改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白
阅读：870发布：2020-05-11
专利汇可以提供改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种改变二倍体 马 铃薯材料自交不 亲和性 的StSCI蛋白，所述StSCI蛋白的 氨 基酸序列包含或由如下序列组成：1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，2)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的功能性同源序列；或3)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如1-10个)氨基酸且具有抑制自交不亲和活性的 蛋白质 。本发明的优点在于，StSCI蛋白可以抑制多种类型S-RNase的细胞毒性作用，具有遗传性，从根本上克服了二倍体马铃薯自交不亲和的 缺陷 ，有利于实现二倍体马铃薯高代纯合自交系的培育。，下面是改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白专利的具体信息内容。
1.一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白，其特征在于，所述StSCI蛋白的氨基酸序列包含或由如下序列组成：
1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，
2)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的功能性同源序列；或
3)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如1-10个)氨基酸且具有抑制自交不亲和活性的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的StSCI蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的编码StSCI蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列，包含或由如下序列组成：
1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或，
2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的互补序列、简并序列或同源序列；
优选地，其中所述同源序列为与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90％或以上、
91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、
98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、
99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性且编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的多核苷酸序列，或其相对应的cDNA分子；
3)在严格条件下与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的核苷酸序列。
4.用于调节权利要求2或3所述核苷酸序列的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列包含或由如下序列组成：
1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，
2)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的功能性同源序列；或，
3)在严格条件下与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补序列。
5.如权利要求4所述的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列与异源编码序列可操作连接。
6.用于扩增权利要求2或3所述核苷酸序列的PCR引物；
优选地，所述引物是上游引物和/或下游引物，其中上游引物包含5 ′-
ATGGACTATTTCCTATTGCTACCAGAAGG-3′(SEQ ID NO.4)的序列；
下游引物包含5′-TCATTCTGGTCTAAATTCAATTCCTTGAA-3′(SEQ ID NO.5)的序列。
7.包含权利要求2或3所述核苷酸序列，和权利要求4或5所述的启动子的载体。
8.包含权利要求2或3所述核苷酸序列，和异源启动子的载体。
9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述异源启动子包括：CaMV35S启动子、NOs启动子、Ocs启动子；
优选CaMV35S启动子。
10.如权利要求7-9任一项所述的载体，其特征在于，所述载体包括：pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIA super1300-GFP、pCAMBIA super1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP；
优选pCAMBIA1301。
11.导入了权利要求2或3所述核苷酸序列的微生物或植物细胞。
12.导入了权利要求7-10任一项所述载体的微生物或植物细胞。
13.如权利要求11或12所述的微生物或植物细胞，其特征在于，所述微生物包括：农杆菌、枯草杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌、昆虫细胞；
优选农杆菌。
14.一种在植物中表达目的基因的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述核苷酸序列，或将权利要求7-10任一项所述的载体，或将权利要求11-13任一项所述的微生物转入植物体中，获得目的基因表达；
优选地，所述植物包括二倍体马铃薯。
15.一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，其包括使二倍体马铃薯植物表达权利要求1所述的蛋白；优选地，所述方法包括将权利要求2或3所述核苷酸序列，或将权利要求
7-10任一项所述的载体，或将权利要求11-13任一项所述的微生物转入二倍体马铃薯中，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白表达。
16.采用权利要求14或15所述的方法获得的二倍体马铃薯植物、马铃薯块茎、马铃薯叶子。
17.一种二倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，包含权利要求2或3所述核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或权利要求16所述的二倍体马铃薯植物进行自交或与其他二倍体马铃薯植物进行杂交。
18.一种二倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，包含权利要求2或3所述核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或权利要求16所述的二倍体马铃薯植物加倍变成四倍体后与其他四倍体马铃薯植物进行杂交后再降倍变成二倍体马铃薯植物。
19.一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，包含权利要求2或3所述核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或权利要求16所述的二倍体马铃薯植物加倍变成四倍体后与其他四倍体马铃薯植物进行杂交。
20.由权利要求16所述的二倍体马铃薯植物，或权利要求17或18所述的二倍体马铃薯的育种方法获得的二倍体马铃薯植物，或权利要求19所述的四倍体马铃薯的育种方法获得的四倍体马铃薯植物制备的食品；
优选地，所述食品包括：新鲜的马铃薯、干燥的马铃薯、冷冻的马铃薯、薯条、薯片、马铃薯面粉或马铃薯淀粉。
改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白
技术领域
[0001] 本发明涉及遗传育种技术领域，具体涉及一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白。
背景技术
[0002] 二倍体马铃薯实生种子育种指的是通过连续多代自交培育基因组基本纯合的高代自交系，然后将自交系相互杂交产生具有杂种优势的F1代杂交种子，利用杂交一代种子实现马铃薯种植的计划。相比于传统的四倍体块茎繁殖，二倍体实生种子育种工作有以下突出优势：首先传统四倍体育种的亲本含有高度杂合的四套染色体组，遗传背景复杂，优良性状出现频率低，育种效率低下，育成优良品种的难度大。而二倍体亲本材料由于只含有两套染色体组，遗传背景相对简单，能够很好的克服四倍体的缺陷，并且水稻、玉米等主要粮食作物均是二倍体杂交育种，这些作物的育种经验可为二倍体马铃薯实生种子育种工作的开展提供很好的技术借鉴。其次相较于传统的块茎繁殖，种子繁殖具有很多优势。块茎繁殖的效率低，一个种薯只能产生约10个薯块，每年生产种薯需要耗费大量的土地，并且种薯不易存储运输又容易积累各类病虫害。种子繁殖能有效克服上述缺点，种子繁殖的繁殖效率高达1:5000～10000，种子体积小重量轻，易于存储运输，且基本不携带病虫害。
[0003] 虽然二倍体马铃薯实生种子育种具有突出的优势，但是二倍体马铃薯的自交不亲和性限制了实生种子育种工作的开展，很难通过多代自交的方式获得纯合的亲本材料。因此打破二倍体马铃薯的自交不亲和具有重要的现实意义。
[0004] 研究表明，马铃薯的自交不亲和属于配子体型自交不亲和，由1号染色体上的S-基因座控制，当自身或具有相同S单倍型的花粉落在柱头上时，花粉管不能一直延伸至胚珠完成受精过程，即自花授粉是不能产生种子的。S-基因座中至少包含两类基因，一类是在雌蕊中特异表达的，决定了雌蕊的自交不亲和反应，因此被称为雌蕊S因子，编码的是一类分泌型的RNase，被命名为S-RNase；另一类决定了雄蕊的自交不亲和反应，被称为雄蕊S因子，编码的是一类F-box蛋白，被命名为SLF(S-Locus F-box)蛋白。S-RNase在雌蕊花柱传导组织细胞中表达，表达后被分泌至花柱的传导管中，当花粉在柱头上萌发后，花粉管延伸至传导管中，游离的S-RNase进入到花粉管中，S-RNase能够降解花粉管中的rRNA并解聚花粉管中的细胞骨架最终造成花粉管细胞死亡，具有细胞毒性作用，终止花粉管的延伸。在花粉管中表达的SLF蛋白具有一定程度的解毒作用，通过与其它蛋白质共同组成SCF复合体，可以特异性的识别并泛素化S-RNase，被泛素化的S-RNase由26S蛋白酶体降解。但是某一特定的SLF蛋白只能解除某一种或者几种S-RNase的细胞毒性，且肯定不能识别自身雌蕊产生的S-RNase，因此二倍体马铃薯自交是不亲和的。
[0005] 现有的创制自交亲和的二倍体马铃薯材料的方法主要是利用一种自交亲和的二倍体野生马铃薯S.chacoence作为父本，与其它二倍体马铃薯材料杂交后通过大量授粉工作鉴定后代是否是自交亲和的，这一方法的主要缺点是该野生马铃薯与二倍体栽培马铃薯的亲缘关系较远，杂交后代会导入很多野生不良性状，如薯块变小、薯肉龙葵素含量升高、匍匐茎变长等，需要多代回交才可剔除这些野生不良性状，耗费了大量的时间和人力资源。因此，亟需研发更好的方式去克服马铃薯的自交不亲和性。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明提供一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白，StSCI蛋白可以抑制多种S-RNase的细胞毒性作用，以此来克服二倍体马铃薯自交不亲和的缺陷，从而获得一种新的二倍体马铃薯自交亲和材料，实现二倍体马铃薯实生种子育种。
[0007] 本发明一方面提供了一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白，所述StSCI蛋白的氨基酸序列包含或由如下序列组成：
[0008] 1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，
[0009] 2)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的功能性同源序列；或
[0010] 3)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如1-10个)氨基酸且具有抑制自交不亲和活性的蛋白质。
[0011] 本发明通过大规模的资源筛选，发现二倍体马铃薯材料RH89-039-16是自交亲和的，即自花授粉可以产生种子。利用RH89-039-16的花粉对原本自交不亲和的马铃薯二倍体材料PI 225689进行授粉，收获种子作为F1代，对F1代植株的自交亲和性状进行调查发现自交亲和与自交不亲和的植株各占一半，说明RH89-039-16中的自交亲和基因处于杂合状态，而RH89-039-16表现出自交亲和性状，说明控制RH89-039-16的自交亲和的基因是显性的，把这个显性基因命名为自交亲和诱导基因(Self-compatibility inducer),简写为StSCI基因。
[0012] StSCI基因编码的蛋白被命名为StSCI蛋白，StSCI蛋白可以降解多种S-RNase，从而阻止S-RNase降解花粉管中的rRNA和解聚花粉管中的细胞骨架，保证花粉管的正常延伸，进而克服了二倍体马铃薯材料的自交不亲和性。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述StSCI蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述StSCI蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的功能性同源序列。所述的同一性的功能性同源序列包括但不限于SEQ ID NO.2所示的氨基酸具有约95％或以上、95.5％或以上、96％或以上、96.5％或以上、97％或以上、97.5％或以上、98％或以上、98.5％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性的氨基酸序列。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述StSCI蛋白的氨基酸序列为在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、)氨基酸且具有抑制自交不亲和活性的蛋白质。
[0016] 本发明另一方面提供一种编码上述的StSCI蛋白的核苷酸序列。
[0017] 进一步的，所述编码上述的StSCI蛋白的核苷酸序列，包含或由如下序列组成：
[0018] 1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或，
[0019] 2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的互补序列、简并序列或同源序列；
[0020] 优选地，其中所述同源序列为与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列约90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、
98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、
99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性且编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的多核苷酸序列，或其相对应的cDNA分子；或[0021] 3)在严格条件下与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的核苷酸序列。
98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、
99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性且编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的多核苷酸序列，或其相对应的cDNA分子；或[0021] 3)在严格条件下与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的核苷酸序列。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述编码上述的StSCI蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述的同源序列包括但不限于SEQ ID NO.2所示的核苷酸具有约90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性的多核苷酸，或其相对应的cDNA分子。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列为在严格条件下与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的核苷酸序列。
[0025] 示例性地，在本文中所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性。这些在严格条件下杂交的核苷酸序列可用于，例如，表达SEQ ID NO.1的变体蛋白质或可作为引物、探针、外源供体序列、向导RNA、反义RNA、shRNA和siRNA。
[0026] 在本发明的一种实施方式中，所述的简并序列，改变SEQ ID NO.2核苷酸某个或多个核苷酸序列后，改变序列位置对应编码的氨基酸种类不变，编码的StSCI蛋白的氨基酸序列不变。
[0027] 本发明另一方面提供一种调节编码StSCI蛋白核苷酸序列的启动子，所述启动子的核苷酸序列包含或由如下序列组成：
[0028] 1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，
[0029] 2)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的功能性同源序列；或，
[0030] 3)在严格条件下与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补序列。
[0031] 启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。
[0032] 调节编码StSCI蛋白核苷酸序列的启动子的序列长度并不能准确地确定，只要包含核心启动子片段在内的启动子均可以使编码StSCI蛋白基因表达。
[0033] 在本发明的一种实施方式中，启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。该启动子区域包含了一段长度为538bp的序列，该序列为SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.6位于StSCI基因的起始密码子上游100bp处，含有一个注释的启动子核心元件。SEQ ID NO.6序列的缺失造成了StSCI基因在常规二倍体马铃薯材料，例如PI 225689、S15-65等中不表达，这也是常规二倍体材料不亲和的原因。而在二倍体马铃薯材料RH89-039-16中，StSCI基因的启动子区域如SEQ ID NO.3所示，包含有SEQ ID NO.6的序列，因此StSCI基因在RH89-039-16的花粉中具有很高的表达水平，能够有效解除S-RNase的细胞毒性，因此RH89-039-16是自交亲和的。
[0034] 在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0035] 在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列为与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的功能性同源序列。
[0036] 优选地，其中所述同源序列为与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列约90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、
98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、
99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性的多核苷酸。
98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、
99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性的多核苷酸。
[0037] 在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列为在严格条件下与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补序列。
[0038] 示例性地，在本文中所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性。
[0039] 进一步地，所述启动子的核苷酸序列与异源编码序列可操作连接。
[0040] 在本发明的一种实施方式中，自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16中提供的启动子核苷酸序列，与其它种类自交不亲和的二倍体马铃薯提供的StSCI基因，即异源的编码StSCI蛋白序列可以操作连接，进而可以在细胞外构建包含所述启动区区域和异源编码区的重组基因片段，用于后续的基因工程操作。
[0041] 本发明另一方面提供一种扩增所述编码StSCI蛋白核苷酸序列的PCR引物。
[0042] 此处对扩增编码StSCI蛋白核苷酸序列的PCR产物的核苷酸序列不做具体的限定，能够满足特异性扩增出所述的编码StSCI蛋白核苷酸序列的引物即可。
[0043] 在本发明的一种优选地实施方式中，所述PCR引物是上游引物和/或下游引物，其中上游引物包含5′-ATGGACTATTTCCTATTGCTACCAGAAGG-3′(SEQ ID NO.4)的序列；下游引物包含5′-TCATTCTGGTCTAAATTCAATTCCTTGAA-3′(SEQ ID NO.5)的序列。
[0044] 使用上游引物和下游引物组合成的引物对进行PCR扩增，可以扩增出编码StSCI蛋白的核苷酸序列的双链DNA。优选上述引物对进行PCR扩增，扩增出的StSCI基因条带特异性好，杂带少。
[0045] 本发明另一方面提供一种包含所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述的启动子的载体。
[0046] 编码StSCI蛋白的核苷酸序列和启动子组成的核苷酸序列，与载体的核苷酸序列具备相同的酶切位点或者同源重组位点，从而构成重组的表达载体。对具体的载体种类不作限定，能够满足成功构建重组的表达载体，且该表达载体能够通过工程菌介导进入二倍体马铃薯中正常表达StSCI基因即可。
[0047] 进一步，载体包括但不限于pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIA super1300-GFP、pCAMBIA super1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP中的一种或几种的组合。
[0048] 在本发明的一种优选地实施方式中，一种包含所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和异源启动子的载体。
[0049] 需要说明的是，此处“异源启动子”表示调节StSCI基因的启动子不是来源于提供StSCI基因的具有自交亲和性的二倍体马铃薯，其来源可以包括但不限于其它种类的具有自交亲和性的二倍体马铃薯，或植物基因工程中常用的启动子。
[0050] 进一步，所述异源启动子包括但不限于：CaMV35S启动子、NOs启动子、Ocs启动子。
[0051] 在本发明的一种优选地实施方式中，异源启动子为CaMV35S启动子。
[0052] 进一步，载体包括但不限于pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIA super1300-GFP、pCAMBIA super1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP中的一种或几种的组合。
[0053] 在本发明的一种优选地实施方式中，载体为pCAMBIA1301。
[0055] 本发明另一方面提供一种导入了所述载体的微生物或植物细胞。
[0056] 本发明中所述的编码StSCI蛋白的核苷酸序列和/或载体可以被引入到微生物或植物细胞中。此处，“微生物”是指引入StSCI基因的特定微生物，并且还包括携带所述载体的这种微生物的子代。微生物可以是任何原核或真核细胞生物。
[0057] 进一步，StSCI基因可以在微生物，包括但不限于农杆菌、枯草杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌、昆虫细胞中表达。或本领域技术人员常用的其它合适作为宿主细胞的微生物。
[0058] 进一步，微生物优选农杆菌。农杆菌的菌种包括但不限于：农杆菌LBA440、农杆菌EHA101、农杆菌EHA105、农杆菌GV3101。
[0060] 本发明另一方面提供一种植物中表达目的基因的方法，将所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列，或将所述的载体，或将所述的微生物转入植物体中，获得目的基因表达。
[0061] 进一步，所述植物包括但不限于：二倍体马铃薯、水稻、小麦、玉米、大豆、拟南芥、烟草、番茄、土豆、油菜、萝卜、甘蓝、洋葱。
[0062] 进一步，所述植物也包括如外植体的植物部分，包括但不限于：插条、组织培养物、细胞悬浮液和愈伤组织。
[0063] 进一步，所述植物更优选为二倍体马铃薯。
[0064] 本发明另一方面提供一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，其包括使二倍体马铃薯植物表达所述的StSCI蛋白。
[0065] 进一步，将所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列，或将所述的载体，或将所述的微生物转入二倍体马铃薯中，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白表达。
[0066] 进一步，微生物优选农杆菌。农杆菌的菌种包括但不限于：农杆菌LBA440、农杆菌EHA101、农杆菌EHA105、农杆菌GV3101。
[0067] 进一步，载体包括但不限于pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIA super1300-GFP、pCAMBIA super1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP中的一种或几种的组合。
[0068] 进一步，在体内和体外将StSCI基因引入工程菌的方法包括但不限于电穿孔、聚乙二醇(PEG)转化、脂质转染、热休克、磷酸钙沉淀、病毒介导和显微注射。
[0069] 在本发明的一种具体实施方式中，一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，采用农杆菌，将携带有所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述同源启动子的pCAMBIA1301载体转入二倍体马铃薯中，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白大量表达。
[0070] 在本发明的一种具体实施方式中，一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，采用农杆菌，将携带有所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体转入二倍体马铃薯中，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白大量表达。
[0071] 本发明另一方面提供所述的产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物、马铃薯块茎、马铃薯叶子。
[0072] 在本发明的一种具体实施方式中，所述二倍体马铃薯中包括有编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述同源启动子的pCAMBIA1301载体。所述载体进入二倍体马铃薯中，在同源启动子的激活作用下，StSCI基因能够表达StSCI蛋白，进而抑制多种S-RNase的细胞毒性作用，使所述二倍体马铃薯具有自交亲和性。
[0073] 在本发明的一种具体实施方式中，所述二倍体马铃薯中包括有编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述异源CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体。所述载体进入二倍体马铃薯中，在异源CaMV35S启动子的激活作用下，StSCI基因能够表达StSCI蛋白，进而降解多种S-RNase，使所述二倍体马铃薯具有自交亲和性。
[0074] 本发明另一方面提供一种二倍体马铃薯的育种方法，包含编码所述的StSCI蛋白的核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或所述的在植物中表达目的基因的方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物进行自交或与其他二倍体马铃薯植物进行杂交。
[0075] 在本发明的一种具体实施方式中，利用本身含有StSCI基因的自交亲和的二倍体马铃薯材料(例如RH89-039-16)进行自交，二倍体马铃薯本身的雄蕊产生的花粉给本身的雌蕊进行授粉，通过自交产生具有自交亲和性的二倍体马铃薯后代和二倍体马铃薯实生种子。
[0076] 在本发明的一种具体实施方式中，利用本身含有StSCI基因的自交亲和的二倍体马铃薯材料(例如RH89-039-16)的花粉，对其它二倍体马铃薯材料(例如自交不亲和的二倍体马铃薯)进行授粉，通过杂交把二倍体马铃薯材料RH89-039-16中能正常表达StSCI基因的染色体片段导入到其它二倍体马铃薯材料中，通过杂交产生具有自交亲和性的二倍体马铃薯后代和二倍体马铃薯实生种子。
[0077] 本发明另一方面提供一种二倍体马铃薯的育种方法，包含编码所述的StSCI蛋白的核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或所述的在植物中表达目的基因的方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物加倍变成四倍体后与其他四倍体马铃薯植物进行杂交后再降倍变成二倍体马铃薯植物。
[0078] 本发明另一方面提供一种四倍体马铃薯的育种方法，包含编码所述的StSCI蛋白的核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或所述的在植物中表达目的基因的方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物加倍变成四倍体后与其他四倍体马铃薯植物进行杂交。
[0079] 本发明另一方面提供产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的二倍体马铃薯的育种方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的四倍体马铃薯的育种方法获得的四倍体马铃薯植物制备的食品。
[0080] 进一步，所述食品包括：新鲜的马铃薯、干燥的马铃薯、冷冻的马铃薯、薯条、薯片、马铃薯面粉或马铃薯淀粉。
[0081] 本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：相对于传统的解决马铃薯自交不亲和的方法，本发明具有如下优点：
[0082] (1)本发明提供了一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白，StSCI蛋白可以解除多种S-RNase的细胞毒性作用，克服了二倍体马铃薯自交不亲和的缺陷，实现二倍体马铃薯实生种子育种；
[0083] (2)本发明提供一种包含所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述的启动子的载体，对自交不亲和的基因进行定性编辑，激活StSCI基因，使二倍体马铃薯中StSCI基因正常表达StSCI蛋白，克服二倍体马铃薯的自交不亲和性；
[0084] (3)本发明提供了一种二倍体马铃薯的育种方法，利用二倍体马铃薯材料RH89-039-16进行自交，通过自交产生具有自交亲和性的二倍体马铃薯后代和二倍体马铃薯实生种子，自交亲和性具有遗传性，从根本上解决马铃薯自交不亲和的障碍；
[0085] (4)本发明提供了一种二倍体马铃薯的育种方法，利用二倍体马铃薯RH89-039-16作为StSCI基因的供体材料，与现有的二倍体马铃薯栽培种遗传背景类似，杂交后代不会产生不良性状。附图说明
[0087] 图2所示为实施例2中二倍体马铃薯材料的自交亲和表型鉴定图，其中A为互补表达StSCI基因的二倍体马铃薯材料S15-65，B为过表达StSCI基因的二倍体马铃薯材料PI 225689；
[0088] 图3所示为自交亲和材料RH89-039-16敲除StSCI基因后的自交亲和表型鉴定图。
具体实施方式
[0089] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0090] 下述实施例中，二倍体马铃薯材料RH89-039-16是自交亲和的，二倍体马铃薯材料PI 225689、S15-65是自交不亲和的。
[0091] 下述实施例中无特殊说明的操作手法均为本领域技术人员常用的现有技术，在此不做过多解释。
[0092] 实施例一 StSCI基因定位
[0093] 利用二倍体马铃薯材料RH89-039-16的花粉对原本自交不亲和的二倍体材料PI 225689进行授粉，收获种子作为F1代。对F1代植株的自交亲和性状进行调查发现自交亲和与自交不亲和的植株各占一半，说明RH89-039-16中的自交亲和基因处于杂合状态，而RH89-039-16表现出自交亲和性状，说明控制RH89-039-16的自交亲和的基因是显性的，把这个显性基因命名StSCI基因。从F1代中分别选取40株自交亲和的单株和40株自交不亲和的单株的叶片进行混合后提取基因组DNA，并对两组混池基因组DNA进行测序。
[0094] 对测序结果进行分析，利用两个池SNP-index的差值，将StSCI基因初步定位于12号染色体的末端一段2.5Mb的区间内，获得了StSCI基因的初定位区间(图1)。
[0095] 对自交亲和的二倍体马铃薯材料RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯材料PI 225689进行基因组重测序，根据RH89-039-16和PI 225689在StSCI基因初定位区间内的基因组序列信息开发用于StSCI基因定位的分子标记，由于StSCI基因在RH89-039-16中处于杂合状态，在PI 225689中纯合隐性状态，因此待开发的与StSCI基因连锁的分子标记在RH89-039-16中应该也是处于杂合状态，在PI 225689中处于纯合状态，按照这个原则开发初定位区间内的分子标记，以F1群体单株作为定位群体，对StSCI基因进行精细定位，最终把StSCI基因定位在一个76Kb的区间内，该区间内共有6个注释基因，利用这6个注释基因的序列信息，设计了6对分别用于检测这6个注释基因表达水平的定量引物，同时提取RH89-039-16和PI 225689的花粉部位的植物总RNA，利用实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)，检测注释基因在花粉中的表达水平，其中有三个基因在RH89-039-16的花粉中高表达，这三个在RH89-039-16的花粉中高表达的基因中，编码为PGSC0003DMG400016861的基因在PI
225689的花粉中完全没有表达，这个基因可能就是造成RH89-039-16自交亲和而PI 225689自交不亲和的原因，是StSCI基因的候选基因。
225689的花粉中完全没有表达，这个基因可能就是造成RH89-039-16自交亲和而PI 225689自交不亲和的原因，是StSCI基因的候选基因。
[0096] 依据PGSC0003DMG400016861基因在DM基因组中的注释序列信息，设计了用于扩增包含基因以及启动子区域的引物对(如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)，分别使用RH89-039-16和IP65C的基因组DNA作为模板，PCR扩增后进行PCR产物的序列测定，发现在该基因启动子区域，RH89-039-16相比较于PI 225689有一段538bp的插入序列，这段插入序列位于起始密码子上游100bp处，并且插入序列内含有一个注释的启动子核心元件，这段序列是造成该基因在RH89-039-16中表达而在PI 225689中不表达的原因。
[0097] 所述的StSCI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示
[0098] 上述的插入序列为所述的调节StSCI基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0099] 实施例二 StSCI基因验证
[0100] 为了验证PGSC0003DMG400016861基因就是造成RH89-039-16中的自交亲和诱导基因，以pCAMBIA1301为骨架载体，构建了包含RH89-039-16中PGSC0003DMG400016861基因起始密码子上游的1245bp的启动子区域和3352bp的基因全长区域在内的植物双元载体，借助于农杆菌转化系统，把RH89-039-16中的PGSC0003DMG400016861基因连同其启动子转入到原本自交不亲和的二倍体马铃薯材料S15-65中，获得互补转基因植株。同时构建了以CaMV35S为启动子连接PGSC0003DMG400016861基因编码区的过表达载体，采用同样的方法转入到自交不亲和材料PI 225689中。
[0101] 同时，采用CRISP/Cas9技术，构建了包含4个靶标位置的PGSC0003DMG400016861基因的基因敲除载体，在自交亲和的RH89-039-16材料中敲除PGSC0003DMG400016861基因。图2的结果发现：在自交不亲和材料S15-65中互补表达或者过表达PGSC0003DMG400016861基因，均能使自交不亲和材料S15-65和PI 225689变为自交亲和的，分别如图2中A和B所示。而在自交亲和材料RH89-039-16中敲除PGSC0003DMG400016861基因后，原本自交亲和的RH89-
039-16变为自交不亲和(如图3所示)，说明PGSC0003DMG400016861基因是造成RH89-039-16自交亲和的StSCI基因。
039-16变为自交不亲和(如图3所示)，说明PGSC0003DMG400016861基因是造成RH89-039-16自交亲和的StSCI基因。
[0102] 实施例三 一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法
[0103] 采用农杆菌LBA440，将携带有所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)和所述启动子(SEQ ID NO.3)的pCAMBIA1301载体转入经鉴定为自交不亲和的二倍体马铃薯中。结果发现，上述pCAMBIA1301载体的导入使二倍体马铃薯中的StSCI基因表达StSCI蛋白，进而使自交不亲和的二倍体马铃薯转变为自交亲和。
[0104] 实施例四 一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法
[0105] 采用农杆菌LBA440，将携带有所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)和CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体转入经鉴定为自交不亲和的二倍体马铃薯中。结果发现，上述pCAMBIA1301载体的导入使二倍体马铃薯中的StSCI基因表达StSCI蛋白，进而使自交不亲和的二倍体马铃薯转变为自交亲和。
[0106] 实施例五 一种二倍体马铃薯的自交育种方法
[0107] 花粉中能够表达StSCI基因的二倍体马铃薯材料，例如RH89-039-16均是自交亲和的，因此在RH89-039-16进入盛花期后，挑取RH89-039-16雄蕊中的花粉抹在RH89-039-16雌蕊的柱头上进行自交授粉，由于RH89-039-16是自交亲和的，因此自交授粉后RH89-039-16可以产生种子，获得了RH89-039-16的二倍体马铃薯实生种子。
[0108] 实施例六 一种二倍体马铃薯的杂交育种方法
[0109] 花粉中能够表达StSCI基因的二倍体马铃薯材料，例如RH89-039-16均是自交亲和的，而多数的二倍体马铃薯材料例如PI 225689是自交不亲和的，在上述的RH89-039-16和PI 225689材料进入盛花期后，挑取RH89-039-16雄蕊中的花粉，抹在PI 225689的柱头上进行杂交授粉，利用基因组重组，产生的种子中有一半是能够表达StSCI基因的，因此是自交亲和的，通过杂交获得了自交亲和的二倍体马铃薯材料。
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