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一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法和用途

阅读：369发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于抗菌剂及食品添加剂或者化妆品领域，具体涉及一种酪蛋白 ‑豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备及应用。本发明通过将豆蔻精油包裹在酪蛋白脂质体中，以实现减少豆蔻精油在施用过程中的挥发，从而减少豆蔻精油的浪费，提高其利用率，达到长效抗菌与高效利用的目的。，下面是一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法和用途专利的具体信息内容。

权利要求

1. 一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，将豆蔻精油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸发形成光滑的薄膜，加入水相介质溶解膜状物并超声成乳液，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的豆蔻精油脂质体，其特征在于：将纳米级的豆蔻精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂的溶液混合，搅拌均匀，通过低温冷冻缓慢融化的方法使酪蛋白镶嵌在脂质体上，通过温和超声使脂质体闭合，最终形成包裹豆蔻精油的酪蛋白脂质体；低温冷冻缓慢融化是指将混合液在-18 ℃下冷冻2 h，随后在0 ℃下缓慢融化2 h；
温和超声是指在低功率50 W条件下超声2 h，温度范围0-10 ℃；大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为5:1；用于制备精油脂质体的乳液含有豆蔻精油的浓度为4.0 mg/mL；表面活性剂为十二烷基聚乙二醇醚（Brij-35），得到包裹豆蔻精油的酪蛋白脂质体后其最终浓度为1.0 mg/mL；所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的磷酸盐缓冲溶液，pH值6.5 7.4；
~
所述的酪蛋白和表面活性剂的溶液是将酪蛋白分散在Brij-35的磷酸盐缓冲液中得到的，Brij-35浓度为10 mg/mL，分散后溶液中酪蛋白浓度为1.0 mg/mL；脂质体上镶嵌的蛋白为酪蛋白，豆蔻精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂的溶液以体积比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白浓度为0.1 mg/mL，Brij-35浓度为1.0 mg/mL。
2.如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于：
所述的有机溶剂为氯仿。
3.如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于：
所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的磷酸盐缓冲溶液，pH值7.2。

说明书全文

一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明属于抗菌剂及食品添加剂或者化妆品领域，具体涉及一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 豆蔻，多年生常绿草本植物，是姜科植物，产出暖性精油。精油无色或黄色，甜而温暖，主要成分是松油醇，桉油醇，姜烯和柠檬烯。肉豆蔻含挥发油、脂肪油、苯丙素、木脂素和黄酮等多种化学成分，具有抗菌消炎、镇痛、止泻、抗肿瘤等广泛的药理作用。豆蔻精油有良好的抗炎，镇痛，抑菌作用，对各种食源性病原菌有较好的抗菌效果，且安全、无毒副作用，在肉制品加工中应用广泛，可去异味，抑细菌，增辛香。

[0003] 国内有很多关于豆蔻在医学应用的专利申请。CN103893226A公开了肉豆蔻提取物在制备抗痛风的药物、食品或保健品的应用。CN102988333A公开了豆蔻明在制备防治肠炎的药物或食品中的应用。CN102036662A公开了一种利用肉豆蔻衣木脂素预防和治疗ppAR介导的疾病的方法。CN103719464A发明了一种肉豆蔻脾胃虚弱保健茶。CN1709467A公开了一种复方草豆蔻滴丸及其制备方法。CN101508937A公开了一种超临界二氧化碳提取肉豆蔻精油的方法,可以获得高品质的肉豆寇精油产品。CN103638074A公开了一种肉豆寇挥发油在制备治疗抑郁症药物中的应用。

[0004] 虽然豆蔻精油在医学，食品和化妆品行业被广泛应用，具有较好的杀菌、增香等特点，但是豆蔻精油易挥发，暴露在空气中不稳定，所以要寻找有效的方法降低肉桂精油在使用过程中的挥发程度，延长其贮存期。

[0005] 纳米脂质体能将精油包裹在内，并且纳米脂质体不会对豆蔻精油的主要活性成分造成破坏。纳米脂质体使豆蔻精油中的活性成分与外界环境隔绝开来，可以降低豆蔻精油的挥发性，延长保存期。但由于脂质体的缓释作用，包裹精油的脂质体保质期有限。因此，选用酪蛋白制成稳定性更高的酪蛋白脂质体。此外，纳米脂质体由于它们的亚细胞尺寸，能加强脂质体的被动吸收机制，减少物质运输阻力，从而增强精油的抗菌效果。

发明内容

[0006] 本发明的目的是公开一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体的制备方法及其用途，通过将豆蔻精油包裹在酪蛋白脂质体中，以实现减少豆蔻精油在施用过程中的挥发，从而减少豆蔻精油的浪费，提高其利用率，达到长效抗菌与高效利用的目的。本发明由豆蔻精油，大豆卵磷脂，胆固醇和表面活性剂，酪蛋白制成酪蛋白-豆蔻精油脂质体。

[0007] 本发明的制备方法是将豆蔻精油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸发形成光滑的薄膜，加入水相介质溶解膜状物并超声成乳液，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的豆蔻精油脂质体，其特征在于：将纳米级的豆蔻精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂的溶液混合，搅拌均匀，通过低温冷冻缓慢融化的方法使酪蛋白镶嵌在脂质体上，通过温和超声使脂质体闭合，最终形成包裹豆蔻精油的酪蛋白脂质体。

[0008] 本发明的大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为5:1；用于制备精油脂质体的乳液含有豆蔻精油的浓度为4.0mg/mL；表面活性剂为十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，得到包裹豆蔻精油的酪蛋白脂质体后其最终浓度为1.0mg/mL。

[0009] 本发明中所述的有机溶剂为氯仿。

[0010] 本发明中所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的磷酸盐缓冲溶液，pH值6.5～7.4，优选7.2。

[0011] 所述的酪蛋白和表面活性剂的溶液是将酪蛋白分散在Brij-35的磷酸盐缓冲液中得到的，Brij-35浓度为10mg/mL，分散后溶液中酪蛋白浓度为1.0mg/mL。

[0012] 本发明中脂质体上镶嵌的蛋白为酪蛋白，豆蔻精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂的溶液以体积比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白浓度为0.1mg/mL，Brij-35浓度为1.0mg/mL。

[0013] 本发明中低温冷冻缓慢融化是指将混合液在-18℃下冷冻2h，随后在0℃下缓慢融化2h。

[0014] 本发明中温和超声是指在低功率50W条件下超声2h，温度范围0-10℃。附图说明

[0015] 图1酪蛋白-豆蔻精油脂质体的包封率。

[0016] 图2酪蛋白-豆蔻精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)。

[0017] 图3酪蛋白-豆蔻精油脂质体对大肠杆菌的抗菌效果。

[0018] 图4酪蛋白-豆蔻精油脂质体对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。

[0019] 表1酪蛋白-豆蔻精油脂质体的Zeta电位。

具体实施方式

[0020] 通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此[0021] 实施例1酪蛋白-豆蔻精油脂质体的包封率

[0022] 1实验材料

[0023]

[0024] 2实验方法

[0025] 1)豆蔻精油脂质体的制备

[0026] ①称取1g大豆卵磷脂，0.2g胆固醇和200mg的豆蔻精油，加入50mL氯仿使其溶解。

[0027] ②在旋转蒸发仪中蒸发至溶剂蒸干，蒸发温度为10～30℃，圆底烧瓶内壁会形成光滑的薄膜；然后将所得产品放入真空干燥箱中，30℃，真空状态下干燥24h。

[0028] ③加入50mL的磷酸盐缓冲液到圆底烧瓶中进行水化，水化超声波功率为100W，超声时间为5h。

[0029] ④将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以功率360W，工作10s间隙5s，粉碎30min。

[0030] ⑤将所得产品进行离心，4000rpm，15min，取上层液体。

[0031] ⑥将所得液体用0.22μm滤膜进行过滤，得滤液。

[0032] 2)酪蛋白-豆蔻精油脂质体的制备

[0033] ①按照上述豆蔻精油脂质体的制备方法，制备豆蔻精油浓度为4mg/mL的豆蔻精油脂质体。

[0034] ②将酪蛋白超声分散在含10mg/mL Brij-35的磷酸盐缓冲液中，最终形成酪蛋白—Brij-35溶液，其中酪蛋白浓度为1.0mg/mL。

[0035] ③在50mL豆蔻精油脂质体中添加5mL 1mg/mL的酪蛋白—Brij-35溶液，混合均匀。

[0036] ④将所得混合液于超声条件下扩散10min。

[0037] ⑤将所得混合液在-18℃下冷冻2h。

[0038] ⑥将所得混合液在0℃下缓慢融化2h。

[0039] ⑦通过温和超声(功率50W，2h，KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)使脂质体闭合，所得溶液即为酪蛋白-豆蔻精油脂质体。

[0040] 3)包封率的测定

[0041] 用无水乙醇稀释豆蔻精油，逐级稀释成浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的标准溶液。然后，分别吸取1μL标准溶液进行GC-MS分析，对其主要成分的谱峰面积进行自动积分，绘制主成分峰面积-豆蔻精油浓度标准曲线。取1mL酪蛋白-豆蔻精油脂质体样品，13500rpm，离心3h，倒掉上清液。接着加入1mL乙醇破乳剂，超声3h。最后以10000rpm的转速离心15min，取上清液，用于GC-MS分析。制备好的脂质体样品，对精油主成分的峰面进行自动积分，再根据绘制的标准曲线，计算出脂质体中豆蔻精油的含量。则：

[0042]

[0043] 3酪蛋白-豆蔻精油脂质体的包封率

[0044] 包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标，也是脂质体能否发挥较普通制剂高效、低毒等特点的关键。由图1可看出，豆蔻精油脂质体的包封率为41.21％，酪蛋白-豆蔻精油脂质体的包封率为78.62％。因此制备酪蛋白-豆蔻精油脂质体可以明显提高脂质体的包封率。

[0045] 实施例2酪蛋白-豆蔻精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)

[0046] 1实验材料

[0047] ①空白脂质体

[0048] ②豆蔻精油脂质体

[0049] ③酪蛋白-豆蔻精油脂质体

[0050] 2实验方法

[0051] 用美国布鲁克海文仪器公司产的，型号为BI-9000的高浓度激光粒度仪测定酪蛋白-豆蔻精油脂质体的粒径和多分散系数(PDI)值，所测样品放入样品池直接测量即可。

[0052] 3酪蛋白-豆蔻精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)

[0053] 多分散系数(PDI)直接反映酪蛋白-豆蔻精油脂质体的稳定性，因此是主要参考指标，脂质体的PDI在0～0.3范围内属于最好，在0.3～0.7范围内较差，但可以接受，当PDI>0.8时，不予考虑。如图2所示，空白脂质体的粒径为86.4nm、PDI为0.353，豆蔻精油脂质体的粒径为160.7nm、PDI为0.217，酪蛋白-豆蔻精油脂质体的粒径为601.5nm、PDI为0.019。酪蛋白-豆蔻精油脂质体的多分散系数(PDI)最小，因此制备酪蛋白-豆蔻精油脂质体可以明显提高脂质体的稳定性。

[0054] 实施例3酪蛋白-豆蔻精油脂质体的Zeta电位

[0055] 1实验材料

[0056] ①空白脂质体

[0057] ②豆蔻精油脂质体

[0058] ③酪蛋白-豆蔻精油脂质体

[0059] 2实验方法

[0060] 用英国马尔文仪器有限公司生产的型号为Zetasirer nano ZSZeta的电位仪测量，直接将待测脂质体样品放入电位仪中测量即可。

[0061] 3酪蛋白-豆蔻精油脂质体的Zeta电位

[0062] 表1酪蛋白-豆蔻精油脂质体的Zeta电位

[0063]

[0064] Zeta电位也可以直接反映酪蛋白-豆蔻精油脂质体的稳定性，因此也是主要参考指标，脂质体的Zeta电位的绝对值越大说明脂质体越稳定性，Zeta电位的绝对值在0～30范围内属于不稳定，在大于30时脂质体较稳定性。如表1所示，三种脂质体均带负电，空白脂质体的Zeta电位为-22.8mV，其绝对值小于30，脂质体不稳定；豆蔻精油脂质体的Zeta电位为-21.1mV，其绝对值小于30脂质体，不稳定；酪蛋白-豆蔻精油脂质体的Zeta电位为-38.2mV，其绝对值大于30且最大，脂质体最稳定。

[0065] 实施例4酪蛋白-豆蔻精油脂质体的抗菌性能

[0066] 1实验材料

[0067] ①豆蔻精油脂质体(保存7天、30天、60天、90天)

[0068] ②酪蛋白-豆蔻精油脂质体(保存7天、30天、60天、90天)

[0069] 2实验方法

[0070] 采用平板菌落计数法，以大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为模式菌种测定酪蛋白-豆蔻精油脂质体的残存菌数。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种到液体培养基中，分别置于空气摇床中在37℃、150rpm的条件下震荡培养24～48h，获得对数生长期的菌悬液。取适量处于对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄5 6
球菌分别加入含有一定量无菌磷酸盐缓冲液的试管中(细菌浓度约为10 ～10CFU/mL)，然后再向试管中加入浓度为20％(v/v)的豆蔻精油脂质体及酪蛋白-豆蔻精油脂质体。同时另取两个分别含有以上两种菌的试管并向其中加入等量无菌水(不加脂质体)作为对照。将各试管均置于空气摇床中在37℃、150rpm的条件下震荡反应24h。分别于不同时间点的取适量培养液进行十倍梯度稀释到合适的浓度，然后移取100μL稀释液滴到无菌固体平板培养基上，涂布均匀之后放入37℃恒温恒湿培养箱中倒置培养。24～48h后进行平板菌落计数，从而对豆蔻精油脂质体和酪蛋白-豆蔻精油脂质体的抗菌活性进行评价。实验重复三次，结果取平均值。

[0071] 3酪蛋白-豆蔻精油脂质体的抗菌性能

[0072] 不同保存期的酪蛋白-豆蔻精油脂质体的抗菌活性的变化也可以间接反映脂质体的稳定性。因此对保存7天、30天、60天、90天的豆蔻精油脂质体及酪蛋白-豆蔻精油脂质体进行了抗菌性能评价，结果如图3、图4所示。保存时间为7天时，豆蔻精油脂质体与酪蛋白-豆蔻精油脂质体的抗菌活性相近，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均显示了良好的抗菌效果。保存时间为30天时，豆蔻精油脂质体的抗菌效果明显降低，而酪蛋白-豆蔻精油脂质体仍然显示出良好的抗菌效果。保存时间为60天和90天时，豆蔻精油脂质体几乎没有显示抗菌效果，而酪蛋白-豆蔻精油脂质体仍然保持良好的抗菌效果。

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