细胞培养材料
阅读：446发布：2021-06-09
专利汇可以提供细胞培养材料专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 揭示了一种用于结合细胞培养蛋白的材料。所述材料含有 块 体改性的弹性体，其包含与所述弹性体块体共价结合的多个 脂肪酸 部分，其中所述部分的 羧酸 基团可用于提供所述结合。本发明还揭示了 流体 装置模块、细胞培养 支架 、流体装置、合成这种材料的方法以及药物测试方法。使用这种材料，可以用少如一步注塑工艺生产(单块)流体装置模块。，下面是细胞培养材料专利的具体信息内容。
1.一种用于结合细胞培养蛋白的材料，所述材料含有块体改性的弹性体，其包含与所述弹性体块体共价结合的多个脂肪酸部分，其中所述部分的羧酸基团可用于提供所述结合。
2.权利要求1的材料，其中每个脂肪酸部分通过弹性体的乙烯基或氢化物官能团与不饱和脂肪酸的不饱和碳-碳键之间的交联反应与弹性体块体共价结合。
3.权利要求2的材料，其中所述不饱和脂肪酸选自肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、6顺-十六碳烯酸、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。
4.权利要求1-3任一项的材料，其中所述弹性体包含聚丁二烯主链或聚硅氧烷主链。
5.权利要求4的材料，其中所述聚硅氧烷主链中的至少一部分羧酸基团是皂化的。
6.一种细胞培养支架，其包含权利要求1-5任一项的材料及与至少一些所述羧酸基团结合的细胞培养蛋白。
7.权利要求6的细胞培养支架，其中所述蛋白选自纤连蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白。
8.一种流体装置模块，其包括在包含权利要求1-4任一项的材料的膜上延伸的流动通道。
9.权利要求8的流体装置模块，其包含：第一主表面，其包含限定第一流动通道的第一凹陷结构；以及第二主表面，其与所述第一主表面相对，且包含限定第二流动通道的第二凹陷结构；其中所述膜将第一流动通道与第二流动通道分开。
10.权利要求8或9的流体装置模块，其中所述流体装置是单块流体装置。
11.一种流体装置，其包含权利要求8-10任一项的流体装置模块及用于流体密封所述流体装置模块的一对盖板。
12.权利要求11的流体装置，其中所述盖板被布置成使得所述盖板之一覆盖所述第一主表面，从而密封所述第一流体通道，以及所述盖板中的另一个覆盖所述第二主表面，从而密封所述第二流体通道。
13.一种生产用于结合细胞培养蛋白的材料的方法，所述方法包括：
形成包含乙烯基官能化的或氢化物官能化的弹性体或者至少一种其前体、不饱和脂肪酸和交联催化剂的组合物；和
通过所述弹性体的乙烯基或氢化物基团与所述不饱和脂肪酸的不饱和碳-碳键之间的交联反应，在所述模具中通过将所述脂肪酸与弹性体块体共价结合对乙烯基官能化或氢化物官能化的弹性体进行块体改性，以获得所述材料。
14.权利要求13的方法，其中所述乙烯基官能化的或氢化物官能化的弹性体包含聚硅氧烷主链，且所述不饱和脂肪酸是皂化的，所述方法进一步包括用质子酸处理所得材料以复原所述皂化。
15.权利要求13或14的方法，其中形成包含乙烯基官能化的或氢化物官能化的弹性体或至少一种其前体、不饱和脂肪酸和交联催化剂的组合物包括将所述组合物注入模具中。
16.权利要求15的方法，其中将所述模具塑形以提供权利要求8-10任一项的流体装置模块。
17.权利要求16的方法，进一步包括利用激光在所述流体装置模块的膜中形成槽或孔。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中所述模具具有极性内表面，优选金属氧化物内表面。
19.一种药物测试方法，包括：
提供权利要求9或10的流体装置模块；
将所述流体装置模块的膜与细胞培养蛋白结合以获得细胞培养支架；
将收获的细胞培养物应用于所述细胞培养支架以获得制备的流体装置模块；
用所述制备的流体装置模块形成流体装置；
通过所述流体装置的一对流动通道之一饲喂细胞培养物；
通过所述流体装置的一对流动通道的另一通道，将细胞培养物暴露于待测药物；和监测所述细胞培养物对所述待测药物的反应。
20.权利要求19的药物测试方法，其中监测所述细胞培养物对所述待测药物的反应包括：
将所述细胞培养物固定化并固定在所述流体装置内，并将所述流体装置模块切片以获得用于显微镜评估的切片，所述切片包含至少一部分固定化和固定的细胞培养物；或者使用共聚焦显微镜监测所述流体装置内的所述细胞培养物。
细胞培养材料
发明领域
[0001] 本发明涉及一种用于结合细胞培养蛋白的弹性体材料。
[0002] 本发明进一步涉及一种包含这种材料的细胞培养支架。
[0004] 本发明进一步涉及一种生产这种材料的方法。
[0005] 本发明进一步涉及一种使用包含这种材料的流体装置模块的药物测试方法。
[0006] 发明背景
[0007] 哺乳动物细胞或组织的体外测试是获得所研究的哺乳动物材料的临床重要信息的重要技术。例如，可以对活检的哺乳动物细胞或组织材料进行这种测试以确定这种哺乳动物材料中的异常或疾病，或者将患病的哺乳动物材料暴露于药物例如实验药物以监测患病哺乳动物材料对这种暴露的反应。这种方法例如经常在肿瘤学程序中使用。这可以提供关于如何有效治疗个体疾病而不必使个体暴露于由于多种原因(例如药物毒性)而不希望的一系列潜在有效药物的重要见解。另外，以此方式可以测试实验药物对现存疾病尚无确定的令人满意的药物治疗的功效。还有许多其他熟知原因开展这种体外测试。
[0008] 这种体外测试的常用方法是将哺乳动物材料固定化在流体装置中，有时将其称为“器官芯片(organ-on-chip)”。在这种方法中，通常将哺乳动物材料固定化在分隔流体装置的两个流体通道的膜上，其中第一通道用于饲喂哺乳动物材料，第二通道用于将哺乳动物材料暴露于感兴趣的化合物或组合物如药物治疗，例如用于如前所述测试药物的功效和/或毒性。流体装置或至少其膜可以由弹性体制成，由此可以将流体装置切成小块或切片以获得包括哺乳动物材料的膜的切片以用于评估目的，例如评估哺乳动物材料暴露于感兴趣的化合物或组合物的反应。
[0009] 在这种体外测试遇到的挑战是确保哺乳动物材料如细胞或组织在流体装置的膜上是稳定的且正常发育，由此其在测试过程中是存活的。这在其中实验可能会相当漫长的肿瘤学程序中尤其具有挑战性。为此，可以使用通过为细胞提供模拟天然组织的化学环境以确保哺乳动物细胞继续繁殖的生物相容性材料例如纤连蛋白以稳定哺乳动物材料。
[0010] 一种常见方法是在有孔细胞培养板上涂覆具有羧酸基团的聚合物，这种基团可以(共价)结合于纤连蛋白，从而当纤连蛋白使聚合物生物连接时促进哺乳动物细胞在流体装置内膜上的稳定化。但是，这种方法并非没有缺点。首先，通过流体装置的流体流可以部分除去上述聚合物，这样由于至少一些这种材料可能已经损失的事实而削弱了在期望的时间点评估哺乳动物材料的能力。在另一种方法中，用UV或血浆处理膜以在膜上产生纤连蛋白的结合位点。但是，这种方法的缺点是很难避免这种结合位点的不均匀分布，这再次妨碍了对测试结果的评估。
[0011] 其次，众所周知包含这种生物相容性涂层的膜难以生产，这使得这种流体装置的生产相当昂贵且麻烦。例如，这种膜通常需要使用昂贵的薄膜技术生产，且需要整合在流体装置内而没有泄漏，这远非如此简单。另外，在膜本身不是由生物相容性材料制成的情况下，通常需要在膜上具有多个小间距的细胞大小的孔以促进细胞生长，这也是很难实现的。
[0012] Dongeun Huh et al.(Nature Protocols,Vol.8,No.11,2013,pages 2135-2157)揭示了基于薄膜技术的这种人体器官芯片的精密加工的实例。在这个方案中，微工程技术用于制造多层微流体装置，其含有两个平行的弹性体微通道，这些通道由两个全高度的薄的多孔柔性膜隔开，在任一侧具有真空腔，这个装置需要大约31/2天产生。整个微加工程序包括100多个步骤，其中很多是关键步骤。这清晰表明这种生产程序的复杂性。因此，需要提供简化方式的这种生物相容性流体装置。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明尝试提供一种用于与细胞培养蛋白结合的弹性体材料，其可用于形成这种生物相容性流体装置。
[0015] 本发明进一步尝试提供一种包括这种弹性体材料的细胞培养支架。
[0016] 本发明进一步尝试提供一种包含这种弹性体材料的生物相容性流体装置。
[0017] 本发明进一步尝试提供一种生产这种弹性体材料的方法。
[0018] 本发明进一步尝试提供一种使用这种生物相容性流体装置的药物测试方法。
[0019] 根据一个方面，本发明提供了一种用于结合细胞培养蛋白的材料，所述材料含有块体(bulk)改性的弹性体，所述弹性体包含多个共价结合于该弹性体块体的脂肪酸部分，其中所述部分的羧酸基团可用于提供所述结合。
[0020] 本发明是基于这样的认识，即这种材料可以通过少量步骤生产，例如在一些实施方案中通过单一步骤，通过在涂覆(旋涂，浸涂，喷涂，滴涂)或注塑工艺中组合弹性体和脂肪酸，其中可以实现弹性体与脂肪酸碳-碳双键碳的交联，由于在旋涂或注塑工艺中有限地暴露于环境氧，因此脂肪酸碳双键没有明显环氧化。因此，提供了一种材料，其中弹性体用脂肪酸部分被块体改性，其中脂肪酸的羧酸基团可用于结合生物相容性材料。此外，通过控制硬化过程和/或在其中形成材料的模具的性能，这种羧酸基团可以主要存在于所述材料的外表面上，从而使羧酸基团在这种外表面上基本均匀的分布，使得该材料特别适合用作流体装置的膜材料，因为该材料的每个横截面均呈现出相同的表面特性，与如前所述在其上生物相容性材料的锚需要接枝或以其它方式形成的膜材料相反。另外，由于通常在这种交联反应中仅消耗一部分弹性体碳-碳双键，因此本发明材料保留了弹性体的弹性性质，这增加了本发明材料用于流体装置中的适用性且可以方便地切片或以其它方式切割本发明的材料用于研究目的。
[0021] 优选地，每个脂肪酸部分通过弹性体的乙烯基官能团或氢化物官能团与不饱和脂肪酸的不饱和碳-碳键之间的交联反应而共价结合于弹性体块体，以保证可用于结合生物相容性材料的羧酸基团的数目可被优化。
[0022] 不饱和脂肪酸可以是任何合适的不饱和脂肪酸。在一个示例的实施方案中，不饱和脂肪酸选自肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、6顺-十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸(linoeladic acid)、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(eicospaentaenoic acid)、芥酸和二十二碳六烯酸。特别提及的是亚油酸。
[0023] 相似地，弹性体可以是任何合适的弹性体。在示例的实施方案中，弹性体包含聚丁二烯主链或聚硅氧烷主链。当弹性体包含聚硅氧烷主链时，聚硅氧烷主链内至少部分羧酸基团可被皂化，因为需要在不饱和脂肪酸分子与弹性体分子之间交联之前皂化羧酸基团以防止交联催化剂被不饱和脂肪酸分子的羧酸基团的质子失活。
[0024] 根据另一方面，本发明提供了一种细胞培养支架，其包含根据本文所述的任何实施方案的本发明的材料和与至少一些所述羧酸基团结合的细胞培养蛋白。这种细胞培养支架可以通过细胞培养蛋白与本发明材料的羧酸基团的简单结合反应以直接方式生产，从而使细胞培养支架在本发明材料的表面上具有基本均匀分布的细胞培养蛋白。这种细胞培养蛋白例如可选自纤连蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白，但是也可以考虑其它细胞培养蛋白。
[0025] 根据另一方面，本发明提供了一种流体装置模块，其包括在膜上延伸的流动通道，所述膜包含根据本文所述任一实施方案的本发明材料。这种流体装置模块可以包括第一主表面，其包含限定第一流动通道的第一凹陷结构；第二主表面与第一主表面相对，包括限定第二流动通道的第二凹陷结构；所述膜将第一流动通道与第二流动通道分开。在优选的实施方案中，流体装置模块是单块流体装置模块，其优点在于可以少量处理步骤生产所述装置模块，例如通过注塑成型的单一加工步骤。
[0026] 膜可包含贯穿膜的多个孔或槽。然而，由于如上所述通过与细胞培养蛋白结合形成细胞培养支架，可以使膜是生物相容的，因此这些孔或槽可以具有任何合适的尺寸，且不限于细胞大小直径，这进一步简化了这种流体装置模块的生产。
[0028] 根据另一方面，本发明提供了一种流体装置，其包含本文所述任一实施方案的流体装置模块和一对盖板，以流体密封所述流体装置模块。所述盖板可以被布置成使所述盖板之一覆盖第一主表面，从而密封第一流体通道，以及所述盖板的另一个覆盖第二主表面，从而密封第二流体通道。这种流体装置可以以直接方式生产，因为流体装置模块可以如先前所述在少量的处理步骤中形成，且由于流体装置模块的柔性性质而具有抗泄漏的稳健性。
[0029] 根据另一个方面，本发明提供了一种生产用于结合细胞培养蛋白的材料的方法，所述方法包含形成包含乙烯基官能化或氢化物官能化的弹性体或者至少一种其前体、不饱和脂肪酸和交联催化剂的组合物；以及通过弹性体的乙烯基或氢化物基团与不饱和脂肪酸的不饱和碳-碳键之间的交联反应使所述模具中脂肪酸与弹性体块体共价键合，从而对乙烯基官能化或氢化物官能化的弹性体进行块体改性以获得所述材料。这种方法因此提供了一种以直接方式提供可以通过与细胞培养蛋白反应而制成的生物相容材料，由此所得细胞培养支架在块体改性的弹性体表面上具有基本均匀分布的细胞培养蛋白。
[0030] 当这种乙烯基官能化或氢化物官能化的弹性体包含聚硅氧烷主链时，不饱和脂肪酸可以被皂化以防止交联催化剂例如铂催化剂(如果存在的话)中毒，在这种情况中所述方法进一步包含用质子酸处理所得材料以恢复所述皂化作用，以至少在块体改性的弹性体的暴露表面获得羧酸基团。
[0031] 形成包含乙烯基官能化的或氢化物官能化的弹性体或者至少一种其前体、不饱和脂肪酸和交联催化剂的组合物优选包含将所述组合物注入模具中。
[0032] 优选地，将模具塑形以提供本文所述任一实施方案的流体装置模块，由此可以以最少的处理步骤以直接方式提供这种流体装置模块。
[0033] 这种流体装置模块的膜中的槽或孔可以用激光形成，以便以直接方式提供这种槽或孔，但是可以包括用于形成这种槽或孔的其它技术，例如通过模具塑形，由此在模塑所述模块期间在流体装置模块的膜上形成这种槽或孔。
[0034] 这种模具优选具有极性内表面如金属氧化物内表面以促进脂肪酸部分的羧酸基团与这种内表面的排列，从而促进在其外表面上具有高密度羧酸基团的块体改性弹性体的形成。
[0035] 根据另一方面，本发明提供了一种药物测试方法，包含提供如本文所述任一实施方案的流体装置模块；将所述流体装置模块的膜与细胞培养蛋白结合以获得细胞培养支架，将收获的细胞培养物应用于所述细胞培养支架以获得制备的流体装置模块；与准备的流体装置模块形成流体装置；通过流体装置的一对流动通道之一充填细胞培养物；通过流体装置的一对流动通道中的另一个通道将细胞培养物暴露于待测试的药物；并监测细胞培养物对待测药物的反应。这种药物测试方法可以以简单和直接方式开展，特别是制备用于这种药物测试方法中的流体装置，从而大大简化了现有药物测试方法，现有药物测试方法中这种流体装置的制备通常非常繁琐。
[0036] 对细胞培养物对待测药物的反应的监测可包含将细胞培养物固定化(immobilizing)和固定(fixating)在流体装置内及将流体装置模块切片以获得用于显微镜评估的切片，所述切片包含至少一部分固定化或固定的细胞培养物。根据本发明的教导，由于细胞培养支架均匀分布在流体装置模块的膜表面上的事实，因此用于显微镜检评估的这种切片的产生不再是关键的或受制于可变结果。
[0037] 或者，在优选的实施方案中，可以使用共聚焦显微镜在装配的流体装置内进行细胞培养物反应的监测。这有助于实时监视这种反应。
[0039] 本发明的实施方案通过非限制性实施例及参考附图以更详细描述，其中：
[0040] 图1示出根据一个实施方案的用不饱和脂肪酸对弹性体的块体改性；
[0041] 图2示出哺乳动物细胞在包括这种块体改性的弹性体的细胞支架上的固定化；
[0042] 图3示出根据一个实施方案的流体装置模块的透视图；
[0043] 图4示出根据一个实施方案的流体装置模块的另一透视图；
[0044] 图5示出根据一个实施方案的流体装置的部件分解图；
[0045] 图6示出根据另一个实施方案的流体装置的透视图；
[0046] 图7示出根据另一个实施方案的流体装置的部件分解透视图；
[0047] 图8示出图7的流体装置的另一部件分解透视图；
[0048] 图9是根据一个实施方案的形成块体改性弹性体的组合物的FT-IR光谱的一部分；
[0049] 图10示出图9的FT-IR光谱中两个特征峰的强度与块体改性反应时间的函数之间的比率变化；
[0050] 图11示出不饱和脂肪酸的C＝C拉伸振动与块体改性反应时间函数的Raman光谱；
[0052] 图13是改性和非改性的基于聚丁二烯的弹性体的接触角测量图；
[0054] 图16示出纤连蛋白结合的根据本发明的一个实施方案的块体改性的弹性体与人体组织细胞之间的结合反应的SPR光谱。
[0055] 实施方案详述
[0056] 应当理解，附图仅是示意性的，且没有按比例绘制。还应当理解，在所有附图中使用相同的参考标记表示相同或相似的部分。
[0057] 图1示出用于生产根据本发明的实施方案的块体改性的弹性体材料的交联反应。在这个交联反应中，将乙烯基官能化的弹性体10(此后简称为弹性体)与不饱和脂肪酸20交联，通过弹性体10的碳-碳双键之一与不饱和脂肪酸20的碳-碳双键之一之间的交联反应进行，所述交联反应可使用适当的交联催化剂催化。本发明人惊奇地发现，这种交联反应可以提供块体改性的弹性体，其中已与弹性体10交联反应的至少一部分不饱和脂肪酸分子20的羧酸基团呈现于块体改性的弹性体的外表面上，由此这些羧酸基团可用于与细胞稳定(即细胞培养)蛋白如纤连蛋白、胶原蛋白或弹性蛋白的结合反应。考虑到弹性体10可以是非极性的，这是令人惊讶的，特别是当弹性体10溶解在非极性溶剂中时。在这种非极性环境中，不饱和脂肪酸分子20趋于形成胶束，其中这些分子的羧酸部分在这种胶束内向内转向，这通常导致这些羧酸部分最终在改性的弹性体块体中。或者，弹性体10与不饱和脂肪酸20之间的交联反应可涉及通过弹性体10的氢化物官能团与不饱和脂肪酸20的碳-碳双键之间的反应形成共价键，例如在氢化物官能化的聚硅氧烷的情况下，如在下面进一步详细解释。
[0058] 另外，熟知的是这种不饱和脂肪酸20的碳-碳双键在氧气存在下易于迅速环氧化，这降低了这种化合物与弹性体10的交联反应的能力。。
[0059] 本发明的实施方案基于这样的见解：如果将包括弹性体10和不饱和脂肪酸20的反应混合物与极性表面接触，这将促进脂肪酸分子的羧酸基团沿着这种极性表面定向，由此块体改性的弹性体材料的外表面呈现这些羧酸基团的高密度和均匀分布。此外，已经发现以这种方式在注塑工艺中在升高的温度例如在120-240℃温度对弹性体10进行块体改性时，不饱和脂肪酸分子20的碳-碳双键的环氧化不明显干扰弹性体10的块体改性，即不明显抑制不饱和脂肪酸分子20与弹性体10之间的交联反应。不希望受到理论的束缚，相信在这种注塑工艺中，注塑设备内的反应混合物中基本上不存在分子氧，从而抑制了不希望的这些碳-碳双键的环氧化。
[0060] 在这种注塑工艺中使用的模具可以塑形为流体装置模块的形式，由此可以在单步注塑工艺中形成单块流体装置模块。由于这种单块流体装置模块外表面上羧酸基团的高密度和均匀分布，因此可以通过将细胞培养蛋白如纤连蛋白、胶原蛋白或弹性蛋白与块体改性弹性体外表面上暴露的羧酸基团结合，以直接方式使得这种装置模块是生物相容的。所述模具可以由任何合适的极性材料制成或者具有用任何合适的极性材料涂层的内表面，所述材料例如不锈钢、金属或金属氧化物如氧化铝，以实现块体改性的弹性体羧酸基团在至少在其外表面之一上希望的定向。
[0061] 为此可以使用任何合适的弹性体。例如，弹性体可以是均聚物、共聚物、嵌段共聚物、三元共聚物、嵌段三元共聚物等。特别合适的弹性体可以选自多烯例如聚丁二烯。在使用聚丁二烯的情况下，可以使用任何合适的聚合方法制备聚丁二烯。特别优选的是在Nd或Li催化的聚合反应中形成的聚丁二烯，因为众所周知这种聚丁二烯具有低分支度(通常低于5％)和大约2的低度多分散性(Mw/Mn)。由于其1,2-乙烯基含量高(约11％)而特别优选Li催化的聚丁二烯。但是，也可以使用其它类型的聚丁二烯，例如得自Co、Ni或Ti催化的聚合反应的聚丁二烯。在使用多烯如聚丁二烯作为弹性体10的情况下，可以使用过氧化物催化剂催化弹性体10与不饱和脂肪酸20之间的交联反应。在另一个有利的实施方案中，使用分支度在5-15％范围的Li催化的聚丁二烯，因为已经发现当聚丁二烯的分支度在这个范围时，聚丁二烯与不饱和脂肪酸20的反应性得以改善。为了完整起见，已熟知在合成聚丁二烯时如何控制分支度，由此为了简洁起见不再赘述。
[0062] 特别提及的另一类弹性体是用于注塑的聚硅氧烷(硅酮)。这种聚硅氧烷可以包含PDMS主链，其包括乙烯基部分以通过Pt催化的加成反应促进如与(聚甲基)氢硅氧烷的交联。或者或除了与(聚甲基)氢硅氧烷的这种交联之外，乙烯基官能化的PDMS主链可以与不饱和脂肪酸20交联。这种聚硅氧烷可以通过如下交联反应形成：乙烯基官能化的线性或分支的聚硅氧烷单体或低聚物之间的交联反应，例如T-分支或Q-分支的聚硅氧烷单体或低聚物与线性氢化物官能化的聚硅氧烷单体或低聚物之间的交联反应；氢化物官能化的线性或分支的聚硅氧烷单体或低聚物例如T-分支或Q-分支的聚硅氧烷单体或低聚物与线性乙烯基官能化的聚硅氧烷单体或低聚物或者乙烯基官能化和氢化物官能化的线性或分支的聚硅氧烷单体或低聚物例如T-分支或Q-分支的聚硅氧烷单体或低聚物的混合物和/或线性氢化物官能化和乙烯基官能化的聚硅氧烷单体或低聚物的混合物之间的交联反应。
[0063] 例如，可以通过线性组分1和线性组分2之间的交联反应形成两组分聚硅氧烷，所述组分均可对应于以下通式：
[0064]
[0065] 在组分1中，R1和R2单独选自C1-C3烷基，R3-R8单独选自C1-C3烷基和乙烯基，条件是R3-R5至少之一和R6-R8至少之一是乙烯基。优选地，R3-R8中至少三个是乙烯基。在所有实施方案中，n可以在100-200000的范围。在组分1的一个具体实施方案中，烷基基团R1-R8的每个基团均是甲基，即组分1是具有末端乙烯基的乙烯基官能化PDMS。
[0066] 在组分2中，R1是氢，R2＝C1-C3烷基，及R2-R8单独选自C1-C3烷基或氢，条件是R3-R5中至多一个和R6-8中至多一个是氢，n可以具有任何合适的值，例如n＝3-1000，或更具体地n＝3-10。在组分2的一个具体实施方案中，基团R3-R8无一是氢。在组分2的另一个具体实施方案中，R2-R8的每一个均为甲基。
[0067] 组分2通常作为组分1的交联剂。这种交联反应是熟知的，通常是Pt催化的，参见例如WO 2009/147602 A2，为了简洁起见因此不再进一步详细解释。可以使用任何合适的聚硅氧烷弹性体。应理解的是，当在存在不饱和脂肪酸20时交联这种聚硅氧烷时，聚硅氧烷与不饱和脂肪酸20之间的共价键或者可以通过(交联的)聚硅氧烷的氢化物官能团与不饱和脂肪酸20之间的反应形成，如以下反应机理所示：
[0068]
[0069] 为防止在这种交联反应期间不饱和脂肪酸20的羧酸基团的质子对催化剂的抑制，不饱和脂肪酸在与聚硅氧烷弹性体的交联反应中可以以皂化形式使用，例如这种不饱和脂肪酸的钠盐，随后将交联反应产物用强质子酸例如HCl等处理，以恢复块体改性的弹性体表面上的羧酸基团。在这个实施方案中，由于块体改性的弹性体及其块体表面之间扩散通道的长度导致质子酸可能无法到达块体的事实，因此块体改性的弹性体的块体中一部分脂肪酸部分可以保持皂化。如容易理解的那样，由于块体改性的弹性体因其一或多个表面上的羧酸基团的可用性而仍可以被制成生物相容的，因此这不是问题。为此可以使用任何合适类型的聚硅氧烷。
[0070] 或者，聚硅氧烷主链如(聚甲基)氢硅氧烷主链可以与橡胶样聚合物如聚丁二烯和聚异戊二烯交联，其中不饱和脂肪酸被掺入这种交联产物中。例如，这可以完成以调节最终材料的水渗透性，因为聚硅氧烷通常具有相当开放的结构，而这种橡胶样聚合物具有相当封闭的结构，由此交联产物的开放性即水渗透性可以通过其中的聚硅氧烷和橡胶样聚合物的比例而调节。以这种方式，可以优化根据这个实施方案的材料的细胞/蛋白质相互作用的性质以构建良好的支架。例如，在其中弹性体是基于聚硅氧烷的情况中，例如基于PDMS，获得了对水和其它化合物(例如药物)具有高渗透性的材料，该材料有助于在流体装置模块100的膜上将这些化合物最大程度地灌注于细胞中。但是，在需要实时监测细胞对药物消耗的情况下，可优选不透水和药物的基于多烯的材料如基于聚丁二烯的材料，因为这些化合物灌注细胞的速度可以使用穿过膜的孔的密度加以控制。
[0071] 在一个实施方案中，聚硅氧烷可以由如先前所述从多组分起始材料形成，以防止聚硅氧烷的过早交联。这种多组分起始材料是众所周知的，例如这种多组分起始材料试剂盒由德国慕尼黑的Wacker Chemie AG以商品名Elastosil销售。
[0072] 关于不饱和脂肪酸20，可以使用任何合适的不饱和脂肪酸以使其与弹性体10交联。例如，不饱和脂肪酸20可以选自肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、6顺-十六碳烯酸、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。亚油酸已经用于本发明的实施例中，但是应该理解这仅是非限制性实施例，可以替代地使用其它不饱和脂肪酸。在本申请的上下文中，当提到不饱和脂肪酸20时，应当理解这是指这样的任何有机化合物，其包含与包含10-30个碳原子的脂肪族尾共价键合的羧酸头部基团以及在脂肪族尾中包含至少一个碳-碳双键。脂肪族尾基可以终止于非芳族环结构，例如五元或六元环戊基或环己基，其自身可含有至少一个双键。符合上述不饱和脂肪酸20的定义的有机化合物的非限制性实例是视黄酸。除了在本申请中明确提及的示例化合物之外，许多其它化合物对于本领域技术人员将是眀显的。
[0073] 弹性体10和不饱和脂肪酸20可以以任何合适的比例在组合物中混合以形成块体改性的弹性体。优选地，不饱和脂肪酸20在这种组合物中以占弹性体重量的0.05-35％存在，由此在弹性体10的块体改性后，块体改性的弹性体保持其弹性至弹性体块体中保持存在碳-碳双键。
[0074] 下面给出了由多烯如聚丁二烯生产块体改性的弹性体的合成方法实例(合成实施例1)。
[0075] 合成实施例1
[0076] 将得自德国科隆的Lanxess AG的聚丁二烯块料插入混料机或混合挤出机中。这些块料含有过氧化物如过氧化二异丙苯作为催化剂。将占聚丁二烯块重量的1-30wt％的亚油酸(得自Aldrich Chemistry，60-74％浓缩)混合入聚丁二烯块体中，在110-150℃的温度捏合。将所得挤出的混合物注入限定流体装置且具有氧化内表面的不锈钢模具中，在150-200℃温度与挤出的混合物接触3-10分钟，产生与亚油酸交联的聚丁二烯橡胶的单块流体装置模块。
[0077] 下面给出了从硅橡胶生产块体改性的弹性体的示例合成方法(合成实施例2)。
[0078] 合成实施例2
[0079] 将121g亚油酸钠水溶液(30wt％)混合入得自Wacker Chemie AG的Elastosil LR 3040的聚硅氧烷组分A(240g)中，在室温在真空条件下用力搅拌以蒸发组合物中水份。将所得混合物与来自Wacker Chemie AG的Elastosil LR 3040的组分B(277g)(包括Pt催化剂)混合，然后进料于注塑设备中，在此将所得混合物注入不锈钢模具中，其具有氧化的内表面与所得混合物接触并定义流体装置模块，在150-200℃温度模制10-60秒，以产生与亚油酸钠交联的硅橡胶的单块流体装置模块。在较高浓度的亚油酸钠下，可以向反应混合物中加入额外的交联剂(聚甲基氢硅氧烷)以防止不饱和脂肪酸的过量双键降低转化率。随后将模制产物滴入HCl水溶液(pH 2-4)中以至少将模制产物表面的碳酸钠基团转化为游离羧酸基团。
[0080] 通过使其表面上的游离羧酸基团与细胞培养蛋白如纤连蛋白、胶原蛋白或弹性蛋白反应，可以使如此块体改性的弹性体是生物相容的。这在图2中示出，其中细胞培养蛋白40可以与从块体改性的弹性体30的表面31突出的脂肪酸尾部33的游离羧酸基团结合以形成细胞培养支架。这种细胞培养支架的细胞培养蛋白40可以稳定化哺乳动物细胞或组织
50，例如人体组织，由此细胞50保持存活并在长时间内正常繁殖，如众所周知的那样，因为细胞培养蛋白40模拟这种细胞的自然环境。下面给出了将纤连蛋白与表面羧酸基团共价结合的经充分论证的结合方案：
50，例如人体组织，由此细胞50保持存活并在长时间内正常繁殖，如众所周知的那样，因为细胞培养蛋白40模拟这种细胞的自然环境。下面给出了将纤连蛋白与表面羧酸基团共价结合的经充分论证的结合方案：
[0081]
[0082] 关于这个方案的描述可见于：L.H.H.Olde Daminnk,P,J,Dijkstra,M.J.A.Luyn,P.B.v.Wachem,P.Nieuwenhuis,and J.Feijen,“Cross-linking of dermal sheep collagen using a water-soluble carbodiimide”,Biomaterials,17(8)pp.765-774(1996)。
[0083] 在这个方案中，羧酸基团(化合物I)可以与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，化合物II)反应，然后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，化合物IV)反应，其可以与纤连蛋白(化合物VII)的胺基反应以将纤连蛋白共价结合到块体改性的弹性体30的羧酸基团上。以这种方式，纤连蛋白可以形成用于携带和培养哺乳动物细胞的支架。众所周知，这种细胞的整联蛋白受体可以识别纤连蛋白的特异性氨基酸序列，例如序列Arg-Gly-Asp-Ser，其触发细胞接受新环境并保持存活。如前所述，由于羧酸基团在这种表面上的高密度均匀分布，就块体改性的弹性体30的表面例如流体装置模块的膜表面的覆盖而言，可以形成具有高均匀性的这种支架。
[0084] 在图3和图4中示出流体装置模块100的典型实例，其中示出了流体装置模块100的相对主表面的透视图。流体装置模块100可包含膜110，其上延伸至少一个流动通道115。优选地，流体装置模块100包含由膜110在空间上隔开的相对流动通道。至少膜110由块体改性的弹性体30制成，尽管在优选实施方案中整个流体装置模块100均由块体改性的弹性体30制成，从而产生单块流体装置模块100。
[0085] 流体装置模块100可包含一或多个隔板120，流动通道115通过这些隔板可以接入。每个流动通道115优选可通过专用的隔板组120接入，从而避免了多个流动通道115之间的交叉污染。如上所述，流体装置模块100可以制成生物相容的，通过使如上所述的膜110上的羧酸基团反应以共价结合细胞培养蛋白，例如使膜110上的羧酸基团反应使细胞培养蛋白如纤连蛋白、胶原蛋白或弹性蛋白与膜110共价结合，从而细胞50可以在由此形成的生物相容性膜110的细胞培养支架上培养。由于在包括这种细胞培养蛋白的生物相容性膜上的这种细胞固定化方法是熟知的，因此仅出于简洁起见将不再进一步详细解释。可以说为此目的可以使用任何合适的方案。
[0086] 膜110可包含多个孔或槽，由此具有如潜在药物等的化合物的营养液和溶液可到达膜和细胞/组织的两侧，这些孔或槽可以以任何合适方式形成，例如通过激光切割。由于如上所述可以将膜110制成生物相容的，因此这些孔或槽的尺寸和间距的重要性小于现有技术装置中用于固定化和培养细胞材料的孔或槽的要求。换句话说，流体装置模块100的膜110中的这些孔或槽实质上可以大于要固定化在膜110上的细胞的典型直径，这些孔或槽之间的间距不是特别关键的。
[0087] 如图5示出的流体装置200可以从这种流体装置模块100通过提供一对盖板210、220而制成，这一对盖板流体密封流体装置模块100，由此液体流经流体装置模块100的一或多个流动通道115而不从流体装置200泄漏。
[0088] 在一个实施方案中，盖板210、220被安置为使得盖板210覆盖流体装置模块100的第一主表面，从而密封流体装置模块的第一流体通道115，而另一个盖板220覆盖流体装置模块100的第二主表面，从而密封流体装置模块的第二流体通道115。盖板210和220可以由任何合适材料制成，例如玻璃或塑料材料。优选地，盖板是可拉伸及弹性的，以确保与流体装置模块100的适当搭配，同时保持流体装置200中流体装置模块100的弹性。如本领域技术人员容易理解的，这种流体装置200可以配置为器官芯片。
[0089] 图6示出了流体装置200的示例实施方案，其中所述装置包括在两个刚性盖板210和220之间的本发明流体装置模块100。上板210包括第一入口231和第一出口232，与流体装置模块100中的膜110底下的下部通道(不可见)流体连接，由此膜110与流经该下部通道的流体接触。上板210还包括第二入口233和第二出口234，与膜110上的上部通道115流体连通，由此膜110与流经该上部通道115的流体接触。例如，如下文更详细地解释，流经下部通道的流体可包含附着于膜110的细胞培养物上的待测试药物，由于膜110可以是多孔的例如如前述通过在膜110上经激光钻孔或槽而制成多孔的事实，其可通过膜110到达细胞培养物。或者，当在极性模具中形成流体装置模块100时，可以在膜110中形成这种孔或槽。这样的优点是这种流体通道(孔)的规则模式可以通过膜110形成。流经上部通道115的另外流体可以与这种细胞培养物直接接触并为这种细胞培养物提供营养。在一些实施方案中，入口231、233和出口232、234是隔板，流体经液压可以通过上述隔板泵过膜110，例如通过加压所述隔板。或者，入口231、233和出口232、234可以是套管，可将管例如通过夹紧而附于其上，例如当流体装置200在实验室中用作芯片系统上的孔板等时，这是有用的。
[0090] 在一个实施方案中，上部通道和下部通道被并入(单块)流体装置模块100中，例如当模制流体装置模块100时。或者，上部通道和下部通道中的至少之一可在盖板之一中形成。图7示出了流体装置200的一个示例实施方案的透视顶视图，图8示出了其底视图，其中上部通道115在上盖板210中形成，而下部通道115'在流体装置模块100中形成。如本领域技术人员将容易理解的，在底盖板220中形成下部通道115'当然是同样可行的。流体装置200如图7和图8中示出的装置例如在实验室芯片装置上可以用作微孔，其中多个这种微孔可以夹紧或另外固定以便于在一个实验室芯片装置上平行测试多个不同样品，其中每个微孔通常包含这些样品之一。
[0091] 在将细胞培养物50固定化在这种流体装置200中之后，通常在如上所述将膜110制成生物相容的之后，可以将流体装置200用于其中将固定化的细胞培养物50暴露于包含感兴趣化合物的流体的方法中，所述流体可流经流体装置200的流动通道115以将固定化的细胞培养物50暴露于流体中的感兴趣化合物并监测固定化的细胞培养物50对这种暴露的反应。这种方法可例如用于肿瘤学环境中，其中固定化的细胞培养物50可以暴露于药物例如化疗药物，以监测固定化的细胞培养物50对这种药物的反应。为此，固定化的细胞培养物50可包括肿瘤细胞以测试药物的功效和/或可以包括健康细胞以测试药物对健康组织的毒性。
[0092] 这种药物测试方法通常包括提供根据本发明一或多个实施方案的流体装置模块100，例如提供单块流体装置模块100以及至少将流体装置模块100的膜110与细胞培养蛋白
40如纤连蛋白结合以获得细胞培养支架。接着，将收获的细胞培养物50应用于细胞培养支架以获得制备的流体装置模块100，如前所述从中可以形成流体装置200例如器官芯片。流体装置200内的细胞培养物可以通过流体装置200的一对流动通道115之一补料，以保持细胞培养物存活，而细胞培养物可以通过流体装置200的一对流动通道115的另一通道暴露于待测试药物，通常通过监测细胞培养物50对待测药物的反应完成药物测试方法。例如，这可以通过以下方式来实现：通过移除盖板210、220拆卸流体装置200及切割流体装置模块100，从而获得这个模块包括一部分细胞培养物50的切片，该切片可以在显微镜等下进行研究以研究测试药物对细胞培养物50的作用。在研究期间，通常将细胞培养物50染色，用福尔马林处理及在固定剂如石蜡中固定以便于这种使用显微镜研究。细胞培养物50的这种染色、处理和固定可以在流体装置200内进行，例如通过使适当的化学试剂流经暴露了所述细胞培养物50的流体装置200的流体通道115。
40如纤连蛋白结合以获得细胞培养支架。接着，将收获的细胞培养物50应用于细胞培养支架以获得制备的流体装置模块100，如前所述从中可以形成流体装置200例如器官芯片。流体装置200内的细胞培养物可以通过流体装置200的一对流动通道115之一补料，以保持细胞培养物存活，而细胞培养物可以通过流体装置200的一对流动通道115的另一通道暴露于待测试药物，通常通过监测细胞培养物50对待测药物的反应完成药物测试方法。例如，这可以通过以下方式来实现：通过移除盖板210、220拆卸流体装置200及切割流体装置模块100，从而获得这个模块包括一部分细胞培养物50的切片，该切片可以在显微镜等下进行研究以研究测试药物对细胞培养物50的作用。在研究期间，通常将细胞培养物50染色，用福尔马林处理及在固定剂如石蜡中固定以便于这种使用显微镜研究。细胞培养物50的这种染色、处理和固定可以在流体装置200内进行，例如通过使适当的化学试剂流经暴露了所述细胞培养物50的流体装置200的流体通道115。
[0093] 在另一个实施方案中，可以避免流体装置200的这种拆卸且可以使用共聚焦显微镜实时实现监测对细胞培养物50对一或多种化合物如待测药物的反应。特别地，在流体装置200的实施方案包含透明盖板210、220如玻璃盖板或聚合物盖板的情况下，可以使用共聚焦显微镜监测组装的流体装置200内的细胞培养物50。这通过以下事实是可能的：至少底部盖板220可以保持较薄，例如厚度为150-300μm，携带细胞培养物50的流体装置模块100的膜110与底部盖板220之间的距离小于200μm，由此符合共焦显微镜的焦距限制(通常从待研究物体至透镜物镜为大约500μm)。为此，膜110的厚度可以在10-100μm的范围，如20-30μm的厚度。上盖板210的厚度不重要；可以考虑任何合适的厚度，例如300μm-3mm的厚度。
[0094] 使用共聚焦显微镜对流体装置200内的细胞培养物50进行评估特别适合于细胞球体的直径小于500μm例如大约200μm以保证光路的总焦距便于使用共聚焦显微镜捕获清晰图像。对于较大的球状体，可能必须拆卸流体装置200，由此可以将包括球状体的膜110压在玻璃盖玻片上，以在共焦显微镜的光学物镜中定位。
[0095] 此外要注意的是，流体装置200的上述尺寸通常适用于实时监测在流体装置200内的细胞培养物50。在其中流体装置200如前述切片的实施方案中，例如对于数字病理学而言，只要可以在其上进行福尔马林和石蜡固定，流体装置200的尺寸就不那么关键。
[0096] 如本领域技术人员容易理解的，这种药物测试方法在方案上可能有明显不同，例如药物剂量、施用频率等。应当理解，本发明的药物测试方法不限于特定方案，只要这种方法可以使用根据本发明实施方案的流体装置200开展即可，其中至少膜110如前所述通过使其羧酸基团与细胞培养蛋白反应而将其转变为细胞培养支架而成为生物相容的。
[0097] 在这一点上，提供了关于弹性体10和不饱和脂肪酸20的碳-碳双键之间的交联反应以及纤连蛋白与这种块体改性的弹性体(的羧酸基团)的成功结合的补充证据。
[0098] 在下文中，使用Thermo iS50 FTIR工作台组合可加热的Golden Gate ATR模块记-1录FT-IR光谱。所有测量平均使用64次扫描。在测量中，使用4000-650cm 的光谱范围将分辨率设置为4cm-1。为使用这种分辨率，将内部光谱仪孔径设置为50％。
[0099] 使用Renishaw InVia Raman显微镜组合由Coherent Innova 70C Ar+激光器提供的514nm激光激发波长记录Raman光谱。组合使用50mW激发功率与63x玻璃校正物镜。光谱通过玻璃顶盖使用1200行/毫米的光栅以及使用平均300幅光谱在662-3000cm-1光谱范围在2s积分时间记录，由此每个光谱需要600s记录。
[0100] 图9示出亚油酸钠的部分FT-IR光谱。实线箭头表示在大约3050cm-1的C-H伸缩振动，已将其分配给亚油酸钠的C-C双键，而虚线箭头表示在大约1600cm-1的C＝O伸缩振动，已将其分配给亚油酸钠的羧酸基团。图10示出在监测如上述合成实施例2所述的反应进程期间，这个C-H伸缩振动强度和C＝O伸缩振动强度之间随着时间变化的比率。在两个石英板之间记录样品，同时加热样品至200℃以诱导交联反应。图10中可以清楚地看出，在交联反应期间可见亚油酸钠中C-C双键的减少，而羧酸伸缩振动强度保持不变，这清楚表明在交联反应中C-C双键被消耗，因此清楚表明亚油酸钠与聚硅氧烷弹性体之间的交联。
[0101] 为进一步证实这一点，使用与记录FT-IR光谱相同的样品设置，通过Raman光谱学进一步监测交联反应，以使环境氧对交联反应的影响最小化。在Raman光谱中，C＝O伸缩振动是无活性的，而C＝C伸缩振动示出清晰活性，如图11所示。
[0102] 基于开始对样品进行热稳定直至t＝250s(在此期间样品用Raman光谱仪中使用的激光进行热平衡)，Raman光谱显示亚油酸钠的C＝C伸缩振动稳定下降，因此清楚表明这些键在与聚硅氧烷弹性体的交联中是有活性的。
[0103] 为进一步证实合成实施例1和2中弹性体的块体改性，将一块与亚油酸反应后的每种弹性体如前所述在极性模具中模制，然后在-40℃用切片机切片以获得改性弹性体的内部切片，即其主表面均不是模制的弹性体模块的外表面的切片。随后将这些内部切片与2μl不同pH值(pH 4，pH 7和pH 10)的水滴接触3分钟，之后测量水滴与这些内部切片的接触角。使用未改性的弹性体重复进行相同步骤以将亚油酸改性的弹性体的内部切片的测量的接触角与相应未改性弹性体的内部切片的测量的接触角比较。基于聚硅氧烷的弹性体的结果示于图12，基于聚丁二烯的弹性体的结果示于图13。对于基于聚硅氧烷的弹性体，使用
6.6wt％亚油酸形成的官能化弹性体用于块体和表面接触角测量，而对于聚丁二烯弹性体，使用6wt％亚油酸形成的官能化弹性体用于表面接触角测量，使用1.5wt％亚油酸形成的官能化弹性体用于块体接触角测量。对于聚丁二烯弹性体，亚油酸浓度在表面和块体接触角测量之间的差异仅是在测量时样品可用性的结果。
6.6wt％亚油酸形成的官能化弹性体用于块体和表面接触角测量，而对于聚丁二烯弹性体，使用6wt％亚油酸形成的官能化弹性体用于表面接触角测量，使用1.5wt％亚油酸形成的官能化弹性体用于块体接触角测量。对于聚丁二烯弹性体，亚油酸浓度在表面和块体接触角测量之间的差异仅是在测量时样品可用性的结果。
[0104] 从这些图可以看出，与亚油酸交联的聚丁二烯及与(皂化的)亚油酸交联的聚硅氧烷的内部切片均示出测量的接触角具有很强的pH依赖性，随着pH的升高，测量的接触角减小，而未改性的聚丁二烯和聚硅氧烷的测量的接触角在很大程度上是pH非依赖性的。不希望受到理论束缚，对于未官能化的聚硅氧烷随着pH增加而测量的接触角的小幅增加可能是对于水分子与聚硅氧烷中硅烷醇部分之间氢键的pH依赖性所致。
[0105] 对于大部分官能化弹性体，测量的接触角的pH强依赖性清楚表明在与不饱和脂肪酸如亚油酸交联的大部分弹性体中存在羧酸基团。这可以如下所述加以理解。在较低的pH，这些羧酸基团大部分保持质子化，从而使弹性体的内部切片的表面电荷最小化。随着pH增加，由于羧酸基团的去质子化增加导致这种表面电荷增加，降低了水滴与这些内部切片的表面的接触角。另一方面，在这种羧基基团未存在于暴露于水滴的表面时，如在未改性的弹性体中，水滴的pH值变化不引起表面电荷的变化，因此测量的不同pH值水滴与这种表面的接触角对这些pH值变化的敏感度要低得多。
[0106] 为进一步证明本发明的材料结合细胞培养蛋白如纤连蛋白的能力，将该材料的示例实施方案与纤连蛋白结合，并且记录表面等离子体共振(SPR)光谱以证实这种结合反应。
[0107] 在胺SPR芯片(高容量胺芯片SPR亲和性传感器，Sierra Sensors,Hamburg,Germany)和裸金SPR芯片(裸金12pk.SPR亲和性传感器，Sierra Sensors,Hamburg,Germany)上使用德国汉堡的Sierra Sensors提供的SPR2光谱仪进行SPR实验，所述芯片用在正庚烷中聚丁二烯块和亚油酸的溶液旋涂。所述溶液通过如下制备：在玻璃瓶中在70℃将聚丁二烯块在正庚烷中溶解72小时及同时摇动该瓶，然后加入亚油酸并搅拌成混合物。在观测到流动并通过冲洗和除气使系统稳定之后，进行角度扫描以检查所有通道之间的相关性。保存角度扫描数据，然后进行纤连蛋白交联试验。
[0108] 通过在表面上分3个阶段注入2种溶液而对芯片表面进行预处理。第一次注入以10μl/min流速及解离时间设为1秒注入60μl的100mM盐酸(HCl)。第二次注入以10μl/min流速及解离时间设为1秒注入由1M氯化钠(NaCl)和100mM氢氧化钠(NaOH)组成的60μl洗脱缓冲液。第一阶段由通过通道1和2注入所述溶液组成，第二阶段由通过通道3和4注入所述溶液组成，而第三阶段和最后阶段由通过通道1-4注入所述溶液组成。
[0109] 预处理后，将所有通道清洗并用EDC/NHS激活。这如下进行：混合100μl EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，Sigma-Aldrich,Saint Louis,USA)和100μl NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，Sigma-Aldrich,Saint Louis,USA)的9.6mg/ml的MilliQ原液，然后将60μl混合物以10μl/min流速和1s解离时间注入所有4个通道的表面上。
[0110] 对所有通道进行预处理并用EDC/NHS激活后，向通道中以10μl/min流速注入60μl溶解于pH 5.5乙酸钠缓冲液(Biacore，Diegem，Belgium)中的来自牛血浆粉的纤连蛋白(Bio Reagent,适于细胞培养，Sigma Aldrich,Saint Louis,MO,USA)。通道2注入1μg/ml纤连蛋白，解离时间为1s；通道3注入5μg/ml纤连蛋白，解离时间为1s；通道4注入10μg/ml纤连蛋白，解离时间为1s(通道1用作参考)。
[0111] 随后用60μl运行缓冲液PBS、0.05％Tween以10μl/min流速和1s解离时间冲洗系统的所有四个通道以确定纤连蛋白是否确实结合本发明的材料。保存光谱数据并使用分析仪程序(Analyzer R2 Sierra Sensors Sierra Sensors,Hamburg,Germany)进行分析。
[0112] 图14示出包含由与亚油酸交联的聚丁二烯制成的流体装置模块100的流体装置200的表面等离子体共振(SPR)光谱，如上所述将改性的聚丁二烯与EDC和NHS反应，及将所得结构与纤连蛋白反应。从SPR光谱可以清楚看出，纤连蛋白与改性的聚丁二烯的表面结合，从而表明这种块体改性的弹性体可以成功地转变为细胞培养支架。图15示出了图14的部分SPR光谱，其中清楚示出了这种表面改性。可以看出，SPR基线偏移了大约2000RU，因此清楚表明纤连蛋白与亚油酸改性的聚丁二烯的结合。此外，在流体装置200暴露于液体流(冲洗)时，SPR光谱保持稳定，从而进一步证实亚油酸与聚丁二烯(共价)结合，因为在此期间没有亚油酸被洗掉。如所预期的，在最高浓度的纤连蛋白(即通道4中的芯片)观测到纤连蛋白与本发明材料之间最强的共价结合。
[0113] 接下来，研究了细胞系MDA-MB231和MCF-7与通道4的芯片的结合，以证实共价结合的纤连蛋白结合这些细胞系的能力。为此，在通道2-4(通道1再次用作参考)中用新鲜芯片重复上述SPR程序，在其上以10μl/min的流速以解离时间1s运行60μl的10μg/ml纤连蛋白以用纤连蛋白涂覆该新鲜芯片的表面。在用纤连蛋白细胞再次涂覆所述表面后，将2×106细胞/ml的MDA-MB231在200μl的4个注射步骤中流经通道2，流速为10μl/min，解离时间设置为最大1800s以使细胞有足够时间与纤连蛋白结合。使用1.3×106细胞/ml的细胞系MCF-7，在200μl的4个注射步骤在通道4进行相同操作。总共给予细胞近2小时以结合芯片表面。随后将细胞暴露于200μl具有0.05％Tween的运行缓冲液PBS，将该缓冲液以10μl/min的流速和最大解离时间注入通道1-4以冲洗掉未与芯片表面结合的任何细胞。通过在通道1、2、3和4上以流速10μl/min和最大解离时间注射200μl的0.25％胰蛋白酶，以从芯片表面除去结合的细胞。
[0114] 在每次实验后，将SPR机器通过用70％乙醇冲洗系统、用1-2％次氯酸盐消毒及用0.5％SDS、50mM甘氨酸-NaOH(pH 9.5)置换洗脱进行清洁，以减少污染物或其它污垢堆积在系统中。
[0115] 图16示出在用MDA-MB 231和MCF-7细胞系的细胞接种所述装置后，纤连蛋白结合的亚油酸改性的基于聚丁二烯的流体装置200的SPR光谱。可以看出，这些细胞系附着于结合亚油酸改性的聚丁二烯的纤连蛋白。当用运行缓冲液冲洗该装置时，细胞仍保持附着在流体装置200，但可以被胰蛋白酶溶液裂解掉。因此这清楚表明，细胞通过与膜表面共价结合的纤连蛋白而有效结合所述装置膜，因为纤连蛋白(和结合的细胞)没有被运行缓冲液洗掉。
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