12的发酵过程中，包括以下步骤：

[0008] 步骤1：在发酵25-35小时，当总糖含量低于5.0％时补入补料A，所述补料A至少包括葡萄糖；

[0009] 步骤2：在发酵35小时后，当甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B，所述补料B至少包括甜菜碱；

[0010] 步骤3：从步骤1开始补入补料A到发酵70小时，控制总糖含量在4％-5％，发酵70小时后控制总糖含量3.0％-4.0％至放罐；

[0011] 步骤4：从步骤2开始补入补料B到发酵至130-150小时，控制甜菜碱含量在3％-5％，发酵130-150小时后不再补加甜菜碱；

[0012] 步骤5：在发酵过程的前20小时，将发酵液溶氧量控制在15％-25％，在发酵过程的20小时后，将发酵液溶氧量控制在5％-15％；

[0013] 步骤6：从发酵到发酵至130-150小时，补加补料C，所述补料C至少包括甘氨酸和氯化胆碱，控制甘氨酸含量在0.2-0.5％。

[0014] 而且，补料A为葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，5-6二甲基苯并咪唑0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L。

[0015] 而且，补料B为甜菜碱250-500g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，5-6二甲基苯并咪唑0.3-0.7g/L,消泡剂0.2-0.5g/L。

[0016] 而且，补料C为甘氨酸300-600g/L，氯化胆碱20-50g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，5-6二甲基苯并咪唑0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L。

[0017] 一种维生素B12发酵补料培养基，所述维生素B12发酵补料培养基包括补料A、补料B及补料C，所述补料A至少包括葡萄糖、氯化钴、5-6二甲基苯并咪唑和消泡剂，所述补料B至少包括甜菜碱、氯化钴、5-6二甲基苯并咪唑和消泡剂，所述补料C至少包括甘氨酸、氯化胆碱、氯化钴、5-6二甲基苯并咪唑和消泡剂。

[0018] 本发明的有益效果在于提供一种可维持发酵中后期菌体生长繁殖并持续合成维生素B12的发酵补料培养基及补料方法。同时解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏作用，平衡发酵中后期菌体生和代谢关系，充分改善菌体老化发空现象，提高发酵单位。

具体实施方式

[0019] 下面结合实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。

[0020] 下述实施例的菌种选用脱氮假单孢菌：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量：pH6～8；菌体OD600在10～15；镜检无杂菌；菌体形态匀实，不发空。

[0021] 下述实施例中采用脱氮假单孢菌发酵生产维生素B12的工艺采用常规种子培养工艺和发酵培养工艺。

[0022] 种子培养工艺：首先将种子培养基灭菌并冷却至25～30℃，并用无菌空气保压,然后在火焰保护下，将已经培养好的脱氮假单胞菌母瓶种子按照1～3％的接种量接入种子培养基中进行种子培养，至菌体OD600在10～15，pH值6～8，培养时间20～40h时移种，移种比例控制在5～l0％；

[0023] 发酵培养工艺：先将发酵培养基灭菌，冷却至20～30℃,并用无菌空气保压，然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵培养过程中，温度控制在32～33℃，空气流量控制在0.8～3m3/h，搅拌转速控制在200～400r/min，pH控制在6.5～7.5，培养时间180～200h时终止发酵。

[0024] 实施例1

[0025] 1、一级种子培养：种子液体积为3L

[0026] 种子培养基：在15L一级种子罐中加入蔗糖400-600g、玉米浆120-150g、甜菜碱40-60g、氧化镁3.5-5g、磷酸氢二铵20-30g、硫酸锌0.5-1g、碳酸钙30-50g、5-6二甲基苯并咪唑
0.7-1.4g、硫酸铵10-20g、磷酸二氢钾10-20g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力
0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间30分钟。冷却并用无菌空气保压，压力控制在
0.01-0.02MPa，然后在火焰保护下，将已经培养好的脱氮假单胞菌母瓶种子按照1～3％的接种量接入种子培养基中进行种子培养，至菌体OD600在11.3，pH值6.08，培养时间20～40h时移种，移种比例控制在5～l0％。

[0027] 2、发酵培养：发酵液体积为30L

[0028] 发酵培养基：在50L 发酵罐中加入蔗糖2500-4000g、玉米浆1500-2500g、5-6二甲基苯并咪唑2-3g、磷酸氢二铵25-35g、硫酸锌5-8g、碳酸钙40-60g、磷酸二氢钾30-60g、氧化镁30-60g、氯化钴4-6g、尿素15-30g、甜菜碱800-1200g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：
温度122～123℃；时间40分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MP，然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵培养过程中，温度控制在32～33℃，空气流量控制在0.8～3m3/h，搅拌转速控制在200～400r/min,pH控制在6.5～7.5，培养时间
200h时，pH7.21，糖2.1终止发酵。

[0029] 3、补料培养基配制：

[0030] 3.1补料A的组成为：葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，5-6二甲基苯并咪唑(DMBI)0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0031] 3.2补料B的组成为：甜菜碱250-500g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI(即5-6二甲基苯并咪唑)0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0032] 3.3所述补料C的组成为：甘氨酸300-600g/L，氯化胆碱20-50g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0033] 3.4以上物料分别以培养基重量体积比配制后，湿热灭菌。

[0034] 4、过程补料控制：

[0035] 4.1在发酵25-35小时期间，当总糖低于5.0％时补入补料A；

[0036] 4.2在发酵35小时后，甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B；

[0037] 4.3从开始补糖至发酵70小时控制总糖在5％-4.0％，70小时后控制总糖4.0％-3.0％至放罐，其中总糖含量采用DNS测糖法检测；

[0038] 4.4从开始补加甜菜碱开始，到发酵至130-150小时，控制甜菜碱在5％-3％，130-150小时后不再补加甜菜碱；甜菜碱含量采用高效液相色谱检测；

[0039] 4.5在发酵过程的前20小时，发酵液溶氧控制在15％-25％，在发酵过程的20小时后，发酵液溶氧控制在5％-15％；溶氧含量采用溶氧电极监测；

[0040] 4.6在发酵到发酵至130-150小时，补加补料C，控制甘氨酸含量在0.2-0.5％；甘氨酸含量采用高效液相色谱检测。在上述过程补料控制的检测方法中，当检测到含量偏低时就进行相应的补料，当检测到含量偏高时不补料等待其消耗。

[0041] 5、对照实例：

[0042] 5.1与上1.2条相同。

[0043] 5.2补料A的组成为：葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0044] 5.3补料B的组成为：甜菜碱250-500g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L。

[0045] 6、过程控制

[0046] 6.1在发酵25-35小时，当总糖低于5.0％时补入补料A；

[0047] 6.2在发酵35小时后，甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B；

[0048] 6.3从开始补糖至发酵70小时控制总糖在5％-4.0％，70小时后控制总糖4.0％-3.0％至放罐；

[0049] 6.4在发酵过程的前20小时,发酵液溶氧控制在15％-25％，在发酵过程的20小时后，发酵液溶氧控制在5％-15％。

[0050] 7、试验结果数据：

[0051]

[0052]

[0053] 实验例2

[0054] 1、一级种子培养：种子液体积为6L

[0055] 种子培养基:在15L一级种子罐中加入蔗糖800-1200g、玉米浆240-400g、甜菜碱80-120g、氧化镁7-10g、磷酸氢二铵40-60g、硫酸锌1-2g、碳酸钙60-100g、5,6-二甲基苯并咪唑1.4-3g、硫酸铵20-30g、磷酸二氢钾20-30g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力
0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间30分钟。冷却并用无菌空气保压，压力控制在
0.01-0.02MPa，然后在火焰保护下，将已经培养好的脱氮假单胞菌母瓶种子按照1～3％的接种量接入种子培养基中进行种子培养，至菌体OD600在12.4，pH值6.18，培养时间20～40h时移种，移种比例控制在5～l0％。

[0056] 2、发酵培养：发酵液体积为60L；

[0057] 发酵培养基：在100L发酵罐中加入蔗糖5000-7000g、玉米浆3000-5000g、5-6二甲基苯并咪唑4-6g、磷酸氢二铵50-80g、硫酸锌10-20g、碳酸钙80-120g、磷酸二氢钾60-100g、氧化镁60-100g、氯化钴8-12g、尿素30-50g，甜菜碱1600-2400g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：温度122～123℃；时间40分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MP，然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵培养过程中，温度控制在32～33℃，空气流量控制在1.5～6m3/h，搅拌转速控制在200～400r/min，pH控制在6.5～
7.5，培养时，192h时，pH7.11，糖2.3，终止发酵。

[0058] 3、补料培养基配制：

[0059] 3.1补料A的组成为：葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0060] 3.2补料B的组成为：甜菜碱250-500g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0061] 3.3所述补料C的组成为：甘氨酸300-600g/L，氯化胆碱20-50g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0062] 3.4以上物料分别以培养基重量体积比配制后，湿热灭菌。

[0063] 4、过程补料控制：

[0064] 4.1在发酵25-35小时，当总糖低于5.0％时补入补料A；

[0065] 4.2在发酵35小时后，甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B；

[0066] 4.3从开始补糖至发酵70小时控制总糖在5％-4.0％，70小时后控制总糖4.0％-3.0％至放罐，其中总糖含量采用DNS测糖法检测；

[0067] 4.4从开始补加甜菜碱开始，到发酵至130-150小时，控制甜菜碱在5％-3％，130-150小时后不再补加甜菜碱；甜菜碱含量采用高效液相色谱检测；

[0068] 4.5在发酵过程的前20小时,发酵液溶氧控制在15％-25％,在发酵过程的20小时后，发酵液溶氧控制在5％-15％；溶氧含量采用溶氧电极监测；

[0069] 4.6在发酵到发酵至130-150小时，补加补料C，控制甘氨酸含量在0.2-0.5％；甘氨酸含量采用高效液相色谱检测。

[0070] 5、对照实例：

[0071] 5.1与上1.2条相同；

[0072] 5.2补料A的组成为：葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0073] 5.3补料B的组成为：甜菜碱250-500g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L。

[0074] 6.过程控制

[0075] 6.1在发酵25-35小时，当总糖低于5.0％时补入补料A；

[0076] 6.2在发酵35小时后，甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B；

[0077] 6.3从开始补糖至发酵70小时控制总糖在5％-4.0％，70小时后控制总糖4.0％-3.0％至放罐；

[0078] 6.4在发酵过程的前20小时,发酵液溶氧控制在15％-25％，在发酵过程的20小时后，发酵液溶氧控制在5％-15％。

[0079] 7、试验结果数据：

[0080]类别发酵周期发酵单位
实验例 192小时 247mg/L
对照例 192小时 213mg/L

[0081] 实验例3

[0082] 1.一级种子培养：种子液体积为60L

[0083] 种子培养基:在100L一级种子罐中加入蔗糖6400-9600g、玉米浆1920-3000g、甜菜碱640-1000g、氧化镁56-100g、磷酸氢二铵320-500g、硫酸锌8-12g、碳酸钙480-720g、5,6-二甲基苯并咪唑11.2-15g、硫酸铵160-240g、磷酸二氢钾160-240g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间30分钟。冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，然后在火焰保护下，将已经培养好的脱氮假单胞菌母瓶种子按照1～3％的接种量接入种子培养基中进行种子培养，至菌体OD600在12.6，pH值6.12，培养时间20～40h时移种，移种比例控制在5～10％。

[0084] 2.发酵培养：发酵液体积为600L

[0085] 发酵培养基：在1000L发酵罐中加入蔗糖50000-80000g、玉米浆30000-50000g、5-6二甲基苯并咪唑40-60g、磷酸氢二铵500-800g、硫酸锌100-200g、碳酸钙800-1200g、磷酸二氢钾600-1000g、氧化镁600-1000g、氯化钴80-120g、尿素300-450g、甜菜碱16000-24000g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：温度122～123℃；时间40分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MP，然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵培养过程中，温度控制在32～33℃，空气流量控制在15～30m3/h,搅拌转速控制在150～
300r/min，pH控制在6.5～7.5，培养时，198h时，pH7.01，糖2.3，终止发酵。

[0086] 3.补料培养基配制：

[0087] 3.1补料A的组成为：葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0088] 3.2补料B的组成为：甜菜碱250-500g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0089] 3.3所述补料C的组成为：甘氨酸300-600g/L，氯化胆碱20-50g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0090] 3.4以上物料分别以培养基重量体积比配制后，湿热灭菌。

[0091] 4、过程补料控制：

[0092] 4.1在发酵25-35小时，当总糖低于5.0％时补入补料A；

[0093] 4.2在发酵35小时后，甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B；

[0094] 4.3从开始补糖至发酵70小时控制总糖在5％-4.0％，70小时后控制总糖4.0％-3.0％至放罐，其中总糖含量采用DNS测糖法检测；

[0095] 4.4从开始补加甜菜碱开始，到发酵至130-150小时，控制甜菜碱在5％-3％，130-150小时后不再补加甜菜碱；甜菜碱含量采用高效液相色谱检测；

[0096] 4.5在发酵过程的前20小时，发酵液溶氧控制在15％-25％，在发酵过程的20小时后，发酵液溶氧控制在5％-15％；溶氧含量采用溶氧电极监测；

[0097] 4.6在发酵到发酵至130-150小时，补加补料C，控制甘氨酸含量在0.2-0.5％；甘氨酸含量采用高效液相色谱检测。

[0098] 5.对照实例：

[0099] 5.1与上1.2条相同；

[0100] 5.2补料A的组成为：葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L；

[0101] 5.3补料B的组成为：甜菜碱250-500g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，DMBI0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L。

[0102] 6.过程控制

[0103] 6.1在发酵25-35小时，当总糖低于5.0％时补入补料A；

[0104] 6.2在发酵35小时后，甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B；

[0105] 6.3从开始补糖至发酵70小时控制总糖在5％-4.0％，70小时后控制总糖4.0％-3.0％至放罐；

[0106] 6.4在发酵过程的前20小时，发酵液溶氧控制在15％-25％，在发酵过程的20小时后，发酵液溶氧控制在5％-15％。

[0107] 7、试验结果数据：

[0108] 类别发酵周期发酵单位实验例 198小时 259mg/L
对照例 198小时 203mg/L

[0109] 综上所述，维生素B12发酵过程中，需要补入甜菜碱，甜菜碱能促进细胞表面分泌代谢产物以刺激细菌产生维生素B12。此外，甜菜碱是维生素B12生产过程中的甲基供体，同时甜菜碱脱甲基后形成的甘氨酸作为氮源参与了菌体的生长代谢。在发酵中后期，菌体易受到甜菜碱的影响老化发空，另一方面甜菜碱的分解代谢减弱，又影响了菌体生长和维生素B12的合成。氯化胆碱在发酵中可以做为甲基供体，所以通过补加甘氨酸和氯化胆碱，可以代替甜菜碱的分解代谢，能有效的改善传统工艺因为发酵中后期甜菜碱分解代谢减弱造成维生素B12合成速率下降的问题。

[0110] 本发明正是在上述研究结果的基础上,根据菌体不同生长代谢阶段对甜菜碱的分解代谢能力的不同，通过改善发酵中后期甲基和甘氨酸的供给方式，从而达到提高维生素B12发酵的发酵水平的目的。实验证明，发酵到130-150小时开始补入甘氨酸和氯化胆碱，可有效减少传统的工艺方式中后期菌体老化发空现象，维生素B12产量明显提高。本发明提高的方法简单易行，对类似方式控制的发酵均有借鉴意义。

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一种维生素B12发酵补料培养基及补料方法

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