퀴놀론계 항균제 내성 확인을 위한 ＳＮＰｓ 프라이머 및 이를 이용한 변이 균주 검출 방법{SNP primer for identification the resistance against quinolone and method for detection of mutant strain using the same}

본 발명은 퀴놀론계 항균제 내성 확인을 위한 SNP(Single Nucleotide Polymerphisms) 프라이머 및 이를 이용한 변이 균주 검출 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 염기서열 분석 없이 빠르고 효과적으로 퀴놀론계 항균제에 내성을 갖는 변이 균주의 저항성결정부위 QRDR (Quinolone resistance determining region)내 변이를 확인할 수 있는 SNPs 프라이머 및 이를 이용한 변이 균주 검출 방법을 제공하는 것이다.

퀴놀론 (Quinolone)계 항균제는 퀴놀론카르복실산 또는 유사한 구조를 모핵으로 하는 합성 항세균약을 말하며 강력하고 광범위한 항균력을 가지고 있어 임상에서의 사용이 증가하고 있고, 다른 계열의 항균제 특히 β-lactam계 항균제에 대해 내성을 갖는 세균의 감염시에 효과적인 치료제로서 사용되고 있다.

퀴놀론은 주로 세균의 DNA 합성에 필요한 효소인 DNA 자이레이스(DNA gyrase, topoisomerase Ⅱ) 및 토포아이소머라제 Ⅳ(topoisomerase Ⅳ)의 작용을 억제하여 DNA 복제를 저해함으로서 항균 작용을 한다. DNA 자이레이스는 DNA 복제를 위하여 DNA supercoil 구조를 풀어주는 역할을 담당하며, 각각 2개의 GyrA와 GyrB라는 단량체 소단위로 구성되고 gyrA 와 gyrB 유전자에 의해 인코딩된다. 토포아이소머라제 Ⅳ(topoisomerase Ⅳ)는 각각 2개의 ParC 와 ParE라는 단량체 소단위로 구성되고, parC와 parE 유전자에 의해 각각 인코딩된다(Gellert et al., 1976, Kato et al., 1990). DNA가 복제되기 위하여는 두 개의 DNA 가닥(DNA strand)를 분리시켜 주어야 하는데, 이 때 가닥을 끊어 주었다가 다시 결합시켜 주는 과정을 서브유닛 A( gyrA , parC )가 담당하고, 이 작업을 수행하는데 필요한 에너지를 제공하는 ATPase의 기능을 서브유닛 B( gyrB , parE )가 담당한다(Guillemin et al., 1998).

한편, 퀴놀론의 사용 증가로 인해 최근에는 일본 등지에서 퀴놀론계 항균제에 대한 내성을 갖고 있는 세균에 대한 감염 사례가 계속해서 보고되고 있는 실정이다.

퀴놀론계 항균제에 대한 내성에 관한 연구는 그 표적효소들을 암호화하는 gyr AB, par CE 유전자에 대한 연구와 업테크(uptake), 이플럭스(efflux)를 통한 세포내 축적(accumulation)에 관한 연구를 E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae 등에서 많이 이루어지고 있다. 플루오로퀴놀론(Fluoroquinolones)의 저항성 기작은 DNA 자이레이스(DNA gyrase, topoisomerase Ⅱ)와 토포아이소머라제 Ⅳ(topoisomerase Ⅳ)의 표적 유전자 변이, 세포벽의 투과성 감소, 약물 유출(drug efflux, Drlica et al., 1997; Hancock 1998), 플라스미드를 통한 저항성 획득의 기전이 있다(Martinez-Martinez et al., 1998).

상기 퀴놀론계 항균제 내성 병원체의 전파를 조기에 차단하고, 균주 감염질환에 대한 효과적인 치료를 위해서는 퀴놀론계 항균제 내성 변이 균주를 신속하고 효과적으로 검출하는 것이 매우 중요하다.

현재 퀴놀론계 항균제 내성 변이 균주의 동정은 주로 염기서열 분석을 통해 이루어지고 있는데 시간 및 비용이 많이 드는 문제점이 있고, 아직까지 염기서열 분석 없이 빠르고 효과적으로 퀴놀론계 항균제 내성에 주요 원인이 되는 표적유전자 변이를 동시에 갖는 변이 균주를 검출하는 방법은 알려지지 않았다.

퀴놀론 내성 관련 기존에 보고된 연구 및 지난 5년간 Shigella spp. 및 국내 분리 장내세균에 대한 연구 결과, 퀴놀론계에 대해 일정 수준의 MIC 값 (CIP 0.125~0.5 ㎍/㎖) 이상을 보이는 경우, target alteration은 QRDR내 제한된 위치에서만 변이가 확인되고 있어, 이에 착안하여 염기서열 분석이 없이 빠르고 효과적으로 이들 변이를 확인할 수 있는 방법을 개발하게 되었다. 즉 리얼타임 PCR(Realtime PCR)에 기반하여 두 세트(set)의 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 이용한 SNPs 방법을 개발하여 이들의 효용성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 퀴놀론계 항균제 내성 확인을 위한 SNPs 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 이용한 QRDR 내 변이 균주 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 퀴놀론계 항균제 내성 확인을 위한 SNPs 프라이머를 제공한다.

상기 프라이머는 gyrA 유전자 내 아미노산 83 또는 87 위치의 변이여부를 확인할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 퀴놀론계 항균제 내성 확인을 위한 SNPs 프라이머를 제공한다.

상기 프라이머는 parC 유전자 내 아미노산 80 또는 91 위치의 변이여부를 확인할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 퀴놀론계 항균제 내성 변이 균주 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에서 상기 키트는 상기 프라이머들 이외에도, 필요에 따라 PCR 반응, 파이로시퀀싱, RFLP 분석에 요구되는 성분들로 이루어질 수 있다.

이에 한정되는 것은 아니나 바람직하게 PCR 요구되는 성분은 Realtime용 2X Premix taq 12.5㎕, Detection primer F (20pM) 0.5㎕, Detection primer R (20pM) 0.5㎕, SNP 83 Detection Probe_FAM (10mM) 0.4㎕, SNP 87 Detection Probe_VIC (10mM) 0.4㎕, DW 0.7㎕로 구성된다.

상기 키트는 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프로브 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 퀴놀론계 항균제 내성 확인을 위한 SNPs 프라이머를 포함하는 퀴놀론계 항균제 내성 변이 균주 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에서 상기 키트는 상기 프라이머들 이외에도, 필요에 따라 PCR 반응, 파이로시퀀싱, RFLP 분석에 요구되는 성분들로 이루어질 수 있다.

이에 한정되는 것은 아니나 바람직하게 PCR 요구되는 성분은 Realtime용 2X Premix taq 12.5㎕, Detection primer F (20pM) 0.5㎕, Detection primer R (20pM) 0.5㎕, SNP 80 Detection Probe_FAM (10mM) 0.4㎕, SNP 91 Detection Probe_VIC (10mM) 0.4㎕, DW 0.7㎕로 구성된다.

상기 키트는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 프로브 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 1) 확인대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 2) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머 세트 또는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머 세트를 포함하여 이루어진 PCR 반응액을 증폭하는 단계; 및 3) 상기 증폭이 완결되어 얻어진 PCR 생성물을 확인하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 퀴놀론계 항균제 내성 변이 균주 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 양태에 의하면, 상기 2) 단계에서 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되고, 3) 단계에서 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프로브 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 이용하여 PCR 생성물을 확인하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 구체적인 양태에 의하면, 상기 2) 단계에서 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되고, 3) 단계에서 서열번호 7의 염기서열을 갖는 프로브 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 이용하여 PCR 생성물을 확인하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 PCR 반응은 바람직하게 95℃ 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 15초, 60초에서 1분을 한 주기로 하여 40 cycle 조건으로 수행한다.

상기와 같은 PCR 반응 결과 gyrA 아미노산 83 위치의 변이가 없는 경우 FAM dye의 발광이 확인되고, gyrA 아미노산 87 위치의 변이가 없는 경우 VIC dye의 발광이 확인된다. 또한, parC 아미노산 80 위치의 변이가 없는 경우 FAM dye의 발광이 확인되고, parC 아미노산 91 위치의 변이가 없는 경우 VIC dye의 발광이 확인된다. 따라서 염기서열 분석 없이 빠르고 효과적으로 퀴놀론계 항균제에 내성을 갖는 변이 균주를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Shigella spp. 및 병원성 E. coli 의 gyrA 아미노산 83 또는 87 위치와 parC 아미노산 80 또는 91 위치의 변이여부를 확인할 수 있는 SNPs용 프라이머와 프로브들을 설계하여, 이들의 효용성을 확인하고, 반응 조건을 정립하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 퀴놀론계 항균제 내성 확인을 위한 SNPs 프라이머 및 이를 이용한 QRDR 내 변이 균주 검출 방법을 제공하여 염기서열 분석 없이 빠르고 효과적으로 변이균주를 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면 퀴놀론계 항균제 내성 병원체의 전파를 조기에 차단하고, 균주 감염질환에 대한 효과적인 치료를 할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 타겟 서열에 대한 프로브 하이브리디제이션을 나타내는 개략적 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 SNPs 테스트에 의한 gyrA 및 parC 의 증폭 플롯을 나타내는 도면이다.
도 3a ~ 도 4b는 비교실시예에 의한 SNPs 테스트에 의한 gyrA 및 parC 의 증폭 플롯을 나타내는 도면이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. SNPs용 프라이머(primer) 및 프로브(probe) 개발

Primer express software(Applied Biosystems-Perkin- Elmer, Foster City, CA, USA)를 사용하여 gyrA 의 아미노산 83, 87 위치와 parC 의 아미노산 80, 91 위치의 변이여부를 확인할 수 있는 SNPs용 프라이머 및 프로브들을 gyrA 와 parC 2개 세트(set)로 설계하였다. 표 1에는 본 발명에 의해 설계된 SNPs용 프라이머 및 프로브를 나타낸다.

실시예 2. 본 발명에 의한 SNPs용 프라이머와 프로브를 이용한 gyrA 와 parC 유전자내 QRDR 부위 변이 확인

1) 대상균주 선별

본 발명에 의한 프라이머와 프로브의 효용성을 확인하기 위하여 gyrA 의 아미노산 83, 87 위치와 parC 의 아미노산 80, 91 위치의 변이가 확인된 Shigella spp. 균주들을 1차대상으로 하였다.

반응정립을 위해서 퀴놀론계 항균제 디스크(Disk)에 대한 억제대가 0mm인 병원성 E.coli 를 추가로 선별하여 대상으로 하였다.

2) SNP 확인을 위한 DNA 준비

영양배지에서 13~16시간 순수 배양된 균의 집락 1~2개를 300 ㎕의 멸균 탈이온 증류수가 담겨져 있는 micro centrifuge tube에 넣어 현탁 시킨 후 현탁액을 끓는 물에 5분간 중탕하였다.

이를 얼음에 넣어 식히고 13000 rpm에서 5분간 원심분리 후, 상층액을 주형(template)으로 사용하였다.

3) 리얼타임(Real time) PCR 반응액 제조

gyrA 와 parC 2개의 Real time용 2X Premix Kit를 제작하여 사용하였다.

(1) gyrA SNPs Kit 구성은 다음과 같았다.

Realtime용 2X Premix taq 12.5㎕, Detection primer F (20pM) 0.5㎕, Detection primer R (20pM) 0.5㎕, SNP 83 Detection Probe_FAM (10mM) 0.4㎕, SNP 87 Detection Probe_VIC (10mM) 0.4㎕, DW 0.7㎕

(2) parC SNPs Kit 구성은 다음과 같았다.

Realtime용 2X Premix taq 12.5㎕, Detection primer F (20pM) 0.5㎕, Detection primer R (20pM) 0.5㎕, SNP 80 Detection Probe_FAM (10mM) 0.4㎕, SNP 91 Detection Probe_VIC (10mM) 0.4㎕, DW 0.7㎕

(3) (1), (2) kit에 준비된 DNA 2㎕와 DW 3㎕를 첨가하여 최종 반응액을 구성하였다.

4) 리얼타임 PCR 반응

리얼타임 PCR 반응은 LightCycler 480 II (Roche) 기기를 사용하였다. 이때 반응은 95℃ 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 15초, 60초에서 1분을 한 주기로 하여 40 cycle 조건으로 수행하였다.

5) 결과 확인

PCR 반응 결과 gyrA amino acid 83 위치의 변이가 없는 경우 FAM dye의 발광이 확인되었고, gyrA amino acid 87 위치의 변이가 없는 경우 VIC dye의 발광이 확인되었다. 또한, parC amino acid 80 위치의 변이가 없는 경우 FAM dye의 발광이 확인되었고, parC amino acid 91 위치의 변이가 없는 경우 VIC dye의 발광이 확인되었다. C _t 값을 기준으로 35 cycle 이상에서 증폭곡선을 음성으로 판단하였다.

1) 변이가 확인된 Shigella spp. 균주를 대상으로 한 확인 결과

13주에서 이미 알려진 결과와 일치함을 확인하였다 (표 2)(참고: CMI 2008; 14: 760-765)

2) 플루오로퀴놀론(Fluoroquinolone) 내성 E. coli 균주를 대상으로 한 확인 결과

시퀀싱(Sequencing)을 통해 확인해 본 결과, 대상 균주 모두 본 발명에 의해 확인한 부위 이외의 추가 변이는 확인되지 않았다. 표 3은 확인대상이 된 E. coli 균주의 gyrA 및 parC 상의 돌연변이를 나타낸다.

실시예 3. 비교 실시예

본 발명에 의한 상기 프라이머와 프로브는 수회에 걸친 실패 사례를 거친 후 그 효용성을 확인하고 반응 조건이 정립되었다.

이와 관련된 실패사례는 표 4 및 도 3a ~ 4b에 나타난 바와 같다. 이때 표 3에 나타난 SNPs용 프라이머와 프로브를 이용한 gyrA 와 parC 유전자내 QRDR 부위 변이 확인 방법은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.

도 3a ~ 도 4b에 나타난 바와 같이, 변이가 확인된 Shigella spp. 균주를 대상으로 한 확인 결과, 대상 균주 모두 확인된 부위의 변이를 판단 시, 결과 불확실하거나 확인되지 않았다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> korea Center for Disease Control and Prevention <120> SNP primer for identification the resistance against quinolone and method for detection of mutant strain using the same <130> P11-100824-01 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 1 tggtgacgta atcggtaaat acca 24 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 gaatggctgc gccatacg 18 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP Detection probe <400> 3 tgactcggcg gttt 14 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP Detection probe <400> 4 acgatagtgt cataaac 17 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 gacgtactgg gtaaatacca tccg 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 tcaaccagcg gataacggta a 21 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP Detection probe <400> 7 gcgatagcac ctgt 14 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP Detection probe <400> 8 agaacggtcg cgcc 14