一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法及其应用
阅读：767发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 天然产物提取领域，具体涉及一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法及其应用。本制备方法包括 纤维 素酶解和蛋白酶酶解步骤，然后再采用超声提取的方法对澳洲坚果青皮中的熊果苷、 豆腐 果苷和天麻苷等具有较高利用价值的酚苷类化合物进行提取，最后经过 脱脂 处理和脱色处理，得到青皮提取物。按照本制备方法获得的青皮提取物，熊果苷、豆腐果苷和天麻苷等酚苷类化合物含量高，且提取过程简单，不需要复杂的提取、纯化和分离操作，工艺中使用到的 试剂 、原材料等均容易获取且成本较低。本制备方法可以应用于含熊果苷、豆腐果苷和天麻苷等的保健食品和 化妆品 的制备中。，下面是一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：取澳洲坚果青皮材料，粉碎后得青皮粉；
步骤(2)：在青皮粉中加入水，再加入纤维素酶，得酶解体系Ⅰ，进行第一次酶解反应；第一次酶解反应结束后，调节pH值至碱性，然后加入碱性蛋白酶，得酶解体系Ⅱ，进行第二次酶解反应；第二次酶解反应结束后，离心取固相，得沉淀A，经过乙醇溶液洗涤后，得沉淀B；
步骤(3)：在沉淀B中加入乙醇溶液，得提取体系，超声处理所述提取体系后，过滤取液相，经浓缩后得粗提物；
步骤(4)：将粗提物加入水中，搅拌直至溶解完全，得纯化体系；使用石油醚萃取所述纯化体系，取水相，得纯化液A；然后在纯化液A中加入活性炭，搅拌后静置，然后过滤取液相，得纯化液B；
步骤(5)：浓缩所述纯化液B，得青皮提取物。
2.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，取新鲜的澳洲坚果青皮洗净后阴干，得澳洲坚果青皮材料。
3.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，青皮粉和水的用量比为1g：(15-20)ml；
纤维素酶在酶解体系Ⅰ中的质量浓度为2-4％，第一次酶解反应的时长为20-30min，温度为40-55℃；
第一次酶解反应结束后调节pH值至9.5-10.5，碱性蛋白酶在酶解体系Ⅱ中的质量浓度为3-5％，第二次酶解反应的时长为40-70min，温度为40-55℃。
4.根据权利要求3所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，酶解反应结束后，3000-4000rpm离心20-30min后取固相，得沉淀A；
使用乙醇溶液洗涤得沉淀A的方法为：将所述沉淀A加入体积分数为80-95％的乙醇溶液中，得洗涤体系；沉淀A和乙醇溶液的用量比为1g：(6-15)ml；搅拌所述洗涤体系30-
60min，然后过滤取固相，得沉淀B。
5.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，在沉淀B中加入体积分数为50-60％的乙醇溶液，得提取体系；所述沉淀B和乙醇溶液的用量比为1g：(15-20)ml。
6.根据权利要求5所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，超声处理所述提取体系的时长为40-60min，超声功率为250-300W。
7.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，粗提物和水的用量比为1g：(12-15)ml；石油醚与纯化体系的体积比为1:1，萃取过程重复2-3次。
8.根据权利要求7所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，活性炭在纯化液A中的质量百分数为0.5-2.5％，搅拌时长为60-90min，静置时长为
10-20min。
9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法在制备保健食品中的应用。
10.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法在制备化妆品中的应用。
一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 澳洲坚果(Macadamia integrifolia F.Muell，又名夏威夷果)的果实包括青皮、褐色的种皮和乳白色的果仁。青皮即为澳洲坚果果实的果皮，它占果实鲜重的45-60％，属于果实中被弃用的部分，只有少量用作沤肥和制作动物饲料，青皮中的大量活性物质基本没有得到合理开发利用。
[0003] 研究发现，澳洲坚果青皮中含有大量的酚类化合物，该类化合物具有抑菌、抗氧化、预防龋齿、抗肿瘤等作用，还具有一定的芬香气味和美白作用。澳洲坚果青皮多酚包括熊果苷、豆腐果苷和天麻苷等，其中，豆腐果苷和天麻苷具有助眠、镇静安神、缓解精神压力等作用，熊果苷具有修复晒后损伤和美白的作用。上述苷类物质若能被充分利用，可以提高澳洲坚果的附加价值，变废为宝，对青皮进行综合利用，拓展坚果产业链。
[0004] 但是由于青皮中含有酚类化合物以及其他物质种类多，如果想分离获取其中一种或者多种酚类化合物，需要较为复杂的操作过程，例如多次萃取和过柱纯化分离等。现有技术的澳洲坚果青皮多酚的提取和分离，不适合于工业化生产，从而阻碍了澳洲坚果青皮的资源综合利用。
发明内容
[0005] 本发明主要解决的技术问题是提供一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，该制备方法可以高效提取澳洲坚果青皮中的熊果苷、豆腐果苷和天麻苷等功效物质，且制备方法简单，适合于工业化生产。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提出了以下技术方案：
[0007] 一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤(1)：取澳洲坚果青皮材料，粉碎后得青皮粉；
[0009] 步骤(2)：在青皮粉中加入水，再加入纤维素酶，得酶解体系Ⅰ，进行第一次酶解反应；第一次酶解反应结束后，调节pH值至碱性，然后加入碱性蛋白酶，得酶解体系Ⅱ，进行第二次酶解反应；第二次酶解反应结束后，离心取固相，所述固相经过乙醇溶液洗涤后，得酶解后的沉淀；
[0010] 步骤(3)：在酶解后的沉淀中加入乙醇溶液，得提取体系，超声处理所述提取体系后，过滤取液相，浓缩所述液相得粗提物；
[0011] 步骤(4)：将粗提物加入水中，搅拌直至溶解完全，得纯化体系；使用石油醚萃取所述纯化体系，取水相；然后在水相中加入活性炭，搅拌后静置，然后过滤取液相，得纯化液；
[0012] 步骤(5)：浓缩所述纯化液，得青皮提取物。
[0013] 采用上述技术方案，技术原理为：使用纤维素酶局部破坏青皮粉的细胞壁，然后使用碱性蛋白酶酶解细胞壁中存在的蛋白。由于部分多酚类物质通过氢键结合在细胞壁的蛋白上，蛋白破坏之后，这部分的酚类物质被释放出来。然后通过乙醇溶液的洗涤作用，被释放出来的酚类物质被充分洗脱，然后再对酶解后的沉淀进行乙醇提取，将青皮细胞液泡中的多酚类物质充分提取，而青皮液泡中的多酚类物质包括了熊果苷、豆腐果苷和天麻苷等具有较高利用价值的酚苷类化合物。接下来经过石油醚的脱脂作用，活性炭的脱色作用，充分纯化粗提物。再经过浓缩处理，可以获得富含熊果苷、豆腐果苷和天麻苷等酚苷类化合物的青皮提取物。
[0014] 本方案的有益效果在于：
[0015] (1)获得的青皮提取物中，熊果苷、豆腐果苷和天麻苷等酚苷类化合物含量高[0016] 发明人研究发现，不同的多酚类物质在青皮细胞中的分布存在一定差异，有的多酚类物质通过氢键结合在细胞壁上的蛋白质等大分子物质上，有的多酚类物质分布在细胞的液泡中。并且发明人还发现，豆腐果苷、熊果苷和天麻苷等酚苷类物质主要分布在液泡中，这些物质都具有较高的生物活性和利用价值。根据该研究结果，发明人设计了新的青皮多酚的提取方法，充分排除了非目的多酚类化合物，获得的青皮提取物中，豆腐果苷、熊果苷和天麻苷等酚苷类物质含量均较为理想。发明人先使用适量的纤维素酶局部破坏细胞壁，使得细胞壁上的蛋白等物质暴露，但是细胞整体并未被瓦解，细胞壁内部的液泡等结构还未被破坏。再使用碱性蛋白酶降解蛋白质，从而使得结合在蛋白质上的酚类释放出来，再通过乙醇的洗涤，使得分布在细胞壁上的多酚类物质与青皮细胞分离，从而提高了青皮提取物中目的成分的含量。
[0017] (2)提取过程简单，不需要复杂的提取、纯化和分离操作，工艺中使用到的试剂、原材料等均容易获取且成本较低。现有技术通常直接使用乙醇等作为溶剂对多酚类物质进行提取，该提取过程可以将青皮的总多酚提取出来，但是青皮总多酚成分复杂，想要将总多酚中的一种或多种多酚类化合物分离出来，需要采用非常复杂的萃取以及过柱纯化方法，操作过程冗长且费用较高，不适合于工业生产。
[0019] 进一步，在步骤(1)中，取新鲜的澳洲坚果青皮洗净后阴干，得澳洲坚果青皮材料。
[0020] 采用上述技术方案，将青皮洗净，避免杂质对提取过程的影响；将青皮阴干可以避免青皮中的水分对提取效率的影响。
[0021] 进一步，在步骤(2)中，青皮粉和水的用量比为1g：(15-20)ml；
[0023] 第一次酶解反应结束后调节pH值至9.5-10.5，碱性蛋白酶在酶解体系Ⅱ中的质量浓度为3-5％，第二次酶解反应的时长为40-70min，温度为40-55℃。
[0024] 采用上述技术方案，在第一次酶解反应中，使用质量浓度为2-4％的纤维素酶，处理青皮粉20-30min，可以使得青皮细胞壁局部破坏，而不是完全瓦解，细胞壁上的蛋白等物质暴露，而细胞内部的液泡等结构还保持完整，液泡中的目的成分不会提前释放，使得非目的多酚类物质可以被分离出来。
[0025] 在第二次酶解反应中，使用3-5％的碱性蛋白酶，处理青皮粉40-70min，可以将暴露出来的蛋白质充分降解，促进非目的多酚类物质的释放。pH值为9.5-10.5既是碱性蛋白酶反应的条件，也可以终止纤维素酶的催化作用。由于酶解体系Ⅱ呈碱性，蛋白质易溶于碱性溶液，该步骤还可以除去部分蛋白质杂质。
[0026] 进一步，在步骤(2)中，酶解反应结束后，3000-4000rpm离心20-30min后取固相；使用乙醇溶液洗涤固相的方法为：将所述固相加入体积分数为80-95％的乙醇溶液中，得洗涤体系，固相和乙醇溶液的用量比为1g：(6-15)ml；搅拌所述洗涤体系30-60min，然后过滤取固相，得酶解后的沉淀。
[0027] 采用上述技术方案，使用乙醇为溶剂，洗涤的过程辅以搅拌操作，可以充分将非目的多酚类物质从固相上洗脱。同时80-95％的乙醇溶液也具备一定的脱脂作用，有利于提高最终产物中的目的成分的含量。
[0028] 进一步，在步骤(3)中，在酶解后的沉淀中加入体积分数为50-60％的乙醇溶液，得提取体系，酶解后的沉淀和乙醇溶液的用量比为1g：(15-20)ml。
[0029] 采用上述技术方案，50-60％的乙醇溶液可有效溶解细胞液泡中的多酚类物质。如果乙醇溶液的体积分数低于50％，会导致溶剂中溶解较多的多糖类物质，不利于提高产物中目的成分的含量。如果乙醇溶液的体积分数高于60％，会导致溶剂中溶解较多的低极性物质，也会导致产物中目的成分的含量降低。
[0030] 进一步，在步骤(3)中，超声处理所述提取体系的时长为40-60min，超声功率为250-300W。
[0031] 采用上述技术方案，可以保证有效地将豆腐果苷、熊果苷和天麻苷等酚苷类物质提取出来。如果超声时间过长、功率过高，会加剧分子运动，产生大量热量，破坏目的成分的分子结构，并且其他杂质也不断溶出，从而导致提取率下降。如果超声时间过短、功率过低，细胞结构不能被有效破坏，目的成分不能有效溶出，也会导致提取率下降。
[0032] 进一步，在步骤(4)中，粗提物和水的用量比为1g：(12-15)ml；石油醚与纯化体系的体积比为1:1，萃取过程重复2-3次。
[0033] 采用上述技术方案，使用石油醚萃取纯化体系多次，可以将纯化体系中的脂溶性物质除去，从而提高目的成分的含量。
[0034] 进一步，在步骤(4)中，活性炭在水相中的质量百分数为0.5-2.5％，搅拌时间为60-90min，静置时间为10-20min。
[0035] 采用上述技术方案，可以充分减少叶绿素等色素对青皮提取物成色的影响，并且活性炭对多糖等物质有一定吸附作用，可以去除混入水相中的少量多糖。
[0036] 进一步，一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法在制备保健食品中的应用。
[0037] 采用上述技术方案，澳洲坚果青皮提取物中富含豆腐果苷和天麻苷等酚苷类物质，豆腐果苷和天麻苷具有助眠、镇静安神、缓解精神压力等作用，将青皮提取物进行精深加工，可获得具有助眠作用的保健食品。
[0038] 进一步，一种澳洲坚果青皮提取物的制备方法在制备化妆品中的应用。
[0039] 采用上述技术方案，澳洲坚果青皮提取物中富含熊果苷等酚苷类物质，熊果苷具有修复晒后损伤和美白的作用，将青皮提取物进行精深加工，可获得具有美白、晒后修复功效的化妆品。
具体实施方式
[0040] 下面通过具体实施方式进一步详细说明，其中：
[0041] 实施例1：澳洲坚果青皮提取物制备实例
[0042] 澳洲坚果青皮提取物的制备步骤如下：
[0043] 步骤(1)：取新鲜的澳洲坚果青皮洗净后阴干，粉碎后过40目，得青皮粉；
[0044] 步骤(2)：在每1g青皮粉中加入20ml水，再加入纤维素酶(aladdin，C298989，CAS号：9012-54-8)，得酶解体系Ⅰ，进行第一次酶解反应。在酶解体系Ⅰ中纤维素酶的质量浓度为3％，酶解反应时长为30min，温度为50℃。
[0045] 第一次酶解反应结束后，调节pH值至9.5，然后加入碱性蛋白酶(麦克林，P824138，CAS号：9014-01-1)，得酶解体系Ⅱ，进行第二次酶解反应。碱性蛋白酶在酶解体系Ⅱ中的质量浓度为5％，第二次酶解反应的时长为55min，温度为40℃。
[0046] 第二次酶解反应结束后3000rpm离心20min后取固相，得沉淀A。将沉淀A加入体积分数为80％的乙醇溶液中，得洗涤体系。其中，沉淀A和乙醇溶液的用量比为1g：10ml，然后搅拌洗涤体系60min，再过滤取固相，得沉淀B。
[0047] 步骤(3)：在沉淀B中加入体积分数为60％的乙醇溶液，得提取体系，沉淀B和乙醇溶液的用量比为1g：20ml。超声处理提取体系后，过滤取液相，使用旋转蒸发仪(温度为50℃，真空度为-0.05Mpa，旋蒸5h)浓缩后，得粗提物。超声处理提取体系的时长为60min，超声功率为250W，上述超声过程在室温下进行。
[0048] 步骤(4)：将粗提物加入水中，搅拌直至溶解完全，得纯化体系，粗提物和水的用量比为1g：12ml。使用石油醚在50℃的环境中萃取纯化体系，石油醚与纯化体系的体积比为1:1，萃取过程重复3次，合并每次萃取获得的水相部分，弃石油醚相，合并的水相即为纯化液A。然后在纯化液A中加入活性炭，活性炭在纯化液A中的质量百分数为2％，搅拌60min后静置10min，然后过滤取液相部分，得纯化液B。
[0049] 步骤(5)：在温度为50℃、真空度为-0.05Mpa的条件下，使用旋转蒸发仪对纯化液B进行减压蒸发处理4h，得到浓缩物A，然后使用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下，将浓缩物A蒸干，获得干粉状的青皮提取物。
[0050] 实施例2：
[0051] 澳洲坚果青皮提取物制备实例
[0052] 澳洲坚果青皮提取物的制备步骤如下：
[0053] 步骤(1)：取新鲜的澳洲坚果青皮洗净后阴干，粉碎后过40目，得青皮粉；
[0054] 步骤(2)：在每1g青皮粉中加入15ml水，再加入纤维素酶(aladdin，C298989，CAS号：9012-54-8)，得酶解体系Ⅰ，进行第一次酶解反应。在酶解体系Ⅰ中纤维素酶的质量浓度为2％，酶解反应时长为30min，温度为40℃。
[0055] 第一次酶解反应结束后，调节pH值至10.5，然后加入碱性蛋白酶(麦克林，P824138，CAS号：9014-01-1)，得酶解体系Ⅱ，进行第二次酶解反应。碱性蛋白酶在酶解体系Ⅱ中的质量浓度为5％，第二次酶解反应的时长为40min，温度为40℃。
[0056] 第二次酶解反应结束后3000rpm离心30min后取固相，得沉淀A。将沉淀A加入体积分数为95％的乙醇溶液中，得洗涤体系。其中，沉淀A和乙醇溶液的用量比为1g：15ml，然后搅拌洗涤体系30min，再过滤取固相，得沉淀B。
[0057] 步骤(3)：在沉淀B中加入体积分数为50％的乙醇溶液，得提取体系，沉淀B和乙醇溶液的用量比为1g：20ml。超声处理提取体系后，过滤取液相，使用旋转蒸发仪(温度为50℃，真空度为-0.05Mpa，旋蒸5h)浓缩后，得粗提物。超声处理提取体系的时长为60min，超声功率为250W，上述超声过程在室温下进行。
[0058] 步骤(4)：将粗提物加入水中，搅拌直至溶解完全，得纯化体系，粗提物和水的用量比为1g：12ml。使用石油醚在50℃的环境中萃取纯化体系，石油醚与纯化体系的体积比为1:1，萃取过程重复3次，合并每次萃取获得的水相部分，弃石油醚相，合并的水相即为纯化液A。然后在纯化液A中加入活性炭，活性炭在纯化液A中的质量百分数为2.5％，搅拌60min后静置20min，然后过滤取液相部分，得纯化液B。
[0059] 步骤(5)：在温度为50℃、真空度为-0.05Mpa的条件下，使用旋转蒸发仪对纯化液B进行减压蒸发处理4h，得到浓缩物A，然后使用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下，将浓缩物A蒸干，获得干粉状的青皮提取物。
[0060] 实施例3：澳洲坚果青皮提取物制备实例
[0061] 澳洲坚果青皮提取物的制备步骤如下：
[0062] 步骤(1)：取新鲜的澳洲坚果青皮洗净后阴干，粉碎后过40目，得青皮粉；
[0063] 步骤(2)：在每1g青皮粉中加入18ml水，再加入纤维素酶(aladdin，C298989，CAS号：9012-54-8)，得酶解体系Ⅰ，进行第一次酶解反应。在酶解体系Ⅰ中纤维素酶的质量浓度为4％，酶解反应时长为25min，温度为55℃。
[0064] 第一次酶解反应结束后，调节pH值至10.0，然后加入碱性蛋白酶(麦克林，P824138，CAS号：9014-01-1)，得酶解体系Ⅱ，进行第二次酶解反应。碱性蛋白酶在酶解体系Ⅱ中的质量浓度为4％，第二次酶解反应的时长为65min，温度为50℃。
[0065] 第二次酶解反应结束后3000rpm离心30min后取固相，得沉淀A。将沉淀A加入体积分数为90％的乙醇溶液中，得洗涤体系。其中，沉淀A和乙醇溶液的用量比为1g：10ml，然后搅拌洗涤体系50min，再过滤取固相，得沉淀B。
[0066] 步骤(3)：在沉淀B中加入体积分数为60％的乙醇溶液，得提取体系，沉淀B和乙醇溶液的用量比为1g：18ml。超声处理提取体系后，过滤取液相，使用旋转蒸发仪(温度为50℃，真空度为-0.05Mpa，旋蒸5h)浓缩后，得粗提物。超声处理提取体系的时长为50min，超声功率为300W，上述超声过程在室温下进行。
[0067] 步骤(4)：将粗提物加入水中，搅拌直至溶解完全，得纯化体系，粗提物和水的用量比为1g：15ml。使用石油醚在50℃的环境中萃取纯化体系，石油醚与纯化体系的体积比为1:1，萃取过程重复3次，合并每次萃取获得的水相部分，弃石油醚相，合并的水相即为纯化液A。然后在纯化液A中加入活性炭，活性炭在纯化液A中的质量百分数为0.5％，搅拌90min后静置20min，然后过滤取液相部分，得纯化液B。
[0068] 步骤(5)：在温度为50℃、真空度为-0.05Mpa的条件下，使用旋转蒸发仪对纯化液B进行减压蒸发处理4h，得到浓缩物A，然后使用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下，将浓缩物A蒸干，获得干粉状的青皮提取物。
[0069] 对比例1
[0070] 本对比例基本同实施例1，不同点在于步骤(2)，本实施例中未使用到纤维素酶，具体如下：
[0071] 步骤(2)：在每1g青皮粉中加入20ml水，调节pH值至9.5，然后加入碱性蛋白酶，得酶解体系，进行酶解反应。碱性蛋白酶在酶解体系Ⅱ中的质量浓度为5％，酶解反应的时长为55min，温度为40℃。酶解反应结束后3000rpm离心20min后取固相，得沉淀A。将得沉淀A加入体积分数为80％的乙醇溶液中，得洗涤体系。其中，沉淀A和乙醇溶液的用量比为1g：10ml，然后搅拌洗涤体系60min，再过滤取固体部分，得沉淀B。
[0072] 对比例2
[0073] 本对比例基本同实施例1，不同点在于步骤(2)，本实施例中未使用到碱性蛋白酶，具体如下：
[0074] 步骤(2)：在每1g青皮粉中加入20ml水，再加入纤维素酶(aladdin，C298989，CAS号：9012-54-8)，得酶解体系，进行酶解反应。在酶解体系中纤维素酶的质量浓度为3％，酶解反应时长为30min，温度为50℃。
[0075] 酶解反应结束后，3000rpm离心20min后取固相，得沉淀A。将沉淀A加入体积分数为80％的乙醇溶液中，得洗涤体系。其中，沉淀A和乙醇溶液的用量比为1g：10ml，然后搅拌洗涤体系60min，再过滤取固相，得沉淀B。
[0076] 对比例3
[0077] 本对比例基本同实施例1，不同点在于步骤(2)，在进行第二次酶解之后没有使用乙醇溶液洗涤，具体如下：
[0078] 步骤(2)：在每1g青皮粉中加入20ml水，再加入纤维素酶(aladdin，C298989，CAS号：9012-54-8)，得酶解体系Ⅰ，进行第一次酶解反应。在酶解体系Ⅰ中纤维素酶的质量浓度为3％，酶解反应时长为30min，温度为50℃。
[0079] 第一次酶解反应结束后，调节pH值至9.5，然后加入碱性蛋白酶(麦克林，P824138，CAS号：9014-01-1)，得酶解体系Ⅱ，进行第二次酶解反应。碱性蛋白酶在酶解体系Ⅱ中的质量浓度为5％，第二次酶解反应的时长为55min，温度为40℃。
[0080] 第二次酶解反应结束后3000rpm离心20min后取固相，得沉淀A。将沉淀A直接用于后续的超声提取中。
[0081] 对比例4
[0082] 本对比例基本同实施例1，不同点在于本对比例中不设置步骤(2)，直接对青皮粉进行超声提取，是现有技术中的常规方法，具体如下：
[0083] 直接在青皮粉中加入体积分数为60％的乙醇溶液，然后进行超声提取以及纯化，过程同实例1的步骤(3)-步骤(5)。
[0084] 对比例5
[0085] 本对比例基本同实施例1，不同点在于：纤维素酶的用量为6％，酶解反应时长为90min。
[0086] 对比例6
[0087] 本对比例基本同实施例1，不同点在于：纤维素酶的用量为1％，酶解反应时长为10min。
[0088] 实验例：提取量的测定
[0089] 对实施例1-3和对比例1-4中的青皮提取物进行提取率的计算，计算方法为：总提取量(mg/100g)＝青皮提取物的质量(mg)/青皮粉的质量(g)×100，计算结果如表1所示。
[0090] 对实施例1-3和对比例1-4中的青皮提取物进行HPLC检测。实验中使用的豆腐果苷标准品(纯度大于98％)、熊果苷标准品(纯度大于98％)和天麻苷标准品(纯度大于98％)均购自飞宇生物。分别精密称定豆腐果苷、天麻苷和熊果苷标准品各10mg，分别置于10mL容量瓶中，使每1mL中含标准品1mg，加乙腈定容，摇匀，作为对照品溶液，备用。将实施例1-3和对比例1-4中的青皮提取物10mg置100mL容量瓶中，加乙腈定容，作为供试品溶液备用。准确吸取供试品溶液5μL，注入高效液相色谱仪进行色谱测定。色谱条件为：色谱仪为安捷伦1200系列，色谱柱为Eclipse XDB-C18(4.6×150mm,5μm)，柱温为25℃，流动相为乙腈：水＝10：90(V/V)，紫外检测波长为270nm，进样量为5μl，流速为1mL/min。对青皮提取物的豆腐果苷、天麻苷和熊果苷的检测结果如表1所示，以mg/100g来表示，即每100g青皮粉中含有目的成分(豆腐果苷、天麻苷或熊果苷)的量(mg)。
[0091] 对实施例1-3和对比例1-4中的青皮提取物进行总多酚含量的检测。实验中使用的没食子酸标准品(纯度大于98％)购自飞宇生物。使用没食子酸标准品配制0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0mg/mL的标准溶液，分别取上述浓度的标准溶液各5ml，分别加入2mL 10％福林酚试剂和2mL10％Na2CO3溶液，混匀，然后避光反应45min，以不加没食子酸标准溶液为空白对照，在760nm波长处测吸光值，制作标准曲线。将实施例1-3和对比例
1-4中的青皮提取物分别取1mg溶解于4ml水中(使用10ml容量瓶)，分别加入2mL 10％福林酚试剂和2mL10％Na2CO3溶液，混匀，再定容至10ml，然后避光反应45min，再测760nm吸光值，通过没食子酸的标准曲线计算对实施例1-3和对比例1-4中的青皮提取物中总多酚的提取量，以mg/100g表示，每100g青皮粉中含有目的成分(总多酚)的量(mg)。
1-4中的青皮提取物分别取1mg溶解于4ml水中(使用10ml容量瓶)，分别加入2mL 10％福林酚试剂和2mL10％Na2CO3溶液，混匀，再定容至10ml，然后避光反应45min，再测760nm吸光值，通过没食子酸的标准曲线计算对实施例1-3和对比例1-4中的青皮提取物中总多酚的提取量，以mg/100g表示，每100g青皮粉中含有目的成分(总多酚)的量(mg)。
[0092] 在表1中，部分计算方式如下：
[0093] 豆腐果苷占总提取物比例(R1)＝豆腐果苷提取量/总提取量×100％
[0094] 豆腐果苷占总多酚比例(R1’)＝豆腐果苷提取量/总多酚提取量×100％[0095] 熊果苷占总提取物比例(R2)＝熊果苷提取量/总提取量×100％
[0096] 熊果苷占总多酚比例(R2’)＝熊果苷提取量/总多酚提取量×100％
[0097] 天麻苷占总提取物比例(R3)＝天麻苷提取量/总提取量×100％
[0098] 天麻苷占总多酚比例(R3’)＝天麻苷提取量/总多酚提取量×100％
[0099] 表1：实施例1-3和对比例1-4中的青皮提取物含量测定结果
[0100]
[0101] 实施例1-3中青皮提取物的三种酚苷(豆腐果苷、熊果苷和天麻苷)的含量均较高。
[0102] 对比例1未使用纤维素酶进行酶解，直接加入了碱性蛋白酶，由于青皮细胞壁没有被破坏，碱性蛋白酶无法充分作用到位于细胞壁处的蛋白质上，无法有效的将非目的多酚类等成分去除，导致虽然总提取物和总多酚的量较高，但是在青皮提取物中豆腐果苷、熊果苷和天麻苷的提取量并没有得到提升。对比例6仅使用了少量纤维素酶进行酶解，且酶解时间短，也出现了类似对比例1的情况。
[0103] 对比例2未使用碱性蛋白酶降解蛋白质，导致该制备过程中没有将非目的多酚类物质去除的步骤，本制备方案的总提取物含量和总多酚含量较高，但是目的成分的含量低。
[0104] 对比例3不含酒精洗涤步骤，导致青皮细胞上有非目的多酚的残留，降低了青皮提取物中豆腐果苷、熊果苷和天麻苷的含量。
[0105] 对比例4在进行超声提取之前没有使用酶解步骤，没有将非目的物质去除，虽然总提取物含量和总多酚含量较高，但是在青皮提取物中豆腐果苷、熊果苷和天麻苷的含量并没有得到提升，说明对比例4的方法提取出来的非目的成分较多(杂质较多)，对后续分离纯化出豆腐果苷、熊果苷和天麻苷等目的化合物造成了较大的干扰。
[0106] 对比例5中使用纤维素酶的量较大和酶解的时间较长，细胞被充分破坏，大量的细胞内容物溶出，目的成分不再被包裹在细胞中，而是被提前溶出。后续的超声提取等步骤是取沉淀部分进行，而目的成分大部分已经溶出，不在沉淀当中，导致本对比例中提取了大量杂质，目的成分非常少。
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