用于改善线粒体功能的含有心磷脂的脂质体
阅读：438发布：2024-02-18
专利汇可以提供用于改善线粒体功能的含有心磷脂的脂质体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 公开了含有脂质体、心磷脂和至少一种抗 氧 化剂的组合物，其中所述组合物用于改善、维持或恢复线粒体膜和/或线粒体功能。一个实例中，所述脂质体主要由磷脂酰胆 碱 构成，心磷脂是四油酰-心磷脂，至少一种抗 氧化剂 是龙胆酸甲酯、l-肌肽或二者。所述组合物可局部 给药 、口服给药或胃肠外给药，例如注射给药。如果是局部给药，所述组合物可以是例如霜剂、洗剂、凝胶、糊剂、喷雾剂、补剂或其他合适的形式，或可含有各种添加剂，例如，一种或多种润肤剂、湿润剂、渗透增强剂、维生素、香料、色素和 保湿剂 。，下面是用于改善线粒体功能的含有心磷脂的脂质体专利的具体信息内容。
1.用于改善、维持或恢复线粒体功能的存贮稳定的组合物，其包含脂质体，其中所述脂质体具有形成自磷脂酰胆碱的磷脂双层，并具有包埋在磷脂双层中的心磷脂和龙胆酸甲酯、以及含于脂质体的水性中心内的l-肌肽，其中所述心磷脂选自四油酰-心磷脂、四棕榈油酰心磷脂或四肉豆蔻酰心磷脂，其中所述组合物在10℃～60℃的温度下保存时是稳定的，且不易受到实质性的氧化损伤。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述心磷脂是四油酰-心磷脂。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述心磷脂是四肉豆蔻酰心磷脂。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述所述心磷脂是四棕榈油酰心磷脂。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含：
0.01-10重量％的四油酰-心磷脂；
0.01-10重量％的龙胆酸甲酯；和
0.01-10重量％的l-肌肽。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体还包含下述物质中的一种或多种：胆固醇、胆固醇硫酸酯、神经酰胺、植物甾醇和糖。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述脂质体还包含下述物质中的一种或多种：胆固醇、胆固醇硫酸酯、神经酰胺、植物甾醇和糖。
8.如权利要求6所述的组合物，其中所述组合物以霜剂、洗剂、凝胶、补剂、水包油型乳液、油包水型乳液、糊剂或喷雾剂形式局部给药。
9.如权利要求7所述的组合物，其中所述组合物以霜剂、洗剂、凝胶、补剂、水包油型乳液、油包水型乳液、糊剂或喷雾剂形式局部给药。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含润肤剂、湿润剂、渗透增强剂、维生素、香料、色素和保湿剂中的一种或多种。
用于改善线粒体功能的含有心磷脂的脂质体
背景技术
[0001] 氧自由基或活性氧类(reactive oxygen species)(ROS)是具有高度反应性的物质，已知它们是脂类、蛋白质、酸等的细胞氧化和后续功能修复的主要因子。实际上，活性氧
已被认为是衰老和包括癌症在内的几种疾病的主要诱因。具体而言，已知ROS损害线粒体。
线粒体的氧损伤据认为是细胞老化和细胞最终死亡的主要因素。
已被认为是衰老和包括癌症在内的几种疾病的主要诱因。具体而言，已知ROS损害线粒体。
线粒体的氧损伤据认为是细胞老化和细胞最终死亡的主要因素。
[0002] 线粒体是体内每个细胞的组成部分，其含有遗传物质。实际上，在所有真核细胞中都可发现线粒体。线粒体负责加工氧并将食物中的物质转化为细胞作用所必需的能量。线
粒体产生三磷酸腺苷(ATP)形式的能量，然后三磷酸腺苷被转运到细胞的胞质中用于多种
细胞功能。线粒体被称为细胞的动力工厂，因为线粒体产生的ATP供应多细胞生物所用代
谢能量的大约90％。
粒体产生三磷酸腺苷(ATP)形式的能量，然后三磷酸腺苷被转运到细胞的胞质中用于多种
细胞功能。线粒体被称为细胞的动力工厂，因为线粒体产生的ATP供应多细胞生物所用代
谢能量的大约90％。
[0003] 线粒体在氧代谢中的作用使其成为氧自由基伤害的主要靶标。具体来讲，线粒体呼吸链(即电子传递链)已被鉴定为ROS的主要细胞内来源。线粒体中ATP的形成导致释
放高反应性的超氧自由基，它们可转化为其他ROS，例如过氧化氢和羟基自由基。细胞具有
应对这种氧化应激(oxidativestress)的机制，但是这种应对的效率随着年龄(的增加)
和外来因素(例如应激)的影响而下降。最终，线粒体丧失了产生ATP的能力和效率，导致
细胞功能的丧失，甚至常常导致细胞死亡。
放高反应性的超氧自由基，它们可转化为其他ROS，例如过氧化氢和羟基自由基。细胞具有
应对这种氧化应激(oxidativestress)的机制，但是这种应对的效率随着年龄(的增加)
和外来因素(例如应激)的影响而下降。最终，线粒体丧失了产生ATP的能力和效率，导致
细胞功能的丧失，甚至常常导致细胞死亡。
[0004] ROS能够通过降解线粒体内膜中的蛋白质和脂类而损伤线粒体。最具伤害性的ROS物质之一是造成脂类过氧化的羟基自由基。因为脂类过氧化随时间而增加，所以线粒
体内膜中的主要脂类之一——心磷脂产生结构变化。这些结构变化对内膜及相关的心磷脂
蛋白相互作用造成伤害，而这些对电子传递至关重要。例如，在健康的、功能正常的线粒体
中，细胞色素c连接于心磷脂。但是当心磷脂降解之后，细胞色素c被释放，继而引发级联
事件，导致程序性细胞死亡。
体内膜中的主要脂类之一——心磷脂产生结构变化。这些结构变化对内膜及相关的心磷脂
蛋白相互作用造成伤害，而这些对电子传递至关重要。例如，在健康的、功能正常的线粒体
中，细胞色素c连接于心磷脂。但是当心磷脂降解之后，细胞色素c被释放，继而引发级联
事件，导致程序性细胞死亡。
[0005] 有提议认为外源加入心磷脂可能会使整体的线粒体功能不良得到改善。然而，在尝试外源递送心磷脂的过程中遇到了很多困难。心磷脂不稳定，并且极易氧化降解。例如，
人心磷脂含有多不饱和脂肪酸，其中超过85％属于亚油酸系列。与饱和或单不饱和脂肪酸
不同，多不饱和脂肪酸(如亚油酸)容易被ROS降解。此外，在基于复杂、功能完全的细胞
的模型中，预期简单的局部给予心磷脂不能够穿透到线粒体内膜中，在体内尤其如此，因为
体内会发生心磷脂的氧化降解并且存在运送屏障。
人心磷脂含有多不饱和脂肪酸，其中超过85％属于亚油酸系列。与饱和或单不饱和脂肪酸
不同，多不饱和脂肪酸(如亚油酸)容易被ROS降解。此外，在基于复杂、功能完全的细胞
的模型中，预期简单的局部给予心磷脂不能够穿透到线粒体内膜中，在体内尤其如此，因为
体内会发生心磷脂的氧化降解并且存在运送屏障。
[0006] 当前还有几种其他方法来解决线粒体功能不良的问题，但每一种方法都不能解决与线粒体老化相关的最重要的线粒体衰竭问题，因此这些方法都存在局限性。例如，提议的
一种解决方案旨在通过仅提供产ATP的底物从而增加ATP产量，但是这种方案完全没有解
决整体的线粒体功能不良问题。针对线粒体功能不良提议的另一种解决方案基于外源加入
抗氧化剂。这种方法通过维持线粒体的现有状态和功能而取得了一定程度的成功。然而，
这种方法没有解决已有损伤的修复问题，因此也不是一种理想的解决方案。例如还有一种
解决方案是 具体来说是NeoPharm(Waukegan，伊利诺斯州)公司的脂偶联的
吉西他滨(Lipid Conjugate Gemcitabine)(心磷脂偶联的吉西他滨)。 是一
种包埋在磷脂酰胆碱脂质体中的阳离子修饰的心磷脂。然而，即使是这种解决方案对于旨
在治疗线粒体失常的局部给药来说也并不理想。
一种解决方案旨在通过仅提供产ATP的底物从而增加ATP产量，但是这种方案完全没有解
决整体的线粒体功能不良问题。针对线粒体功能不良提议的另一种解决方案基于外源加入
抗氧化剂。这种方法通过维持线粒体的现有状态和功能而取得了一定程度的成功。然而，
这种方法没有解决已有损伤的修复问题，因此也不是一种理想的解决方案。例如还有一种
解决方案是 具体来说是NeoPharm(Waukegan，伊利诺斯州)公司的脂偶联的
吉西他滨(Lipid Conjugate Gemcitabine)(心磷脂偶联的吉西他滨)。 是一
种包埋在磷脂酰胆碱脂质体中的阳离子修饰的心磷脂。然而，即使是这种解决方案对于旨
在治疗线粒体失常的局部给药来说也并不理想。
[0007] 简述
[0008] 线粒体功能不良与氧化损伤直接相关，氧化损伤包括ROS引起的脂类过氧化和心磷脂从线粒体膜中缺失。线粒体功能不良还与细胞老化和死亡直接相关。本发明基于一种
独特的组合物，它不仅维持了线粒体功能，而且还改善和恢复了线粒体功能和/或修复了
线粒体膜。具体而言，本发明组合物是包埋了心磷脂的脂质体与抗氧化剂的独特组合。
独特的组合物，它不仅维持了线粒体功能，而且还改善和恢复了线粒体功能和/或修复了
线粒体膜。具体而言，本发明组合物是包埋了心磷脂的脂质体与抗氧化剂的独特组合。
[0009] 一个实例中，本发明的组合物是包埋了心磷脂和抗氧化剂的脂质体。
[0010] 另一个实例中，本发明的组合物是脂质体，例如包埋有心磷脂和一种或多种抗氧化剂，主要由磷脂酰胆碱构成的脂质体，其中所述心磷脂是四油酰-心磷脂
(tetraoleoyl-cardiolipin)、四棕榈油酰-心磷脂(tetrapalmitoleoyl-cardiolipin)
或四肉豆蔻酰-心磷脂 (tetramyristoyl-cardiolipin)之一，并包埋在脂质体的磷脂双
层中；所述一种或多种抗氧化剂包埋在脂质体的磷脂双层或水性中心中，或包埋在两者中。
一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是水溶性抗氧化剂。另一个实例中，所述至少一种抗
氧化剂可以是脂溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是单线态氧清除剂
(singlet-oxygen scavenger)。另一个实例中，包含在本发明组合物中的抗氧化剂可以是
水溶性单线态氧清除剂或脂溶性单线态氧清除剂。
(tetraoleoyl-cardiolipin)、四棕榈油酰-心磷脂(tetrapalmitoleoyl-cardiolipin)
或四肉豆蔻酰-心磷脂 (tetramyristoyl-cardiolipin)之一，并包埋在脂质体的磷脂双
层中；所述一种或多种抗氧化剂包埋在脂质体的磷脂双层或水性中心中，或包埋在两者中。
一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是水溶性抗氧化剂。另一个实例中，所述至少一种抗
氧化剂可以是脂溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是单线态氧清除剂
(singlet-oxygen scavenger)。另一个实例中，包含在本发明组合物中的抗氧化剂可以是
水溶性单线态氧清除剂或脂溶性单线态氧清除剂。
[0011] 另一个实例中，本发明的组合物是主要由磷脂酰胆碱构成的脂质体，其包埋有心磷脂，例如四油酰-心磷脂和至少一种抗氧化剂，例如甲基龙胆酸酯(或龙胆酸甲酯)和
l-肌肽中的一种或多种。
l-肌肽中的一种或多种。
[0012] 另一个实例中，本发明的组合物是脂质体，例如主要由磷脂酰胆碱构成的脂质体，其中包埋有得自种子油的心磷脂和至少一种抗氧化剂。另一个实例中，所述至少一种抗氧
化剂可以是龙胆酸甲酯、l-肌肽、丁羟甲苯(butylated hydroxytoluene)(BHT)、叔丁基氢
醌(TBHQ)或它们的一些组合。
化剂可以是龙胆酸甲酯、l-肌肽、丁羟甲苯(butylated hydroxytoluene)(BHT)、叔丁基氢
醌(TBHQ)或它们的一些组合。
[0013] 另一个实例中，本发明的组合物可包含一种或多种脂类、磷脂、渗透增强剂、保湿剂、香料、神经酰胺、鞘脂、蛋白、胆固醇、植物甾醇(phytosterol)、硫酸胆固醇
(cholesterol sulfate)、糖、维生素、矿物质或细胞膜中天然存在的任何其他化合物。
(cholesterol sulfate)、糖、维生素、矿物质或细胞膜中天然存在的任何其他化合物。
[0014] 一个实例中，本发明化合物以霜剂、洗剂、凝胶、补剂(tonic)、水包油型乳液、油包水型乳液、糊剂或喷雾剂的形式局部给药。其他实例中，本发明化合物可口服给药或胃肠外
给药，例如注射给药。
给药，例如注射给药。
[0015] 另一个实例中，本发明组合物在室温(约68°F/21.1℃)储存以下任何一段时间都是稳定的且不易发生实质性的氧化损伤：从至少1小时到1天、到几天、到1周、到几周、
到1个月、到几个月、到1年、到几年。
到1个月、到几个月、到1年、到几年。
[0017] 另一个实例中，本发明提供改善、恢复或维持线粒体功能的方法，其包括局部给予组合物，所述组合物包含包埋有心磷脂和抗氧化剂的脂质体。一 个实例中，所述脂质体主
要由磷脂酰胆碱构成，并包埋有心磷脂和一种或多种抗氧化剂，其中心磷脂是例如四棕榈
油酰-心磷脂、四肉豆蔻酰-心磷脂或四油酰-心磷脂之一并包埋在脂质体的磷脂双层中；
所述一种或多种抗氧化剂包埋在脂质体的磷脂双层或脂质体的水性中心中，或包埋在两者
中。一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是水溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧
化剂可以是脂溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是单线态氧清除剂。另
一个实例中，包含在本发明组合物中的抗氧化剂可以是水溶性单线态氧清除剂或脂溶性单
线态氧清除剂。另一个实例中，所述包埋在脂质体中的抗氧化剂可以是龙胆酸甲酯、l-肌
肽或两者。
要由磷脂酰胆碱构成，并包埋有心磷脂和一种或多种抗氧化剂，其中心磷脂是例如四棕榈
油酰-心磷脂、四肉豆蔻酰-心磷脂或四油酰-心磷脂之一并包埋在脂质体的磷脂双层中；
所述一种或多种抗氧化剂包埋在脂质体的磷脂双层或脂质体的水性中心中，或包埋在两者
中。一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是水溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧
化剂可以是脂溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是单线态氧清除剂。另
一个实例中，包含在本发明组合物中的抗氧化剂可以是水溶性单线态氧清除剂或脂溶性单
线态氧清除剂。另一个实例中，所述包埋在脂质体中的抗氧化剂可以是龙胆酸甲酯、l-肌
肽或两者。
[0018] 另一个实例中，本发明是修复线粒体膜的方法，其包括局部给予组合物，所述组合物包含包埋有心磷脂和抗氧化剂的脂质体。一个实例中，所述脂质体主要由磷脂酰胆碱构
成，并包埋有心磷脂和一种或多种抗氧化剂，其中心磷脂优选是四棕榈油酰-心磷脂、四肉
豆蔻酰-心磷脂或四油酰-心磷脂之一并包埋在脂质体的磷脂双层中；所述一种或多种抗
氧化剂包埋在脂质体的磷脂双层或脂质体的水性中心中，或包埋在两者中。一个实例中，至
少一种抗氧化剂可以是水溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是脂溶性
抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是单线态氧清除剂。另一个实例中，包含
在本发明组合物中的抗氧化剂可以是水溶性单线态氧清除剂或脂溶性单线态氧清除剂。另
一个实例中，所述包埋在脂质体中的抗氧化剂可以是龙胆酸甲酯、l-肌肽或两者。
成，并包埋有心磷脂和一种或多种抗氧化剂，其中心磷脂优选是四棕榈油酰-心磷脂、四肉
豆蔻酰-心磷脂或四油酰-心磷脂之一并包埋在脂质体的磷脂双层中；所述一种或多种抗
氧化剂包埋在脂质体的磷脂双层或脂质体的水性中心中，或包埋在两者中。一个实例中，至
少一种抗氧化剂可以是水溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是脂溶性
抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是单线态氧清除剂。另一个实例中，包含
在本发明组合物中的抗氧化剂可以是水溶性单线态氧清除剂或脂溶性单线态氧清除剂。另
一个实例中，所述包埋在脂质体中的抗氧化剂可以是龙胆酸甲酯、l-肌肽或两者。
[0020] 图1是线粒体的图示，其显示线粒体的(1)嵴、(2)基质、(3)外膜和(4)内膜。
[0021] 图2是心磷脂的化学结构的图示。
[0022] 图3是脂质体的图示，其显示磷脂双层(1)，其包括亲水性脂质头部(2)；疏水性脂质尾部(3)；水性中心(4)；和疏水性尾部之间的空间(5)。
[0023] 图4是磷脂酰胆碱的化学结构的图示。
[0024] 图5是示出ATP产生的图，使用以下物质实现ATP产生：(a)l-肌肽；(b)1％DC龙胆酸甲酯；(c)空脂质体(只有心磷脂)；(d)加载的脂质体(即加载有 l-肌肽、龙胆酸甲
酯和心磷脂的脂质体)；和(e)加载的脂质体(即加载有l-肌肽、龙胆酸甲酯和心磷脂的
脂质体)。
酯和心磷脂的脂质体)；和(e)加载的脂质体(即加载有l-肌肽、龙胆酸甲酯和心磷脂的
脂质体)。
[0025] 图6比较了使用带有ESI的Zeiss-902电子显微镜拍摄的两幅TEM图片(照片)。图6(a)是含有包埋有心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体的标准霜剂制剂的TEM图片
(照片)。图6(a)中的TEM图片(照片)是在制成霜剂制剂之后未经任何存储而立即拍摄
的，所述霜剂含有包埋有心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体。图6(b)是与图6(a)相同
的含有包埋有心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体的标准霜剂制剂的TEM图片(照片)，
但图6(b)是霜剂制剂在50℃存储1个月后拍摄的。
(照片)。图6(a)中的TEM图片(照片)是在制成霜剂制剂之后未经任何存储而立即拍摄
的，所述霜剂含有包埋有心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体。图6(b)是与图6(a)相同
的含有包埋有心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体的标准霜剂制剂的TEM图片(照片)，
但图6(b)是霜剂制剂在50℃存储1个月后拍摄的。
[0026] 详述
[0027] 应理解，本发明不限于本文描述的具体组合物、方法学或方案规程。此外，除非另有定义，本文使用的所有科技术语与本发明所属领域的普通技术人员常规理解的含义相
同。还应理解，本文所用术语只是出于描述具体实例的目的，并非用于限制本发明范围，本
发明范围仅由权利要求限定。
同。还应理解，本文所用术语只是出于描述具体实例的目的，并非用于限制本发明范围，本
发明范围仅由权利要求限定。
[0028] 本发明基于如下惊人发现：当施用(例如局部施用)包埋有心磷脂和至少一种抗氧化剂的脂质体的独特组合时，能够改善、保持或恢复线粒体功能和/或修复线粒体膜。一
个实例中，本发明的脂质体例如主要由磷脂酰胆碱构成；所述心磷脂是例如四油酰-心磷
脂、四棕榈油酰-心磷脂或四肉豆蔻酰-心磷脂之一；所述抗氧化剂是例如龙胆酸甲酯和
l-肌肽中的一种或多种。
个实例中，本发明的脂质体例如主要由磷脂酰胆碱构成；所述心磷脂是例如四油酰-心磷
脂、四棕榈油酰-心磷脂或四肉豆蔻酰-心磷脂之一；所述抗氧化剂是例如龙胆酸甲酯和
l-肌肽中的一种或多种。
[0029] 此外，本发明的独特组合具有这样的惊人优点：在约室温或更高温度下储存时是稳定的并且抗氧化损伤、降解或不稳定性。例如，如下文实施例3中所讨论的，包含主要由
磷脂酰胆碱构成并包埋有四油酰-心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体的本发明组合物
在50℃的存贮条件下储存至少1个月而显示明显的稳定性。
磷脂酰胆碱构成并包埋有四油酰-心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体的本发明组合物
在50℃的存贮条件下储存至少1个月而显示明显的稳定性。
[0030] 据信，在本发明中，所述至少一种抗氧化剂使心磷脂稳定，直到心磷脂被递送到细胞中，例如通过局部施用含有本发明脂质体的组合物。一个实例中，所述稳定心磷脂的至少
一种抗氧化剂是龙胆酸甲酯，它是一种保护心磷脂不被氧化的强抗氧化剂。此外，由于脂质
体递送技术的性质，脂质体含有水性内部(water interior)。参见例如图3。为防止心磷
脂在脂质体中被氧化，本发明可包含第二抗氧化剂，例如l-肌肽，它是一种基于肽的水溶
性强抗氧化剂。
一种抗氧化剂是龙胆酸甲酯，它是一种保护心磷脂不被氧化的强抗氧化剂。此外，由于脂质
体递送技术的性质，脂质体含有水性内部(water interior)。参见例如图3。为防止心磷
脂在脂质体中被氧化，本发明可包含第二抗氧化剂，例如l-肌肽，它是一种基于肽的水溶
性强抗氧化剂。
[0031] 由于本发明既含有抗氧化剂(例如l-肌肽)来保护细胞不受氧化损伤，又含有心磷脂(例如四油酰-心磷脂)来改善、维持或恢复线粒体功能和/或修复线粒体膜，因此本
发明的组合物可实现改善细胞功能。通过例如体外测试数据，提供了证明改善、维持或恢复
线粒体功能活性的支持证据。例如，实施例2中所讨论的方法表明，施用包含主要由磷脂酰
胆碱构成并包埋有四油酰-心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体的本发明组合物所导致
的ATP产量比任何单独成分都要高得多。
发明的组合物可实现改善细胞功能。通过例如体外测试数据，提供了证明改善、维持或恢复
线粒体功能活性的支持证据。例如，实施例2中所讨论的方法表明，施用包含主要由磷脂酰
胆碱构成并包埋有四油酰-心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽的脂质体的本发明组合物所导致
的ATP产量比任何单独成分都要高得多。
[0032] 线粒体
[0033] 在所有细胞中以不同数量存在的线粒体(存在量取决于细胞的代谢活性)是本发明组合物的意向靶标。实际上，本发明组合物设计用于将心磷脂递送到线粒体的整体结构
(线粒体膜)中。
(线粒体膜)中。
[0034] 线粒体是杆状细胞器，可认为它是细胞中将氧气和营养物转换为三磷酸腺苷(ATP)的动力发生器。ATP是细胞中为细胞代谢活性提供能量的化学能量“流”。任何给
定细胞中线粒体的数目几乎完全取决于该细胞的代谢活性。线粒体柔性很大，活细胞的时
间推移研究已证明，线粒体几乎一直在迅速发生形状改变并在细胞内到处移动。线粒体运
动似乎在某些方面(insome way)同细胞中存在的微管相联系，线粒体可能沿着动力蛋白
(motorprotein)的网络移动。因此，基于细胞的具体需要和其微管网络的特征，可将线粒体
组织成为冗长的移动链、紧密压缩成相对稳定的群(groups)或成为很多其他的形态。
定细胞中线粒体的数目几乎完全取决于该细胞的代谢活性。线粒体柔性很大，活细胞的时
间推移研究已证明，线粒体几乎一直在迅速发生形状改变并在细胞内到处移动。线粒体运
动似乎在某些方面(insome way)同细胞中存在的微管相联系，线粒体可能沿着动力蛋白
(motorprotein)的网络移动。因此，基于细胞的具体需要和其微管网络的特征，可将线粒体
组织成为冗长的移动链、紧密压缩成相对稳定的群(groups)或成为很多其他的形态。
[0035] 线粒体具有精巧的结构，这种结构对该细胞器发挥功能至关重要。两个特化的膜包围着细胞中存在的线粒体，将该细胞器分为狭窄的膜间间隙和大得多的内部基质，它们
各自含有高度特化的蛋白质。线粒体外膜含有由通道蛋白形成的很多通道，并起类似筛的
作用，将太大的分子过滤掉。类似地，高度回旋形成很多内折(称为嵴)的内膜也只允许某
些分子通过它，并且比外膜的选择性更大。为确保只有对基质非常重要的那些物质进入内
膜，内膜利用了一组只转运正确分子的转运蛋白。线粒体的各腔室(compartments)一起能
够协调地工作，通过复杂的多步过程产生ATP。
各自含有高度特化的蛋白质。线粒体外膜含有由通道蛋白形成的很多通道，并起类似筛的
作用，将太大的分子过滤掉。类似地，高度回旋形成很多内折(称为嵴)的内膜也只允许某
些分子通过它，并且比外膜的选择性更大。为确保只有对基质非常重要的那些物质进入内
膜，内膜利用了一组只转运正确分子的转运蛋白。线粒体的各腔室(compartments)一起能
够协调地工作，通过复杂的多步过程产生ATP。
[0036] 具体而言，ATP是通过复杂的反应链产生的：通过4种复合体传递电子并驱使质子浓度累加、产生质子运动力。所述4种复合体是NADH脱氢 酶、琥珀酸脱氢酶
(succinate dehydrogenase)、bci复合体和细胞色素c氧化酶。电子传递和相关的氧
化磷酸化发生在线粒体内膜中，内膜中约含有75％的蛋白质和20％的心磷脂。对官能
完整性而言，不可或缺的是在内膜脂类、心磷脂和包含复合体的蛋白质及转运载体之间
形成的四元结构。例如Mileykovskaya等所报道的，细胞色素C氧化酶和含有紧密结合
的心磷脂的ATP/ADP载体，它们对于结构和功能都非常重要。参见，Mileykovskaya等，
“Cardiolipin in Energy Transducing Membranes.”Biochemistry(Mosc).2005.70(2)：
154-8，其全部内容通过参考纳入本文。此外，Gorbenko等详细描述了细胞色素c和心磷
脂之间的相互作用。参见Gorbenko等，″Cytochrome c Interaction with心磷脂/
Phosphatidylcholine ModelMembranes：Effect of 心磷脂 on Protonation.″Biophys
J.2006.90(11)：4093-103，其全部内容通过参考纳入本文.另参见Petrosillo
等， ″ Roleof Reactive Oxygen Species and Cardiolipin in the Release of
Cytochrome cfrom Mitochondria.″FASEB J.2003.17：2202-2208，其全部内容通过参考
纳入本文。另外，Paradies等已证明在电子传递机制中心磷脂和复合体III之间存在重
要(pivotal)关系。参见Paradies等，″Reactive oxygen speciesgenerated by the
mitochondrial respiratory chain affect the complex IIIactivity via Cardiolipin
peroxidation in beef-heart submitochondrialparticles.″Mitochondrion 2001.1：
151-159，其全部内容通过参考纳入本文。另参见Paradies等，″Reactive oxygen species
affect mitochondrial electrontransport complex I activity through oxidative
Cardiolipin damage.″Gene.2002.286：135-141，其全部内容通过参考纳入本文。
(succinate dehydrogenase)、bci复合体和细胞色素c氧化酶。电子传递和相关的氧
化磷酸化发生在线粒体内膜中，内膜中约含有75％的蛋白质和20％的心磷脂。对官能
完整性而言，不可或缺的是在内膜脂类、心磷脂和包含复合体的蛋白质及转运载体之间
形成的四元结构。例如Mileykovskaya等所报道的，细胞色素C氧化酶和含有紧密结合
的心磷脂的ATP/ADP载体，它们对于结构和功能都非常重要。参见，Mileykovskaya等，
“Cardiolipin in Energy Transducing Membranes.”Biochemistry(Mosc).2005.70(2)：
154-8，其全部内容通过参考纳入本文。此外，Gorbenko等详细描述了细胞色素c和心磷
脂之间的相互作用。参见Gorbenko等，″Cytochrome c Interaction with心磷脂/
Phosphatidylcholine ModelMembranes：Effect of 心磷脂 on Protonation.″Biophys
J.2006.90(11)：4093-103，其全部内容通过参考纳入本文.另参见Petrosillo
等， ″ Roleof Reactive Oxygen Species and Cardiolipin in the Release of
Cytochrome cfrom Mitochondria.″FASEB J.2003.17：2202-2208，其全部内容通过参考
纳入本文。另外，Paradies等已证明在电子传递机制中心磷脂和复合体III之间存在重
要(pivotal)关系。参见Paradies等，″Reactive oxygen speciesgenerated by the
mitochondrial respiratory chain affect the complex IIIactivity via Cardiolipin
peroxidation in beef-heart submitochondrialparticles.″Mitochondrion 2001.1：
151-159，其全部内容通过参考纳入本文。另参见Paradies等，″Reactive oxygen species
affect mitochondrial electrontransport complex I activity through oxidative
Cardiolipin damage.″Gene.2002.286：135-141，其全部内容通过参考纳入本文。
[0037] 线粒体在凋亡诱导中起关键作用。细胞色素c从线粒体中的释放似乎是凋亡级联诱导中的中心事件，最终导致程序性细胞死亡。然而，细胞色素c从线粒体中释放并引发级
联反应的机制似乎很大程度上是由ROS介导的。此外，已证明细胞色素c从线粒体中释放
之前先从线粒体内膜解离。细胞色素c与线粒体内膜磷脂(主要是心磷脂分子)的外表面
结合。已对细胞色素c和心磷脂的结合进行了广泛研究，并已阐释了这种相互作用的某些
分子方面。心磷脂富含不饱和脂肪酸，这似乎对心磷脂与细胞色素c结合从而将该蛋白锚
定到膜上是必要的。预期ROS对心磷脂的氧化损伤可能会妨碍细胞 色素c与线粒体内膜
上的磷脂相互作用，进而诱导细胞色素c从内膜上解离，使其释放到线粒体外的空间中。因
此，已报道了由于脂类过氧化造成的细胞色素c和心磷脂之间的分子相互作用的丧失。此
外，已发现在凋亡过程中由于氧化损伤或其生物合成途径的改变而造成的心磷脂含量变化
会引发细胞色素c从线粒体中释放。
联反应的机制似乎很大程度上是由ROS介导的。此外，已证明细胞色素c从线粒体中释放
之前先从线粒体内膜解离。细胞色素c与线粒体内膜磷脂(主要是心磷脂分子)的外表面
结合。已对细胞色素c和心磷脂的结合进行了广泛研究，并已阐释了这种相互作用的某些
分子方面。心磷脂富含不饱和脂肪酸，这似乎对心磷脂与细胞色素c结合从而将该蛋白锚
定到膜上是必要的。预期ROS对心磷脂的氧化损伤可能会妨碍细胞 色素c与线粒体内膜
上的磷脂相互作用，进而诱导细胞色素c从内膜上解离，使其释放到线粒体外的空间中。因
此，已报道了由于脂类过氧化造成的细胞色素c和心磷脂之间的分子相互作用的丧失。此
外，已发现在凋亡过程中由于氧化损伤或其生物合成途径的改变而造成的心磷脂含量变化
会引发细胞色素c从线粒体中释放。
[0038] 心磷脂
[0039] 心磷脂包埋在本发明脂质体中，供递送到线粒体中。只在细菌膜和线粒体膜中发现心磷脂。心磷脂的这种在线粒体膜中独特和有限的定位显示本发明脂质体将靶向，和/
或包埋在脂质体中的心磷脂将靶向线粒体膜。
或包埋在脂质体中的心磷脂将靶向线粒体膜。
[0040] 此外，如上所述，心磷脂是线粒体内膜的主要成分，负责调节线粒体多种独立的功能。实际上，由于心磷脂是线粒体的特殊脂类成分，心磷脂在该细胞器中的生物功能显然是
非常重要的。例如，心磷脂至少部分负责维持膜的流动性。实际上，当线粒体失去心磷脂时，
它将变得更加僵硬，失去其官能性并最终导致细胞死亡。因此，本发明组合物的一个附加优
点是，将心磷脂递送到线粒体和线粒体膜中，这将有助于维持、恢复或修复线粒体和/或线
粒体膜的流动性。
非常重要的。例如，心磷脂至少部分负责维持膜的流动性。实际上，当线粒体失去心磷脂时，
它将变得更加僵硬，失去其官能性并最终导致细胞死亡。因此，本发明组合物的一个附加优
点是，将心磷脂递送到线粒体和线粒体膜中，这将有助于维持、恢复或修复线粒体和/或线
粒体膜的流动性。
[0041] 如上所述，心磷脂主要位于线粒体内膜上，在那里它和大量线粒体蛋白相互作用。这种相互作用影响某些酶(特别是牵涉氧化磷酸化的那些酶)的功能活化。所有牵涉氧化
磷酸化的线粒体蛋白复合体都含有整合入其四元结构的心磷脂分子，它们是复合体和其环
境之间或复合体内各亚基之间界面的重要成分。
磷酸化的线粒体蛋白复合体都含有整合入其四元结构的心磷脂分子，它们是复合体和其环
境之间或复合体内各亚基之间界面的重要成分。
[0042] 由于线粒体心磷脂分子的不饱和脂肪酸含量高并且它们在线粒体内膜中的位置靠近ROS产生的位点，因此线粒体心磷脂分子是氧自由基攻击的靶标。从线粒体膜中去除
心磷脂导致复合体崩裂并丧失官能性。例如，心磷脂在细胞色素bc1复合体中起到关键作
用，细胞色素bc1复合体是呼吸链中的一种膜蛋白复合体，它将泛醇和细胞色素c之间的电
子传递与跨脂质双层的质子易位相偶联。具体而言，1个心磷脂分子结合到靠近泛醌还原位
点，据信这确保了催化位点的稳定性并参与摄取质子。
心磷脂导致复合体崩裂并丧失官能性。例如，心磷脂在细胞色素bc1复合体中起到关键作
用，细胞色素bc1复合体是呼吸链中的一种膜蛋白复合体，它将泛醇和细胞色素c之间的电
子传递与跨脂质双层的质子易位相偶联。具体而言，1个心磷脂分子结合到靠近泛醌还原位
点，据信这确保了催化位点的稳定性并参与摄取质子。
[0043] 心磷脂是一种具有不寻常结构，尤其富含不饱和脂肪酸的磷脂。通常，亚油酸占心磷脂中存在的不饱和脂肪酸的至少85％。因此，在一个实例中，将包 含约85％亚油酸
的心磷脂包埋在脂质体中，例如包埋在脂质体的磷脂双层中。在另本发明的一个实例中，
将四油酰-心磷脂包埋在脂质体中。四油酰-心磷脂由四个油酸组分构成(C18:1，四油
酰-心磷脂)，其与亚油酸心磷脂相比更不易受到氧化损伤和破坏。其它实例中，本发明的
心磷脂可以是四棕榈油酰-心磷脂、四肉豆蔻酰-心磷脂、或得自种子油的心磷脂。可用
于本发明组合物和方法中的心磷脂的其他例子可购自例如 Polar Lipids，Inc.
(Alabaster，AL)。可购自 Polar Lipids，Inc.的心磷脂的例子包括如下：1’，
1’，2’，2’-四肉豆蔻酰心磷脂(铵盐)(产品号770332)；1’，1’，2’，2’-四肉豆蔻酰心磷
脂(钠盐)(产品号750332或710335)；1’，1’-油酰-2’，2’-(12-生物素基(氨基十二烷
酰))心磷脂(铵盐)(产品号860564)；心磷脂(大肠杆菌，二钠盐)(产品号841199)；心
磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号770012)；心磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号840012)；氢
化心磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号830057)；双溶性心磷脂(Dilysocardiolipin)(心，
牛-二钠盐)(产品号850082)；双溶性心磷脂(心，钠盐)；氢化心磷脂(心)；可溶性心磷
脂(lysocardiolipin)；单可溶性心磷脂(Monolysocardiolipin)(心，牛-二钠盐)(产品
号850081)；以及单可溶性心磷脂(心，钠盐)。
的心磷脂包埋在脂质体中，例如包埋在脂质体的磷脂双层中。在另本发明的一个实例中，
将四油酰-心磷脂包埋在脂质体中。四油酰-心磷脂由四个油酸组分构成(C18:1，四油
酰-心磷脂)，其与亚油酸心磷脂相比更不易受到氧化损伤和破坏。其它实例中，本发明的
心磷脂可以是四棕榈油酰-心磷脂、四肉豆蔻酰-心磷脂、或得自种子油的心磷脂。可用
于本发明组合物和方法中的心磷脂的其他例子可购自例如 Polar Lipids，Inc.
(Alabaster，AL)。可购自 Polar Lipids，Inc.的心磷脂的例子包括如下：1’，
1’，2’，2’-四肉豆蔻酰心磷脂(铵盐)(产品号770332)；1’，1’，2’，2’-四肉豆蔻酰心磷
脂(钠盐)(产品号750332或710335)；1’，1’-油酰-2’，2’-(12-生物素基(氨基十二烷
酰))心磷脂(铵盐)(产品号860564)；心磷脂(大肠杆菌，二钠盐)(产品号841199)；心
磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号770012)；心磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号840012)；氢
化心磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号830057)；双溶性心磷脂(Dilysocardiolipin)(心，
牛-二钠盐)(产品号850082)；双溶性心磷脂(心，钠盐)；氢化心磷脂(心)；可溶性心磷
脂(lysocardiolipin)；单可溶性心磷脂(Monolysocardiolipin)(心，牛-二钠盐)(产品
号850081)；以及单可溶性心磷脂(心，钠盐)。
[0044] 另一个实例中，包埋在脂质体中的心磷脂可以是双磷脂酰甘油或更确切地讲是1，3-双(sn-3′-磷脂酰)-sn-甘油(1，3-bis(sn-3′-phosphatidyl)-sn-glycerol)。所
有形式的心磷脂一般都具有二聚体结构，有4个酰基，可能携带两个负电荷。参见例如图2。
即使带有4个相同的酰基，由于存在两个手性中心(每个外部甘油基团中各一个)，心磷脂
仍然具有两个化学上不同的磷脂酰部分。这会产生非对映异构体，虽然天然的二磷脂酰甘
油具有R/R构型。结果，两个磷酸根(phosphate)基团具有不同的化学环境。相对于中心
的甘油，它们分别称为1’-磷酸根和3’-磷酸根。每种形式的心磷脂含有一个酸性质子，
但它们的酸性水平不同，例如pK1＝2.8，pK2＞7.5。第2个磷酸根的酸性弱据信是由于和
中心的2′-羟基形成了稳定的分子内氢键。实际上，在正常的生理条件下，心磷脂分子可
能仅带有一个负电荷。此外，心磷脂模型显示，其磷酸根可形成紧密的(tight)双环结构，
如果捕获了质子，形成酸-阴离子，得到非常紧密的结构。
有形式的心磷脂一般都具有二聚体结构，有4个酰基，可能携带两个负电荷。参见例如图2。
即使带有4个相同的酰基，由于存在两个手性中心(每个外部甘油基团中各一个)，心磷脂
仍然具有两个化学上不同的磷脂酰部分。这会产生非对映异构体，虽然天然的二磷脂酰甘
油具有R/R构型。结果，两个磷酸根(phosphate)基团具有不同的化学环境。相对于中心
的甘油，它们分别称为1’-磷酸根和3’-磷酸根。每种形式的心磷脂含有一个酸性质子，
但它们的酸性水平不同，例如pK1＝2.8，pK2＞7.5。第2个磷酸根的酸性弱据信是由于和
中心的2′-羟基形成了稳定的分子内氢键。实际上，在正常的生理条件下，心磷脂分子可
能仅带有一个负电荷。此外，心磷脂模型显示，其磷酸根可形成紧密的(tight)双环结构，
如果捕获了质子，形成酸-阴离子，得到非常紧密的结构。
[0045] 在动物组织中，据信心磷脂是胆固醇从线粒体膜外部易位到内部的重要因子，在生成类固醇的组织中，心磷脂激活线粒体胆固醇侧链的断裂，是胆固醇生成的强效刺激物。
心磷脂还可在将蛋白质输入线粒体中起到特定作用。它以高度特异性的方式结合于染色质
中的DNA，实际上所有存在于染色质中的心磷脂均结合于DNA，在染色质中心磷脂和DNA均
具有共同的“磷酸间”结构的动力。因此，心磷脂似乎在调节基因表达中具有功能性作用。
例如，与X染色体连锁的Barth综合征——一种人类疾病(心肌症)和心磷脂的脂肪酸组
成严重异常(即四-亚油酸分子种类的减少以及单溶性心磷脂的积累)有关。
心磷脂还可在将蛋白质输入线粒体中起到特定作用。它以高度特异性的方式结合于染色质
中的DNA，实际上所有存在于染色质中的心磷脂均结合于DNA，在染色质中心磷脂和DNA均
具有共同的“磷酸间”结构的动力。因此，心磷脂似乎在调节基因表达中具有功能性作用。
例如，与X染色体连锁的Barth综合征——一种人类疾病(心肌症)和心磷脂的脂肪酸组
成严重异常(即四-亚油酸分子种类的减少以及单溶性心磷脂的积累)有关。
[0046] 抗氧化剂
[0047] 根据本发明，至少一种抗氧化剂与心磷脂一起包埋在脂质体中。抗氧化剂可以例如包埋在脂质体的磷脂双层中、包埋在脂质体的水性中心中、或包埋在二者中。如上所述，
包含在本发明组合物中的抗氧化剂可通过保护心磷脂不受来自脂质体的水性中心或来自
脂质体外部的ROS的氧化损伤或降解来发挥作用。实际上，细胞中抗氧化剂的一个主要作
-
用是防止因ROS的作用而引起的损伤。活性氧类包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2)和
-
自由基，例如羟基自由基(OH)。这些分子不稳定，具有高度反应性，可通过化学链式反应
(如脂类超氧化)而损伤细胞。
包含在本发明组合物中的抗氧化剂可通过保护心磷脂不受来自脂质体的水性中心或来自
脂质体外部的ROS的氧化损伤或降解来发挥作用。实际上，细胞中抗氧化剂的一个主要作
-
用是防止因ROS的作用而引起的损伤。活性氧类包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2)和
-
自由基，例如羟基自由基(OH)。这些分子不稳定，具有高度反应性，可通过化学链式反应
(如脂类超氧化)而损伤细胞。
[0048] 很多抗氧化剂可包含在本发明组合物中。例如，包埋在本发明脂质体中的抗氧化剂可以是水溶性的，因此可包埋在脂质体的水性中心中。另一个实例中，包埋在脂质体中的
抗氧化剂可以是脂溶性的，因此可包埋在脂质体的脂质双层中。另一个实例中，包埋在本
发明脂质体中的抗氧化剂可以是单线态氧清除剂。另一个实例中，抗氧化剂可以是水溶性
的并且是单线态氧清除剂，或者是脂溶性的并且是单线态氧清除剂。另一个实例中，可将多
于一种抗氧化剂包埋在本发明脂质体中。例如，可将一种或多种以下抗氧化剂包埋在本发
明的脂质体中：龙胆酸甲酯、l-肌肽、丁羟甲苯(BHT)、叔丁基氢醌(TBHQ)、或它们的一些组
合。
抗氧化剂可以是脂溶性的，因此可包埋在脂质体的脂质双层中。另一个实例中，包埋在本
发明脂质体中的抗氧化剂可以是单线态氧清除剂。另一个实例中，抗氧化剂可以是水溶性
的并且是单线态氧清除剂，或者是脂溶性的并且是单线态氧清除剂。另一个实例中，可将多
于一种抗氧化剂包埋在本发明脂质体中。例如，可将一种或多种以下抗氧化剂包埋在本发
明的脂质体中：龙胆酸甲酯、l-肌肽、丁羟甲苯(BHT)、叔丁基氢醌(TBHQ)、或它们的一些组
合。
[0049] 一个实施例中，龙胆酸甲酯用作本发明的抗氧化剂，因为龙胆酸甲酯是脂溶性的并且能够稳定心磷脂。虽然下文讨论的实施例1说明龙胆酸甲酯不显示明显的防止氧化应
激的作用，但龙胆酸甲酯具有高的氧自由基吸收能力 (″ORAC″)(25,605μmol Teq/g)，
表明它是一种很强的抗氧化剂。所以，有可能基于其ORAC值来选择用于本发明的抗氧化
剂，例如通过选择ORAC值高的抗氧化剂。因此，在一个实例中，选择龙胆酸甲酯用于本发
明，因为龙胆酸甲酯的ORAC值高。在这种实例中，本发明包括包埋有心磷脂和龙胆酸甲酯
的脂质体(例如包埋在脂质体的磷脂双层中)。
激的作用，但龙胆酸甲酯具有高的氧自由基吸收能力 (″ORAC″)(25,605μmol Teq/g)，
表明它是一种很强的抗氧化剂。所以，有可能基于其ORAC值来选择用于本发明的抗氧化
剂，例如通过选择ORAC值高的抗氧化剂。因此，在一个实例中，选择龙胆酸甲酯用于本发
明，因为龙胆酸甲酯的ORAC值高。在这种实例中，本发明包括包埋有心磷脂和龙胆酸甲酯
的脂质体(例如包埋在脂质体的磷脂双层中)。
[0050] 另一个实例中，l-肌肽用作本发明的抗氧化剂，因为它是水溶性的并且能够保护心磷脂不受脂质体水性中心的氧化损伤。因此，在一个实例中，脂质体水性中心含有l-肌
肽。另一个实例中，脂质体的磷脂双层包埋有心磷脂和龙胆酸甲酯，脂质体水性中心含有
l-肌肽。
肽。另一个实例中，脂质体的磷脂双层包埋有心磷脂和龙胆酸甲酯，脂质体水性中心含有
l-肌肽。
[0051] 另一个实例中，包埋在本发明脂质体中的抗氧化剂可以是在线粒体中发现的抗氧化剂，例如谷胱甘肽。已证明当人为耗竭细胞中的谷胱甘肽时，氧化损伤增加。线粒体中的
谷胱甘肽水平可能比细胞其他部位中的谷胱甘肽水平更重要。相对于细胞其他部位中的谷
胱甘肽水平，线粒体谷胱甘肽水平随年龄降低得更多。这种降低似乎使线粒体更容易受到
氧化损伤。
谷胱甘肽水平可能比细胞其他部位中的谷胱甘肽水平更重要。相对于细胞其他部位中的谷
胱甘肽水平，线粒体谷胱甘肽水平随年龄降低得更多。这种降低似乎使线粒体更容易受到
氧化损伤。
[0052] 抗坏血酸(即维生素C)和维生素E(即生育酚)是和心磷脂一起包埋在本发明脂质体中的其他抗氧化剂例子。应理解，很多其他抗氧化剂可包埋在本发明脂质体中。
[0053] 脂质体
[0054] 根据本发明，用脂质体将心磷脂(可能和抗氧化剂一起)递送到线粒体中。已知脂质体是局部施用化妆品和皮肤病学产品时有效的药物递送系统。具体说，脂质体是一种
球形小泡(spherical vesicle)，具有由磷脂双层构成的膜。脂质体可包含多种磷脂，所述
磷脂包括具有混合脂质链的天然来源的磷脂(例如卵磷脂酰乙醇胺)，或由纯成分构成，例
如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。脂质体通常尺寸小，在约25-1000nm范围内。脂质体是
一种由磷脂双层构成的封闭结构，能够在磷脂双层的水性核中包裹水溶性、亲水分子，在疏
水性区域中包裹油溶性、疏水分子。图3表示脂质体的一般结构。通常，脂质体可以是中性
(neutral)脂质体、阴离子(negative)脂质体或阳离子(positive)脂质体。例如，阳离子
脂质体可形成自含有磷脂酰胆碱、胆固醇、心磷脂和磷脂酰丝氨酸的溶液。脂质体可以是多
层小泡和单层小泡的混合物。
球形小泡(spherical vesicle)，具有由磷脂双层构成的膜。脂质体可包含多种磷脂，所述
磷脂包括具有混合脂质链的天然来源的磷脂(例如卵磷脂酰乙醇胺)，或由纯成分构成，例
如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。脂质体通常尺寸小，在约25-1000nm范围内。脂质体是
一种由磷脂双层构成的封闭结构，能够在磷脂双层的水性核中包裹水溶性、亲水分子，在疏
水性区域中包裹油溶性、疏水分子。图3表示脂质体的一般结构。通常，脂质体可以是中性
(neutral)脂质体、阴离子(negative)脂质体或阳离子(positive)脂质体。例如，阳离子
脂质体可形成自含有磷脂酰胆碱、胆固醇、心磷脂和磷脂酰丝氨酸的溶液。脂质体可以是多
层小泡和单层小泡的混合物。
[0055] 脂质体的脂质双层可与其他双层(例如细胞膜和/或线粒体膜)融合，因此可递送脂质体的内容物。所以，在一个实例中，本发明通过与线粒体膜融合并将包埋的心磷脂递
送到线粒体而实现改善、维持、恢复或修复线粒体和/或线粒体膜。
送到线粒体而实现改善、维持、恢复或修复线粒体和/或线粒体膜。
[0056] 如上所述，脂质体由磷脂构成。磷脂分子具有亲水性“头部基团(headgroup)”和由两个酰基链构成的疏水性“尾部”。磷脂的水溶性取决于疏水性尾部的长度和头部基团与
水的亲和性两者。例如，各酰基链含有14个或更多个直链(未分支)饱和C-C形式碳原子
的纯脂质不溶于水。通常，随着脂质的酰基链长度增加，临界胶束浓度迅速降低。
水的亲和性两者。例如，各酰基链含有14个或更多个直链(未分支)饱和C-C形式碳原子
的纯脂质不溶于水。通常，随着脂质的酰基链长度增加，临界胶束浓度迅速降低。
[0057] 本发明的脂质体可主要由存在于细胞膜中的脂类构成，包括磷脂、神经酰胺、鞘脂、胆固醇、甘油三酯或其他脂质，例如来自植物的植物甾醇。一个实例中，本发明中使用的
脂质体可主要由磷脂酰胆碱构成。磷脂酰胆碱是一种磷脂，它是细胞膜的主要组成成分。磷
脂酰胆碱也称为1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(1，2-dihexadecanoyl-sn-glyc
ero-3-phosphocholine)、PtdCho和卵磷脂。不饱和磷脂酰胆碱含有胆碱、Ω-6不饱和脂肪
酸(例如亚油酸)、Ω-3脂肪酸(例如γ-亚麻酸)，甘油酯残基含量低(或没有)。图4
显示了磷脂酰胆碱的化学结构。磷脂酰胆碱对于正常的细胞膜组成和修复都是重要的。
脂质体可主要由磷脂酰胆碱构成。磷脂酰胆碱是一种磷脂，它是细胞膜的主要组成成分。磷
脂酰胆碱也称为1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(1，2-dihexadecanoyl-sn-glyc
ero-3-phosphocholine)、PtdCho和卵磷脂。不饱和磷脂酰胆碱含有胆碱、Ω-6不饱和脂肪
酸(例如亚油酸)、Ω-3脂肪酸(例如γ-亚麻酸)，甘油酯残基含量低(或没有)。图4
显示了磷脂酰胆碱的化学结构。磷脂酰胆碱对于正常的细胞膜组成和修复都是重要的。
[0058] 具体而言，磷脂酰胆碱在维持细胞膜完整性方面的作用对所有基本的生物学过程都非常重要，这些生物学过程包括细胞中发生的从DNA到RNA到蛋白质的信息流、细胞能量
的形成和细胞内通讯或信号转导。磷脂酰胆碱，尤其是富含多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱
对细胞膜具有明显的流化作用。细胞膜流动性减小和细胞膜完整性的破坏以及细胞膜修复
机制的损伤与很多疾病相关，这些疾病包括肝脏疾病、神经疾病、各种癌症及细胞死亡。
的形成和细胞内通讯或信号转导。磷脂酰胆碱，尤其是富含多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱
对细胞膜具有明显的流化作用。细胞膜流动性减小和细胞膜完整性的破坏以及细胞膜修复
机制的损伤与很多疾病相关，这些疾病包括肝脏疾病、神经疾病、各种癌症及细胞死亡。
[0059] 因此，本发明组合物的一个实例(具体是当脂质体主要由磷脂酰胆碱构成时)的附加优点是脂质体可为细胞膜和线粒体膜提供额外的磷脂酰胆碱。
[0060] 脂质体研究的进展已使得脂质体能够避免被身体免疫系统(具体而言是网状内皮系统(RES)的细胞)探测到。此类脂质体称为“秘密(stealth)脂质体”，构建有PEG(聚
乙二醇)作为涂层。在体内呈惰性的PEG涂层使药物递送系统的循环时间更长。因此，本
发明的组合物可以是脂质体，所述脂质体主要由磷脂酰胆碱构成并包埋有心磷脂(例如四
油酰-心磷脂)和至少一种抗氧化剂(例 如龙胆酸甲酯和/或I-肌肽)，并可另外包含
PEG“秘密”涂层。除PEG涂层之外，本发明组合物中使用的秘密脂质体还可连接有配体，使
脂质体能够结合到递送的靶位点。
乙二醇)作为涂层。在体内呈惰性的PEG涂层使药物递送系统的循环时间更长。因此，本
发明的组合物可以是脂质体，所述脂质体主要由磷脂酰胆碱构成并包埋有心磷脂(例如四
油酰-心磷脂)和至少一种抗氧化剂(例 如龙胆酸甲酯和/或I-肌肽)，并可另外包含
PEG“秘密”涂层。除PEG涂层之外，本发明组合物中使用的秘密脂质体还可连接有配体，使
脂质体能够结合到递送的靶位点。
[0061] 在皮肤护理产品或化妆品中，可将脂质体配制在合适的基质例如浆液(serum)、洗液、凝胶或霜剂中。优选地，本发明的脂质体在不存在表面活性剂条件下制备。实际上，在
制备本发明脂质体时，本领域技术人员将理解，使脂质体不稳定的因素包括表面活性剂、温
度、pH和脂类过氧化。因此，应加以必要的小心以减少这些因素带来的不良影响。
制备本发明脂质体时，本领域技术人员将理解，使脂质体不稳定的因素包括表面活性剂、温
度、pH和脂类过氧化。因此，应加以必要的小心以减少这些因素带来的不良影响。
[0062] 应理解，本发明的脂质体可用各种技术制备和/或从多种来源获得。例如，可用微流化技术、在水中声处理脂类、或用乳化剂(例如卵磷脂)在乳液中形成胶束来制备本
发明的脂质体。其他实例中，本发明脂质体可获得自Centerchem，Inc.，(Norwalk，CT)或
Lipotech(西班牙)。
发明的脂质体。其他实例中，本发明脂质体可获得自Centerchem，Inc.，(Norwalk，CT)或
Lipotech(西班牙)。
[0063] 用微流化技术制备本发明脂质体的一个优点是能够连续大量产生脂质体。微流化技术不需要任何有机溶剂来溶解脂类；而且该技术中可使用处于水相的高浓度脂类。因此，
微流化技术非常适合在化妆品领域例如本发明中使用。
微流化技术非常适合在化妆品领域例如本发明中使用。
[0064] 更具体地说，微流化技术包括将浆液状、浓缩的脂类/水分散液引入到微流化器中，微流化器在很高的压力(10,000-20,000psi)下将分散液泵送通过1-5μm孔径的滤器。
通过迫使以很高速度移动的流体进入两个预定的微通道而将该流体分为两股。然后使这两
股流体以正确的角度以非常高的速度碰撞在一起。高压力和高速度带来的大量能量使液体
自组装为脂质体。使末端处收集的流体再次通过直至获得看起来均质的分散液。
通过迫使以很高速度移动的流体进入两个预定的微通道而将该流体分为两股。然后使这两
股流体以正确的角度以非常高的速度碰撞在一起。高压力和高速度带来的大量能量使液体
自组装为脂质体。使末端处收集的流体再次通过直至获得看起来均质的分散液。
[0065] 如上所述，也可通过在水中声处理磷脂而获得脂质体。低剪切速率产生多层脂质体，其具有类似洋葱的许多层。连续的高剪切声处理趋于产生更小的单层脂质体。该技术
中，脂质体内容物可以和水相的内容物相同。
中，脂质体内容物可以和水相的内容物相同。
[0066] 表1(见下)显示了脂质体的一些例子，包括其大小、一般制备方法、相应的合适包裹容积(encapsulation volumn)、包裹效率(encapsulationefficiency)和POPC(1-棕榈
酰，2-油酰磷脂酰胆碱)分子的计算值。实际捕获体积或包裹效率根据脂质体制备方法、脂
类类型和活性物质本身而不同。负载的类型和数量影响脂质体稳定性。可溶于油的分子的
包裹效率接近100％， 因为这些分子例如心磷脂位于磷脂双层的疏水区。表1最后一栏显
示特定大小的POPC脂质体中POPC分子数目的计算值。表1还显示了主要热相变温度(Tm)，
该数值对于选择用于形成脂质体的脂类是非常重要的参数。它还可用于确定脂质体的合适
存贮条件。
酰，2-油酰磷脂酰胆碱)分子的计算值。实际捕获体积或包裹效率根据脂质体制备方法、脂
类类型和活性物质本身而不同。负载的类型和数量影响脂质体稳定性。可溶于油的分子的
包裹效率接近100％， 因为这些分子例如心磷脂位于磷脂双层的疏水区。表1最后一栏显
示特定大小的POPC脂质体中POPC分子数目的计算值。表1还显示了主要热相变温度(Tm)，
该数值对于选择用于形成脂质体的脂类是非常重要的参数。它还可用于确定脂质体的合适
存贮条件。
[0067] 表1：示例性脂质体的制备方法、特征和POPC分子的计算数目
[0068]
[0069]
[0070] 疏水和亲水分子均可包埋进脂质体中。如果脂质体制备过程中包埋有水溶性分子，则称为“被动加载”。被动加载可通过将亲水分子预先溶解在将用于水合无水脂类的缓
TM
冲液中来实现。因此，可通过针对空白缓冲液透析或使分散液通过Sephadex 凝胶柱来去
除没有被包埋的分子。对于大多数化妆品和个人护理产品而言，由于去除未包埋分子的过
程成本高，且常用水平的化妆品分子是无毒的，因此去除未包埋分子不是关键的。
TM
冲液中来实现。因此，可通过针对空白缓冲液透析或使分散液通过Sephadex 凝胶柱来去
除没有被包埋的分子。对于大多数化妆品和个人护理产品而言，由于去除未包埋分子的过
程成本高，且常用水平的化妆品分子是无毒的，因此去除未包埋分子不是关键的。
[0071] 与被捕获在脂质体核中的亲水分子相反，疏水分子通常被捕获在脂质双层的疏水区域中。该过程涉及分配加工，其中疏水分子和脂类一起溶解在合适的有机溶剂中。然后，
抽真空除去溶剂，然后使脂质水合。如果该分子可溶于乙醇，可将其与脂质一起溶解在乙醇
中；然后通过乙醇注射方法产生脂质体。在主动加载(也称为反相加载)中，首先在脂质体
内部和外部之间产生pH或离子梯度。首先在低pH(柠檬酸盐缓冲液，pH＝～4)制备空白
(空的)脂质体。然后将含有活性物质(例如弱有机酸)的高pH(pH＝～7.4)缓冲液加入
到空白脂质体中。由于pH梯度，活性物质(例如弱酸)在内部核中分配。
抽真空除去溶剂，然后使脂质水合。如果该分子可溶于乙醇，可将其与脂质一起溶解在乙醇
中；然后通过乙醇注射方法产生脂质体。在主动加载(也称为反相加载)中，首先在脂质体
内部和外部之间产生pH或离子梯度。首先在低pH(柠檬酸盐缓冲液，pH＝～4)制备空白
(空的)脂质体。然后将含有活性物质(例如弱有机酸)的高pH(pH＝～7.4)缓冲液加入
到空白脂质体中。由于pH梯度，活性物质(例如弱酸)在内部核中分配。
[0072] 影响脂质体的分子包埋效率的因素包括脂质体制备中所用的脂质组成、脂质体类型(SUV/LUV/MLV)、脂质体制备方法和脂质体的加载物。缓冲液强度(高强度的缓冲液降低
包裹的数量)和待包埋的分子性质也是影响包裹效率的重要因素。水溶性负载(由于与脂
质头部基团的相互作用)和疏水性负载(由于与双层膜的脂肪酸酰基链的相互作用)均影
响脂质双层对分子的包裹作用。最终，这些因素影响脂质体的稳定性。对于脂质体具有最
优的稳定性而言优选pH约6.5。
包裹的数量)和待包埋的分子性质也是影响包裹效率的重要因素。水溶性负载(由于与脂
质头部基团的相互作用)和疏水性负载(由于与双层膜的脂肪酸酰基链的相互作用)均影
响脂质双层对分子的包裹作用。最终，这些因素影响脂质体的稳定性。对于脂质体具有最
优的稳定性而言优选pH约6.5。
[0073] 本发明组合物
[0074] 因此，本发明组合物包含包埋有心磷脂和至少一种抗氧化剂的脂质体，可有效维持、恢复或改善线粒体功能和/或修复线粒体膜。应理解，本发明组合物可包含添加剂，例
如水、蓖麻油、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、玉米油、二甲基亚砜、乙二醇、异丙醇、大豆油、
丙三醇、可溶性胶原或高岭土。
如水、蓖麻油、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、玉米油、二甲基亚砜、乙二醇、异丙醇、大豆油、
丙三醇、可溶性胶原或高岭土。
[0075] 更具体地说，本发明组合物还可包含一种或多种湿润剂，包括但不限于：邻苯二甲酸二丁酯、可溶性胶原或2-吡咯烷酮-5-羧酸钠。可用于本发明中的湿润剂的其他例子可
见《CTFA化妆品成分手册》(CTFA CosmeticIngredient Handbook)，该手册相关部分通过参
考纳入本文。
见《CTFA化妆品成分手册》(CTFA CosmeticIngredient Handbook)，该手册相关部分通过参
考纳入本文。
[0076] 此外，本发明组合物还可包含一种或多种润肤剂，包括但不限于：丁烷-1，3-二醇；棕榈酸十六烷酯；二甲基聚硅氧烷；单蓖麻酸甘油酯；单硬脂酸甘油酯；棕榈酸异丁酯；
硬脂酸异十六烷酯；棕榈酸异丙酯；硬脂酸异丙酯；硬脂酸丁酯；月桂酸异丙酯；月桂酸己
酯；油酸癸酯；肉豆蔻酸异丙酯；乳酸十二烷酯；十八烷基-2-醇(octadecan-2-ol)；三辛
酸甘油酯(caprylic triglyceride)；三癸酸甘油酯(capric triglyceride)；聚乙二醇；
丙烷-1，2-二醇；三甘醇；芝麻油；椰子油；红花油；月桂酸异戊酯；壬基酚聚氧乙烯(9)
醚；泛醇；氢化植物油；乙酸生育酚酯；亚油酸生育酚酯；丙二醇；花生油；蓖麻油；异硬脂
酸；棕榈酸；亚油酸异丙酯；乳酸十二烷酯；乳酸十四烷酯；油酸癸酯；肉豆蔻酸十四烷酯。
可用于实施本发明的润肤剂的其他例于可见于《CTFA化妆品成分手册》中，该手册相关部分
通过参考纳入本文。
硬脂酸异十六烷酯；棕榈酸异丙酯；硬脂酸异丙酯；硬脂酸丁酯；月桂酸异丙酯；月桂酸己
酯；油酸癸酯；肉豆蔻酸异丙酯；乳酸十二烷酯；十八烷基-2-醇(octadecan-2-ol)；三辛
酸甘油酯(caprylic triglyceride)；三癸酸甘油酯(capric triglyceride)；聚乙二醇；
丙烷-1，2-二醇；三甘醇；芝麻油；椰子油；红花油；月桂酸异戊酯；壬基酚聚氧乙烯(9)
醚；泛醇；氢化植物油；乙酸生育酚酯；亚油酸生育酚酯；丙二醇；花生油；蓖麻油；异硬脂
酸；棕榈酸；亚油酸异丙酯；乳酸十二烷酯；乳酸十四烷酯；油酸癸酯；肉豆蔻酸十四烷酯。
可用于实施本发明的润肤剂的其他例于可见于《CTFA化妆品成分手册》中，该手册相关部分
通过参考纳入本文。
[0077] 其他实例中，本发明组合物还可含有一种或多种渗透增强剂，包括但不限于：吡咯烷酮，例如2-吡咯烷酮；醇，例如乙醇；烷醇如癸醇；二醇如丙二醇、二丙二醇、丁二醇；或
萜类。
萜类。
[0078] 本发明组合物还可含有多种已知的或常规的化妆品佐剂，只要它们对本发明组合物提供的维持、改善、恢复和修复线粒体的所需功能没有不利影响。例如，本发明组合
物还可包含本领域熟知的一种或多种添加剂或其他任选成分，包括但不限于填充剂(例
如，固体、半固体或液体等)；载体；稀释剂；增稠剂；胶凝剂；维生素，视黄素(retinoids)
和视黄醇(例如，维生素B3、维生素A等)；色素；香料；遮光剂(sunscreens)和防晒
剂(sunblocks)；去角质剂(exfoliants)；皮肤调理剂；保湿剂；神经酰胺、类神经酰胺
(pseudoceramides)、磷脂、鞘脂、胆固醇、葡糖胺、药学上可接受的渗透剂(例如，正癸基甲
基亚砜(n-decylmethyl sulfoxide)，卵磷脂有机凝胶、酪氨酸、赖氨酸，等)；杀菌剂；氨基
酸(例如脯氨酸)、吡咯烷酮羧酸、其衍生物及盐，异构糖(saccharide isomerate)、泛醇、
缓冲液连同基质(base)例如三乙醇胺或氢氧化钠；蜡，例如蜂蜡、地蜡、石蜡；植物提取物，
包括但不限于例如库拉索芦荟(Aloe Vera)、矢车菊、金缕梅(witch hazel)、接骨木的花
(elderflower)、黄瓜；不透明剂；悬浮剂；粘合剂；防腐剂；和它们的组合。其他合适的添加
剂和/或佐剂描述于美国专利6,184,247中，其全部内容通过参考纳入本文。
物还可包含本领域熟知的一种或多种添加剂或其他任选成分，包括但不限于填充剂(例
如，固体、半固体或液体等)；载体；稀释剂；增稠剂；胶凝剂；维生素，视黄素(retinoids)
和视黄醇(例如，维生素B3、维生素A等)；色素；香料；遮光剂(sunscreens)和防晒
剂(sunblocks)；去角质剂(exfoliants)；皮肤调理剂；保湿剂；神经酰胺、类神经酰胺
(pseudoceramides)、磷脂、鞘脂、胆固醇、葡糖胺、药学上可接受的渗透剂(例如，正癸基甲
基亚砜(n-decylmethyl sulfoxide)，卵磷脂有机凝胶、酪氨酸、赖氨酸，等)；杀菌剂；氨基
酸(例如脯氨酸)、吡咯烷酮羧酸、其衍生物及盐，异构糖(saccharide isomerate)、泛醇、
缓冲液连同基质(base)例如三乙醇胺或氢氧化钠；蜡，例如蜂蜡、地蜡、石蜡；植物提取物，
包括但不限于例如库拉索芦荟(Aloe Vera)、矢车菊、金缕梅(witch hazel)、接骨木的花
(elderflower)、黄瓜；不透明剂；悬浮剂；粘合剂；防腐剂；和它们的组合。其他合适的添加
剂和/或佐剂描述于美国专利6,184,247中，其全部内容通过参考纳入本文。
[0079] 本发明组合物还可含有其他非活性成分，包括但不限于共溶剂、赋形剂。有用的共溶剂包括醇和多元醇、聚乙二醇醚、酰胺、酯、其他合适溶剂，和它们的混合物。本发明组合
物还可包含赋形剂或添加剂例如甜味剂、调味剂、着色剂、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、粘度
调节剂、等张化剂(tonicifier)、加臭剂(odorant)、乳蚀剂(opacifier)、悬浮剂、粘合剂、
及它们的组合。
物还可包含赋形剂或添加剂例如甜味剂、调味剂、着色剂、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、粘度
调节剂、等张化剂(tonicifier)、加臭剂(odorant)、乳蚀剂(opacifier)、悬浮剂、粘合剂、
及它们的组合。
[0080] 可包含在本发明组合物中的其他添加剂对本领域技术人员而言是显而易见的，它们包含在本发明范围中。
[0081] 给药方式
[0082] 本发明组合物可口服给药、注射给药或局部给药。本发明组合物一般至少以天为基础给药。可在任何合适的时间段中给予本发明组合物。应理解， 美容增强程度和维持、
改善、恢复或修复线粒体的程度直接根据使用组合物的总量和频率而发生改变。
改善、恢复或修复线粒体的程度直接根据使用组合物的总量和频率而发生改变。
[0083] 可用本领域技术人员熟知的方法和技术制备有用的剂型，在生产合适剂型的过程中可包括使用其他成分。一个实例中，含有包埋了心磷脂的本发明脂质体和至少一种抗氧
化剂的本发明制剂至少每天局部给药一次。另一个实例中，该制剂可每天给药两次。另一
个实例中，该制剂可每天给药3-5次。另一个实例中，对每天给予的制剂数量无限制。
化剂的本发明制剂至少每天局部给药一次。另一个实例中，该制剂可每天给药两次。另一
个实例中，该制剂可每天给药3-5次。另一个实例中，对每天给予的制剂数量无限制。
[0084] 上文详细描述意在阐释本发明而非限制本发明。通过下文实验研究和实施例进一步阐释本发明，这些也不构成对本发明的限制。本申请中引用的所用参考文献、专利和公开
的专利申请的内容均通过参考纳入本文。
实施例
的专利申请的内容均通过参考纳入本文。
实施例
[0085] 实施例1：测定对氧化应激的保护
[0086] 本实施例中描述的试验测定发生在线粒体中的氧化应激。如上所讨论的，线粒体用于产生能量(ATP分子)的生化反应也会产生副产物即具有高度氧化性的超氧自由基。利
用流式细胞术，下文实施例通过监测用各测试物质处理后线粒体内的超氧化物状态来测定
各测试样本提供的针对氧化应激的保护。
用流式细胞术，下文实施例通过监测用各测试物质处理后线粒体内的超氧化物状态来测定
各测试样本提供的针对氧化应激的保护。
[0087] MitoSOX红(MitoSOX Red)线粒体超氧化物指示剂(Invitrogencat#M36008)是一种被线粒体选择性吸收的荧光染料。一旦进入线粒体中，MitoSOX与超氧化物自由基反应
形成结合于线粒体核酸的荧光产物(激发/发射最大值＝510/580nm)。较高的荧光读数对
应于线粒体内存在较高水平的超氧化物自由基。
形成结合于线粒体核酸的荧光产物(激发/发射最大值＝510/580nm)。较高的荧光读数对
应于线粒体内存在较高水平的超氧化物自由基。
[0088] 细胞培养：每个样本使用一个6孔板。可同时准备多个板。见表I中对板的描述。6
以1.5×10 个细胞/孔的密度将THP-1单核细胞(ATCC cat# TIB-202)接种于6孔板(含
有2毫升/孔的RMPI 1640培养基，补充有10％FBS)中，孵育1小时后处理。
以1.5×10 个细胞/孔的密度将THP-1单核细胞(ATCC cat# TIB-202)接种于6孔板(含
有2毫升/孔的RMPI 1640培养基，补充有10％FBS)中，孵育1小时后处理。
[0089] 表II：板描述
[0090]O22 O22 O22
OH Mm5 lm1：击攻 EE22 OH Mm5 lm1：击22 基养培lm1：击 H Mm5 lm1：击攻 液溶本样 H Mm5 lm1：击攻 液溶本样 H Mm5 lm1：击攻 液溶本样MG M 攻 攻 lm/g lm/g lm/g
μ00 基养 基养 μ00 μ00 μ00
3 lm 培lm 培lm 3 lm 3 lm 3 lm
1： 1： 1： 1： 1： 1：
理 理 理 理 理 理
处 处 处 处 处 处
胞 胞 胞 胞 胞 胞
细 细 细 细 细 细
个 个 个 个 个 个
6 01 6 01 6 01 6 01 6 01 6 01
×5.1 ×5.1 ×5.1 ×5.1 ×5.1 ×5.1
， ， ， ， ， ，
基 基 基 基 基 基
养 养 养 养 养 养
培 培 培 培 培 培
lm lm lm lm lm lm
2： 2： 2： 2： 2： 2：
容 载 载 载 载 载 载
内 加 加 加 加 加 加
1 2 3
# # #
照 照 照 复 复 复
对 对 对 重 重 重
述 性 性 常 本 本 本
描 阳 阴 正 样 样 样
孔 1 2 3 4 5 6
OH Mm5 lm1：击攻 EE22 OH Mm5 lm1：击22 基养培lm1：击 H Mm5 lm1：击攻 液溶本样 H Mm5 lm1：击攻 液溶本样 H Mm5 lm1：击攻 液溶本样MG M 攻 攻 lm/g lm/g lm/g
μ00 基养 基养 μ00 μ00 μ00
3 lm 培lm 培lm 3 lm 3 lm 3 lm
1： 1： 1： 1： 1： 1：
理 理 理 理 理 理
处 处 处 处 处 处
胞 胞 胞 胞 胞 胞
细 细 细 细 细 细
个 个 个 个 个 个
6 01 6 01 6 01 6 01 6 01 6 01
×5.1 ×5.1 ×5.1 ×5.1 ×5.1 ×5.1
， ， ， ， ， ，
基 基 基 基 基 基
养 养 养 养 养 养
培 培 培 培 培 培
lm lm lm lm lm lm
2： 2： 2： 2： 2： 2：
容 载 载 载 载 载 载
内 加 加 加 加 加 加
1 2 3
# # #
照 照 照 复 复 复
对 对 对 重 重 重
述 性 性 常 本 本 本
描 阳 阴 正 样 样 样
孔 1 2 3 4 5 6
[0091] 处理：谷胱甘肽单乙酯(Glutathione monoethylester)(GMEE，100μM终浓度)用作阳性对照。更具体地说，如下制备阳性对照：将4mg谷胱甘肽单乙酯溶解在10ml培养基
(补充有10％FBS的RMPI 1640培养基)中制备1.2mM储液。然后将2.5ml储液加入到
7.5ml培养基中制备阳性对照工作溶液(300μM)。在板的每孔中加入1ml阳性对照工作溶
液，得到终处理浓度为100μM谷胱甘肽单乙酯。
(补充有10％FBS的RMPI 1640培养基)中制备1.2mM储液。然后将2.5ml储液加入到
7.5ml培养基中制备阳性对照工作溶液(300μM)。在板的每孔中加入1ml阳性对照工作溶
液，得到终处理浓度为100μM谷胱甘肽单乙酯。
[0093] 可如下制备测试样本：称取100mg测试样本放入15毫升一次性(disposable)离心管中，加入10ml去离子水，从而制备浓度为10mg/ml的样 本储液。本实施例中，测试样
本包括：四油酰心磷脂、四肉豆蔻酰心磷脂、 心磷脂、L-肌肽和龙胆酸甲酯(每
个样本使用一个培养板)。然后系列稀释样本储液，得到浓度为300μg/ml的样本工作溶
液。然后在板剩余3个孔的每一个(三复孔)中加入1ml样本工作溶液，这样各样本孔中
的测试样本终浓度为100μg/ml。
本包括：四油酰心磷脂、四肉豆蔻酰心磷脂、 心磷脂、L-肌肽和龙胆酸甲酯(每
个样本使用一个培养板)。然后系列稀释样本储液，得到浓度为300μg/ml的样本工作溶
液。然后在板剩余3个孔的每一个(三复孔)中加入1ml样本工作溶液，这样各样本孔中
的测试样本终浓度为100μg/ml。
[0094] 然后，将既含有测试样本孔又含有对照孔的板在37℃、5％CO2中孵育3小时。
[0095] 攻击：孵育3小时后，通过引入攻击溶液使分别含有测试样本、阳性对照和阴性对照的孔中的细胞经受氧化应激。如下制备攻击溶液：
[0096] 852μl 8.8M H2O2+4.15ml培养基(＝1.5M H2O2)
[0097] 1ml 1.5M H2O2+9ml培养基(＝150mM H2O2)
[0098] 1ml 150mM+30ml培养基(＝5mM H2O2)
[0099] 将1ml 5mM H2O2加入到板的所有孔中，但正常对照除外，正常对照孔中加入1ml培养基(补充有10％FBS的RMPI 1640培养基)。然后，板在37℃、5％CO2中孵育3小时。
[0100] 染色：与攻击液一起孵育以后，将所有孔中的内容物转移到流式细胞管中，100xg离心5分钟。去除细胞上的培养基，通过各管中加入1ml MitoSOX(5μM)将细胞染色。具
体说，通过使用13μL DMSO/瓶溶解两小瓶MitoSOX(50μg/瓶，Invitrogen cat# M36008)
得到5mM/瓶的溶液(mw＝760克/摩尔)，由此获得MitoSOX染料。将两小瓶中的内容物
均转移到26ml(5μM)培养基中。将细胞与染料室温黑暗孵育15分钟。
体说，通过使用13μL DMSO/瓶溶解两小瓶MitoSOX(50μg/瓶，Invitrogen cat# M36008)
得到5mM/瓶的溶液(mw＝760克/摩尔)，由此获得MitoSOX染料。将两小瓶中的内容物
均转移到26ml(5μM)培养基中。将细胞与染料室温黑暗孵育15分钟。
[0101] 流式细胞术：染色后，用流式细胞仪(例如Becton-Dickinson FACS Caliber)分析样本，使用488nm激发激光和FL2 588nm发射滤器。将数据线性化为曲线，该曲线由阴性
对照和正常对照的响应来限定(0％保护＝未处理的/攻击的阴性对照，100％保护＝未处
理的/未攻击的正常对照)。在这些条件下，阳性对照(100μM谷胱甘肽甲酯(glutathione
methyl ester))提供针对氧化应激的35％的保护。
对照和正常对照的响应来限定(0％保护＝未处理的/攻击的阴性对照，100％保护＝未处
理的/未攻击的正常对照)。在这些条件下，阳性对照(100μM谷胱甘肽甲酯(glutathione
methyl ester))提供针对氧化应激的35％的保护。
[0102] 结果：该实验的结果报告于下表III中。如结果所示，四油酰-心磷脂提供了对氧化应激的平均97％的显著保护。
[0103] 表III：针对氧化应激的保护
[0104]
[0105] 实施例2：ATP水平的测定
[0106] 细胞中ATP水平是细胞和线粒体健康的一个标志。如本实施例所阐释的，可用在ATP存在下发光的ATP依赖性荧光酶来监测ATP水平。产生的光的量与ATP存在量直接成
比例。
比例。
[0107] CHO-K1(中国仓鼠卵巢)细胞购自ATCC(Manassas，VA)(细胞登录号ATCC CCL4
61)。在不透明96孔板中以1×10 个细胞/孔接种细胞培养物。贴壁后，将细胞转移到低
葡萄糖培养基(1g/l)中，孵育过夜。在低葡萄糖培养基中培养的细胞具有降低的ATP含
量。
61)。在不透明96孔板中以1×10 个细胞/孔接种细胞培养物。贴壁后，将细胞转移到低
葡萄糖培养基(1g/l)中，孵育过夜。在低葡萄糖培养基中培养的细胞具有降低的ATP含
量。
[0108] 过夜培养后，使细胞接触叔丁基过氧化物(1mM)2小时以诱导细胞应激。过氧化物比单独的葡萄糖使ATP水平降得更低，模拟了受损伤的细胞状态。接触过氧化物后，将
新鲜的低葡萄糖培养基加回到细胞中。用过氧化物攻击后立即将细胞暴露于测试样本，终
浓度通常是1、10、和100mg/ml。细胞和测试样本一起于37℃孵育4小时。如下表IV所
示，本试验所用测试样本包括l-肌肽；DC龙胆酸甲酯；空的脂质体(仅含心磷脂)；购自
AGIDermatics，Inc.(Freeport，NY)的脂质体，使其加载有四油酰-心磷脂、l-肌肽和龙胆
酸甲酯；及加载购自Centerchem，Inc.(Norwalk，CT)的脂质体，使其加载有四油酰-心磷
脂、l-肌肽和龙胆酸甲酯。
新鲜的低葡萄糖培养基加回到细胞中。用过氧化物攻击后立即将细胞暴露于测试样本，终
浓度通常是1、10、和100mg/ml。细胞和测试样本一起于37℃孵育4小时。如下表IV所
示，本试验所用测试样本包括l-肌肽；DC龙胆酸甲酯；空的脂质体(仅含心磷脂)；购自
AGIDermatics，Inc.(Freeport，NY)的脂质体，使其加载有四油酰-心磷脂、l-肌肽和龙胆
酸甲酯；及加载购自Centerchem，Inc.(Norwalk，CT)的脂质体，使其加载有四油酰-心磷
脂、l-肌肽和龙胆酸甲酯。
[0109] 本试验筛选在模拟受损细胞状态的应激条件(stressed conditions)之后能够恢复ATP水平的化合物。因此，受攻击的细胞与测试样本孵育之后，用购自Promega(Madison，
Wl)的Cell-Titer Gio试剂按照生产商提供的说明书测定相对细胞ATP水平。简而言之，
将细胞平衡到室温，此时去除孔中的培养基。将稀释的试剂加入到孔中，室温孵育板15分
钟。在Wallach板读数仪上读取荧光(luminescence)。
Wl)的Cell-Titer Gio试剂按照生产商提供的说明书测定相对细胞ATP水平。简而言之，
将细胞平衡到室温，此时去除孔中的培养基。将稀释的试剂加入到孔中，室温孵育板15分
钟。在Wallach板读数仪上读取荧光(luminescence)。
[0110] 计算各处理组的平均荧光，通过用每一个测试组的平均值除以未处理对照组的平均值来确定％未处理对照。未处理对照认为是100％，因此任何大于100％的结果都认为是
细胞ATP水平净增加的阳性结果。该实验的结果报告于下表IV和图5中。
细胞ATP水平净增加的阳性结果。该实验的结果报告于下表IV和图5中。
[0111] 表IV：细胞ATP产量
[0112]
[0113] 这些结果表明，加载的脂质体以低的浓度增强了暴露于氧化应激的细胞中的ATP水平。空脂质体(仅含心磷脂)以高浓度增强了ATP水平，这说明加载到脂质体中的其他
成分对低浓度的、加载的脂质体的效果非常重要。结果还表明，当检测这些所述其他成分自
身时，它们几乎没有效果。这些结果说明，脂质体递送载体有助于使心磷脂和抗氧化剂进入
细胞中。
成分对低浓度的、加载的脂质体的效果非常重要。结果还表明，当检测这些所述其他成分自
身时，它们几乎没有效果。这些结果说明，脂质体递送载体有助于使心磷脂和抗氧化剂进入
细胞中。
[0114] 实施例3：脂质体稳定性
[0115] 透射电子显微镜(TEM)常用于测定脂质体的尺寸和形态特征。一种常用于TEM成像的样本制备方法是将一滴脂质体悬浮液施加到涂敷有塑料的栅格(grid)上，然后用磷
钨酸或钼酸铵负染色。结果得到包埋在负染色(negative stain)中的脂质体单层。
钨酸或钼酸铵负染色。结果得到包埋在负染色(negative stain)中的脂质体单层。
[0116] 更具体地说，可如下制备用于TEM成像的样本：将1％的琼脂糖凝胶水溶液(w/v)倒入塑料Petri培养皿中，室温下风干10分钟。通过辉光放电使formvar或火棉胶涂敷的
栅格呈亲水性，栅格置于Whatman 1号滤纸上。各栅格上加1滴样本悬浮液。当大多数液
体被滤纸吸收到栅格的外周时，将栅格转移到琼脂糖凝胶板上30分钟至1小时以促进盐和
液体扩散到琼脂糖中。
栅格呈亲水性，栅格置于Whatman 1号滤纸上。各栅格上加1滴样本悬浮液。当大多数液
体被滤纸吸收到栅格的外周时，将栅格转移到琼脂糖凝胶板上30分钟至1小时以促进盐和
液体扩散到琼脂糖中。
[0117] 使用带有ESI的Zeiss-902观察未被染色的栅格并照相。脂质体应该是离散的圆形结构，不应该观察到团块。
[0118] 该方法用于测定本发明脂质体的稳定性。拍摄TEM照片以测定本发明霜剂形式脂质体在存贮前和存贮后1个月时的大小和结构。具体而言，被分析的脂质体主要由磷脂酰
胆碱构成，并包埋有四油酰-心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽。将脂质体加入霜剂之后立即
拍摄TEM照片，约室温(50℃)存贮1个月后再拍摄脂质体(在霜剂中)的TEM照片。图6
显示了存贮前和存贮1个月后获得的本发明脂质体的TEM照片。如这些TEM照片所示，存
贮1个月后这些脂质体保持具有完整膜的离散、稳定结构。
胆碱构成，并包埋有四油酰-心磷脂、龙胆酸甲酯和l-肌肽。将脂质体加入霜剂之后立即
拍摄TEM照片，约室温(50℃)存贮1个月后再拍摄脂质体(在霜剂中)的TEM照片。图6
显示了存贮前和存贮1个月后获得的本发明脂质体的TEM照片。如这些TEM照片所示，存
贮1个月后这些脂质体保持具有完整膜的离散、稳定结构。
[0119] 上文描述了本发明优选实施方式。可进行很多改变和变化而不脱离如所附权利要求中定义的本发明的精神和本发明更广的方面，应根据专利法的原则包括等同原则来解释
本发明的精神和更广的方面。权利要求中提到的任何单数形式的元素，例如“一”、“该”或
“所述”不应理解为将该元素限定为单数。
本发明的精神和更广的方面。权利要求中提到的任何单数形式的元素，例如“一”、“该”或
“所述”不应理解为将该元素限定为单数。
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