技术领域
[0001] 本
发明为人体胎盘运用技术有关，更详而言之是指一种可提升干细胞存活率的胎盘活性成分制备方法。
背景技术
[0002] 胎盘含有必需
氨基酸及具生理活性的胜肽、维生素、矿物质和各种生长因子，可延缓细胞衰老，调节自主神经系统、女性内分泌，改善心血管循环，促进伤口组织愈合，增强神经再生能
力，平衡多种荷尔蒙分泌，调节免疫功能(抗过敏)，
镇痛作用(抗发炎)和改善肠道健康等功能。胎盘萃取物可广泛应用于生医、医美等美白、保湿与促进细胞愈合与再生的用途，可全面有效地改善人体
皮肤老化、促进肌肤美白、增强皮肤弹性、防止皱纹产生、增强细胞活力、抗过敏、抗
肿瘤与改善记忆等强
化身体健康的机能性。
[0003] 虽然胎盘含有甚多对人体有益的成分，不过，更含有致癌疑虑的雌
激素，世界多国皆已将雌激素列为一级致癌物而逐渐禁用。已知去除胎盘中雌激素的技术甚多，如美国第47849360号、第4423151号、第5565199号等
专利，及第20070087001号、第20040132086号等公开案所示，大多采用强酸、强
碱、酵素或是加热与添加
有机溶剂等方式，将雌激素从胎盘粉中分离去除，例如，以酸、碱与酵素分解或以
有机溶剂分离雌激素成分，均需使用100～
1000倍
水溶液或溶剂进行去雌激素的加工程序，去雌激素后还需进行繁复的浓缩、分离及纯化步骤，且需考虑酸、碱破坏有效机能成分与酵素活性等缺点，无法大量应用于商业化。
[0004] 此外，也可利用萃取、纯化等方式取得胎盘中有益的成分，例如，可从胎盘中萃取
生物活性胜肽成分，如美国专利US3409605，以离子交换
树脂吸附、浓缩和纯化胎盘中生长因子，美国专利US4169139，则以丙
酮、稀
醋酸铅和稀
硫酸铵分离沉淀组织中的
蛋白质成分，也有如中国CN101658534A专利，其采用液态氮冷冻解冻法，高速
研磨后，再经过
透析脱盐与超过滤膜澄清处理，以离子交换树脂吸附和洗脱条件下，得到活性胜肽成分。
[0005] 由于现有萃取、纯化胎盘中的胜肽、蛋白质与活化因子等相关机能成分的技术，不是制程繁杂、耗时，且需使用大量的有机溶剂，有机溶剂可能会在制作过程中与机能成分产生化学反应，不仅制作完成后溶剂去除与浓缩过程中，加热
蒸发溶剂易造成部分机能成分被破坏，且溶剂易残留于分离物或纯化物中，造成机能成分纯度不足的情形，显有改进之处。
发明内容
[0006] 本发明的主要目的即在提供一种可提升干细胞存活率的胎盘活性成分制备方法，其以无毒无害的安全技术可几乎完全去除胎盘的雌激素，将胎盘的好处极大化，更可提升干细胞的活性，供制成食品或
化妆品，甚具实用价值。
[0007] 缘是，为达成前述的目的，本发明提供一种可提升干细胞存活率的胎盘活性成分制备方法，至少包含以下步骤：制备胎盘粉末：将新鲜胎盘以预定
温度杀菌后，经
冷冻干燥处理并研磨而得到胎盘粉末；去除雌激素：在压力20～30MPa、温度40℃的操作条件下，将50～100g胎盘粉末放置于一萃取槽内，以体积流速比为10～20：1的超
临界状态溶剂通入该萃取槽，用以去除胎盘粉末中的大部分雌激素，
超临界状态溶剂为饱和
超临界流体CO2与
乙醇的
混合液，再在相同操作条件下，将前述胎盘粉末与相同体积流速比的超临界状态溶剂流入一吸附槽，用以使胎盘粉末中剩余的雌激素被该吸附槽吸附，获致去除雌激素的胎盘粉末；检测干细胞活性：检测去除雌激素的胎盘粉末的脂肪组织来源干细胞的活性，当活性高于一预定值时，表示干细胞具有增生效果，可将胎盘粉末制成食品或化妆品，若活性低于该预定值，表示干细胞无增生效果，则进行下一纯化步骤，将去除雌激素的胎盘粉末与生理食盐水以1:20～25的比例混合成胎盘液再予以纯化，用以获得胎盘中胜肽与蛋白质等活性成分。
[0008] 进一步地，制备胎盘粉末的步骤中，将新鲜胎盘以温度121℃灭菌30分钟，再冷冻干燥处理后磨成胎盘粉末。
[0009] 进一步地，制备胎盘粉末的步骤中，新鲜胎盘为人体或动物胎盘。
[0010] 进一步地，去除雌激素的步骤中，最适的操作条件压力为24～26MPa，温度为40℃，超临界状态溶剂的体积流速比例为15：1，可达到90％的雌激素去除率。
[0011] 进一步地，检测干细胞活性的步骤中，该干细胞为脂肪组织来源干细胞(adipose derived stem cells；ADSC)。
[0012] 进一步地，检测干细胞活性的步骤中，以MTT比色法分析干细胞的活化能力，活化能力的单位以％表示，该预定值为100％。
[0013] 进一步地，纯化的步骤中，包含一
分馏的步骤与一纯化的步骤，分馏的步骤为在压力2000～4000psi、温度40至60℃、超临界状态溶剂流速3～9mL/min与胎盘液流速1～3mL/min的操作条件下，将胎盘液与超临界状态溶剂连续通入一分馏槽内，用以可在该分馏槽的顶端与底端分别萃取出胜肽与蛋白质等机能成分，纯化的步骤为在温度40℃或60℃下，将该分馏槽内萃取出的胜肽与蛋白质等机能成分，连续地依序输送经过连接的三个分离槽，分别以3000、2000、1000psi的压力逐步降压，也即，第一分离槽为3000psi的压力、第二分离槽为2000psi的压力、最后的第三分离槽为1000psi的压力，用以可分离超临界状态溶剂、可选择性分离、区分与纯化胎盘胜肽与蛋白质的含量与纯度在不同分离槽，以获得胎盘液中的胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分。
[0014] 进一步地，纯化的步骤中，在5kg/cm2、25℃的操作条件下，使用一过滤
膜过滤胎盘液为透流液，用以将胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分保留于透流液中。
[0015] 进一步地，该过滤膜可为微过滤膜(0.2μm)或超过滤膜(分子量分割：500,000)之一。
[0016] 此外，本发明更提供一种可提升人体内超
氧化物歧化酶(SOD)的食品，以前述方法所制备。
[0017] 本发明的有益效果在于：
[0018] 本发明提供一种可提升干细胞存活率的胎盘活性成分制备方法，其以无毒无害的安全技术可几乎完全去除胎盘的雌激素，将胎盘的好处极大化，更可提升干细胞的活性，供制成食品或化妆品，甚具实用价值。
附图说明
[0020] 图2为本发明一较佳实施例所制备的胎盘粉末与原始胎盘的雌激素含量HPLC图谱图。
[0021] 图3为本发明一较佳实施例所制备的胎盘粉末与原始胎盘的ADSC干细胞存活率比较图。
[0022] 图4为本发明一较佳实施例胎盘粉末所制备的食用胶囊供12位女性使用后与控制组的干细胞存活率比较图。
[0023] 图5为比较不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的本发明原始胎盘液(增生效果小于100％的胎盘液)与经纯化处理后的ADSC干细胞存活率比较图。
[0024] 图6A、图6B为微过滤膜(MF)与超过滤膜(UF)在不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)下透流液(permeate)、保留液(retentate)及原始胎盘液的ADSC干细胞存活率比较图。
[0025] 图7A、图7B、图7C为分别经微过滤膜纯化、超过滤膜纯化后蛋白在保留液中的比例图。
[0026] 图8为使用本发明一较佳实施例胎盘粉末所制备的食品前后的SOD活性变化图。
[0027] 图9为4名使用者使用本发明一较佳实施例胎盘粉末所制备的食品前后的端粒酶活性变化图。
具体实施方式
[0028] 以下，兹举本发明若干较佳实施例，并配合附图做进一步的详细说明如后：
[0029] 首先，请参阅图1所示，本发明一较佳实施例可提升干细胞存活率的胎盘活性成分制备方法100，其第一步骤为制备胎盘粉末110：：将新鲜胎盘以杀菌釜在温度121℃灭菌30分钟后，经冷冻干燥处理并研磨而得到胎盘粉末，新鲜胎盘可为人体或动物胎盘，本实施例为新鲜人体胎盘。
[0030] 本发明的第二步骤为去除雌激素120：在压力20～30MPa、温度40℃的操作条件下，将50～100g胎盘粉末放置于一萃取槽内，以体积流速比为10～20：1的超临界状态溶剂通入该萃取槽，萃取时间为2～3小时，用以去除胎盘粉末中的大部分雌激素，超临界状态溶剂为饱和
超临界流体CO2与乙醇的混合液，该萃取槽为内径40mm、与高度120mm的不锈
钢槽体，其内充填有
不锈钢单体片，最适的操作条件压力为24～26MPa，温度为40℃，超临界状态溶剂的体积流速比例为15：1，可达到90％的雌激素去除率。再在相同操作条件下，将前述胎盘粉末与相同体积流速比的超临界状态溶剂流入一吸附槽，用以使胎盘粉末中剩余的雌激素被该吸附槽吸附，获得去除雌激素的胎盘粉末，该吸附槽为内径60mm与高度150mm的不锈钢槽体，内部充填有如
硅胶Silica gel、Sephadex(聚酰胺)或Resin(树脂)等可吸附雌激素的吸附剂。
[0031] 本发明的第三步骤为检测干细胞活性130：为检测去除雌激素的胎盘粉末的脂肪组织来源干细胞(adipose derived stem cells；ADSC)的活性，当活性高于一预定值时，表示干细胞具有增生效果，可将胎盘粉末制成食品或化妆品，若活性低于该预定值，表示干细胞无增生效果，则进行下一纯化步骤，活化能力的测量以MTT法分析，单位以％表示，该预定值为100％。
[0032] 本发明的第四步骤为纯化140：为将去除雌激素的胎盘粉末与生理食盐水以1:20～25的比例混合成胎盘液再予以纯化，用以获得胎盘中胜肽与蛋白质等活性成分，其方式有二：
[0033] a)超临界流体分离纯化141，包含一分馏的步骤与一纯化的步骤，分馏的步骤在压力2000～4000psi、温度40至60℃、超临界状态溶剂流速3～9mL/min与胎盘液流速1～3mL/min的操作条件下，将胎盘液与超临界状态溶剂连续通入一分馏槽内，用以在该分馏槽的顶端与底端分别萃取出胜肽与蛋白质等机能成分，该分馏槽为内径60mm、高度300mm的不锈钢槽体，其内充填有不锈钢单体片。纯化的步骤为在温度40℃或60℃下，将该分馏槽内萃取出的胜肽与蛋白质等机能成分，连续地依序输送经过连接的三个分离槽，分别以3000、2000、1000psi的压力逐步降压，也即，第一分离槽为3000psi的压力、第二分离槽为2000psi的压力、最后的第三分离槽为1000psi的压力，三个分离槽皆为内径60mm、高度150mm的不锈钢槽体，用以可分离超临界状态溶剂、可选择性分离、区分与纯化胎盘胜肽与蛋白质的含量与纯度在不同分离槽，以获得胎盘液中的胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分。
[0034] b)
薄膜分离纯化142，为在5kg/cm2、25℃的操作条件下，使用一过滤膜过滤胎盘液为透流液(permeate)，该过滤膜可为微过滤膜(microfiltration membrane；MF)(0.2μm)或超过滤膜(ultrafiltration membranes；UF)(分子量分割：500,000)的一，用以将胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分保留在透流液中。使用微过滤膜处理胎盘液，较使用超过滤膜处理有较高的透流液流速，与较低的膜沉积层阻力。以微过滤膜处理胎盘液后，所得透流液较原胎盘液澄清且呈淡淡、微黄色，胎盘液成分中的胜肽与干细胞活性几乎可以完全保留在透流液中。其次，可利用超过滤膜达到浓缩的目的，选择超过滤膜膜孔隙小的，可保留胜肽的生长因子在保留液中。
[0035] 以下，兹说明本发明可提升干细胞存活率的胎盘活性成分制备方法的特色与功效：
[0036] 首先，如图2所示，利用HPLC进行胎盘粉末雌激素含量的分析，经HPLC图谱显示，胎盘粉末在经过超临界流体萃取(Supercritical fluid extraction；SFE)前原始胎盘(original placenta)的雌激素(Ethinyl Estradiol)含量很高，胎盘粉末经过本发明过程中超临界流体萃取处理后，HPLC图谱中曲线低且平稳，雌激素的含量几乎为零，表示本发明可几乎完全去除雌激素，达99％以上。相较于已知其他去除雌激素的方法，本发明采用安全无毒的超临界状态溶剂，配合物理方式的高压、低温萃取方法与低压、低温分离方法，可制备去除雌激素的胎盘素成品，不需再经繁复的溶剂去除与浓缩、分离程序，且无溶剂残留等安全疑虑，环保、安全，且可回收超临界状态溶剂再利用，甚具实用价值。
[0037] 其次，本发明检测干细胞活性步骤所得干细胞活化能力大于100％的胎盘粉末所制成的食品(可为食用胶囊)，可给12名女性使用者使用，每颗500mg，饭前每次2颗，一天三次，使用产品三个月后，抽血检测产品使用前后的老化指标-端粒酶(Telomerase)及血液生化指标-超氧化物歧化酶(SOD)活性变化，相关检测如后述：
[0038] 如图3所示，为将本发明制备的胎盘粉末(add 2％SFE placenta extract in essence)与一般市售胎盘粉(add 2％original placenta extract in essence)比较干细胞的增生效果，由图可知，本发明胎盘粉末的干细胞存活率高达120％，比一般市售的胎盘粉干细胞存活率75％还多了45％，一般市售胎盘粉的干细胞存活率不只无法再生细胞，还有毒杀细胞的可能性，因此，可证明本发明制备的胎盘粉末具有提高干细胞存活率的能力，达到细胞再生的效果。
[0039] 如图4，为12位女性使用本发明胎盘粉末所制成的食用胶囊后，与控制组比较其干细胞的细胞存活率的情形，由图可知，12位女性使用者中，有66％的人干细胞的细胞存活率是100％以下，没有达到最佳效果，但还是有33％的人有达到100％以上的干细胞细胞存活率，表示本发明制备的胎盘粉末具有提升干细胞存活率的效果，较一般市售的胎盘粉效果更佳。
[0040] 再者，如本发明的第四步骤中，可将干细胞活化能力小于100％的胎盘粉制成胎盘液，利用a)技术(超临界流体分离纯化技术)提高ADSC干细胞的存活率：
[0041] 如图5所示，比较不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的本发明原始胎盘液(增生效果小于100％的胎盘液)与经a)方式处理后的ADSC干细胞存活率，从图中可知，经a)方式处理后的干细胞存活率明显高于原始胎盘液，随着浓度的提高，干细胞存活率更高。
[0042] 由上可证明，干细胞活化能力小于100％的胎盘液，经本发明第四步骤的a)技术处理后可提高细胞再生的能力，且再生能力随着浓度的提高而增加，本发明所使用的超临界流体技术采用安全无毒的超临界状态溶剂，在超临界CO2高
溶解度、低
粘度与高质传效率下，提高分馏物的纯度，且无溶剂残留等安全疑虑，环保、安全，超临界状态溶剂更可回收再利用，相较于已知以酸、碱与酵素分解再配合大量有机溶剂
水解的方式，导致有残留溶剂的安全疑虑的缺点，本发明显然更具进步性，甚具实用价值。
[0043] 其次，如本发明的第四步骤中，也可利用b)技术(薄膜分离纯化技术)提高干细胞的存活率：
[0044] 如图6A所示，为经微过滤膜后比较不同浓度下的干细胞存活率，由图可知，因为生长因子可以通过微过滤膜的膜，所以在透流液中，浓度愈高细胞的存活率愈高，且存活率大于100％，具有再生细胞的能力。如图6B所示，为经超过滤膜后比较不同浓度下干细胞存活率，由图可知，因为生长因子无法通过超过滤膜，所以在保留液中，浓度愈高，细胞的存活率愈高，且存活率大于100％，也比原始胎盘液高出许多。
[0045] 再者，如图7A所示，经微过滤膜分离纯化后，有99％的蛋白(Protein)在保留液(Retentate)中，只有极少量的蛋白通过微过滤膜，这是因为大分子量的蛋白质无法通过膜。如图7B所示，经微过滤膜分离纯化后，有51％的蛋白在保留液中，有49％的蛋白在透流液(Permeate)中。如图7C所示，再经过超过滤膜分离纯化后，显示有86％的蛋白在保留液中，有14％的蛋白在透流液中，这是因为更小分子的蛋白会通过。
[0046] 由上可证明，干细胞活化能力小于100％的胎盘液，经本发明第四步骤的b)技术处理后可提高细胞再生的能力，而人体胎盘液的组成成分分析结果：人体胎盘液的蛋白质与胜肽含量分别为91.63与7.44mg/g dw。理论上胎盘液中胜肽成分经过b)技术处理后，在透流液与保留液中的浓度应相等，排拒率应接近0。但因过滤膜表面易堆积蛋白质等物质，阻塞过滤膜的孔隙，使得胜肽与生长因子等成分通过过滤膜的阻力增加。
[0047] 而使用本发明制备的食品一段时间后，检测各种指标，各项指标皆显示本发明对人体有许多好处，如增加SOD、增加端粒酶活性：
[0048] 如图8所示，血液生化指标-超氧化物歧化酶(SOD)分析，比较使用本发明的食品前后的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase；SOD)值，由图8可知，使用后SOD值明显增加，表示可以增加体内SOD，减少ROS造成的伤害，而达到抗氧化和抗老化的作用。
[0049] 其次，老化指标-端粒酶(Telomerase)，端粒酶在细胞分裂、复制过程中，扮演重要
角色，人体内仍有少数细胞，例如组织的干细胞，因大量表现可复制、合成端粒
片段的端粒酶，而能维持端粒长度，不让细胞走向老化、死亡，如图9所示，比较使用本发明的产品前后的端粒酶活性，显示使用后的端粒酶活性平均增加23％，端粒酶适当活化，可维持端粒长度，阻止细胞进入老化、甚至淍亡的过程。
[0050] 综上所述，本发明可提升干细胞存活率的胎盘活性成分制备方法，其以无毒无害的安全技术可几乎完全去除胎盘的雌激素，将胎盘的好处极大化，更可提升干细胞活性，且本发明所使用的新鲜胎盘也可为动物胎盘，如羊胎，本发明制备的胎盘粉末可制成食品或化妆品，食品如食用胶囊、饮品等，化妆品如精华液、面膜、晚霜等，甚具实用价值。
