一种5-氮杂吲哚衍生物Bruton′s酪氨酸激酶抑制剂及其制备方法与用途
阅读：2发布：2020-07-24
专利汇可以提供一种5-氮杂吲哚衍生物Bruton′s酪氨酸激酶抑制剂及其制备方法与用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种Bruton's酪 氨 酸激酶 抑制剂 ，该抑制剂是一类含有5-氮杂吲哚结构的化合物，包括式(I)和式(II)所示的化合物及其立体异构体、 水 合物、 溶剂 化物、药学上可接受的盐，同时公开了该类化合物的制备方法和使用这些新型化合物 治疗 或者 预防 Bruton's酪氨酸激酶相关 疾病 如急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、大肠癌、类 风 湿关节炎、抗器官移植排异、抗 牛 皮癣、红斑狼疮等。，下面是一种5-氮杂吲哚衍生物Bruton′s酪氨酸激酶抑制剂及其制备方法与用途专利的具体信息内容。
1.一种具有结构通式(I)和通式(II)的5-氮杂吲哚化合物及其立体异构体、水合物、溶剂化物、药学上可接受的盐
其中： 可为如下结构：
可为如下结构：
1
R可以为如下结构：
其中R2，R3和R4各自可以为H，C1-12烷基，C1-12杂烷基，C1-12杂环烷基，C1-12烯基，C1-12炔基，C1-12环烷基；
L选自O，S，CO，NH，CONH或者CH2；
Ar选自取代或者未被取代的5～6元芳环或杂芳环，所述杂芳基中包含0-3个杂原子N、S或O，所述取代基为C1-12烷基，C1-12杂烷基，C1-12杂环烷基，C1-12烯基，C1-12炔基，C1-12环烷基，羟基，氨基，氰基，硝基，异氰基，卤素，三氟甲基。
2.根据权利要求1所述的5-氮杂吲哚Bruton's酪氨酸激酶抑制剂及药学上可接受的盐，其特征在于，所述结构通式(I)和通式(II)的化合物包括编号101-115的一种
3.一种制备权利要求1或者2所述的5-氮杂吲哚衍生物Bruton's酪氨酸激酶抑制剂及药学上可接受的盐的方法。其特征在于包括如下步骤：起始原料1经NBS溴代得到中间体2，然后转化为相应的甲苯磺酸酯衍生物3，再利用Suzuki偶联反应得到中间体4，该反应适用于多种芳基代硼酸衍生物。中间体4随后去保护，所得衍生物5可以与多种单环、双环化合物发生亲电取代，酰化，最后用氨处理可以得到相应的通式(I)和通式(II)所示的化合物
4.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或者2所述的5-氮杂吲哚衍生物
Bruton's酪氨酸激酶抑制剂及药学上可接受的盐，以及药学上可接受载体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊、颗粒剂、喷雾剂或者注射剂的形式。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自填充剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂中的一种或多种。
7.权利要求1和或者2所述的5-氮杂吲哚衍生物Bruton's酪氨酸激酶抑制剂及药学上可接受的盐作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂为Bruton's酪氨酸激酶抑制剂。
9.权利要求1和或者2所述的5-氮杂吲哚衍生物Bruton's酪氨酸激酶抑制剂及药学上可接受的盐或者权利要求4至6中任一项所述的药物组合物在治疗或者预防Bruton's酪氨酸激酶相关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述Bruton's酪氨酸激酶相关疾病选自下组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、大肠癌、类风湿关节炎、抗器官移植排异、抗牛皮癣、红斑狼疮等。
一种5-氮杂吲哚衍生物Bruton′s酪氨酸激酶抑制剂及其制备
方法与用途
技术领域
[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种5-氮杂吲哚衍生物Bruton's酪氨酸 激酶抑制剂及其制备方法与用途。
背景技术
[0002] 免疫细胞通常可以分为T细胞与B细胞两类，其中B细胞的主要职能是 分泌各种抗体帮助人体抵御各种外敌的侵入。Bruton's酪氨酸激酶(布鲁顿酪氨 酸激酶)主要在B细胞中表达，分布于淋巴系统、造血及血液系统。近年来有关 B细胞特别是针对B细胞非霍奇金性淋巴癌和类风湿关节炎的研究发现，Bruton's 酪氨酸激酶往往会出现异常表达。Bruton's酪氨酸激酶是B细胞抗原受体(BCR) 信号通路中的关键激酶，能够调节正常B细胞的成熟、分化，也与多种B细胞 淋巴组织失调疾病密切相关。
[0003] Bruton's酪氨酸激酶是非受体蛋白酪氨酸激酶Tec家族的成员。Tec家族 是人类非受体激酶中仅次于Src家族的第2大家族，其主要成员包括Bruton's酪 氨酸激酶、BMX(etk)、ITK、TEC和TXK(PLK)。Bruton's酪氨酸激酶在1993 年被确定为人X-连锁无丙种球蛋白血症(X-linked agammaglobulinemia，XLA) 中的缺陷蛋白。这种蛋白在B细胞各个发展阶段均有表达(除了最终分化的浆细 胞)，在前B淋巴细胞过渡为后期B细胞过程中，Bruton's酪氨酸激酶为细胞分 化和增值所必需基因，且在B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)和浆细 胞瘤中均有表达。此外，在骨髓细胞和红系祖细胞中也有少量表达。
[0004] Bruton's酪氨酸激酶小分子抑制剂对于治疗血液恶性肿瘤和自身免疫失调 疾病具有良好前景。依鲁替尼(ibrutinib)是当前最引人注目的Bruton's酪氨酸 激酶靶向抑制剂，在临床前和临床研究中对多种B细胞肿瘤以及自身免疫疾病 均有显著的治疗效果，已被美国FDA批准上市，用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL) 和CLL。
[0005] 虽然依鲁替尼治疗效果显著，但是临床上的B细胞淋巴瘤患者除了一部 分患者在后期产生抗药耐受外，还有相当一部分患者对其治疗不敏感，比如在 MCL中约有1/3患者对其治疗无应答，DLBCL中的应答率也不高，鉴于以上问 题，本领域仍然需要开发活性高、特异性强的Bruton's酪氨酸激酶抑制剂。
发明内容
[0006] 为解决上述问题，
[0007] 本发明提供了式(I)所示含有5-氮杂吲哚结构的化合物、或其立体异构 体、或其药学上可接受的盐，其可作为一种Bruton's酪氨酸激酶抑制剂，
[0008]
[0009] 其中： 可为如下结构：
[0010]
[0011] 可为如下结构：
[0012]
[0013] R1可以为如下结构：
[0014]
[0015] 其中R2，R3和R4各自可以为H，C1-12烷基，C1-12杂烷基，C1-12杂环烷 基，C1-12烯基，C1-12炔基，C1-12环烷基中任意一种；
[0016] L选自O，S，CO，NH，CONH或者CH2；
[0017] Ar选自取代或者未被取代的5～6元芳环或杂芳环，所述杂芳基中包含0-3 个杂原子N、S或O，所述取代基为C1-12烷基，C1-12杂烷基，C1-12杂环烷基， C1-12烯基，C1-12炔基，C1-12环烷基，羟基，氨基，氰基，硝基，异氰基，卤素， 三氟甲基；
[0018] 优选地，所述化合物包括具有如表1结构的化合物：
[0019] 表1结构通式(I)和通式(II)的化合物包括编号101-115的一种
[0020] 本发明提供了上述5-氮杂吲哚衍生物Bruton′s酪氨酸激酶抑制剂的制备 方法，如Scheme 1所示，该方法包括以下步骤：起始原料1经NBS溴代得到中 间体2，然后转化为相应的甲苯磺酸酯衍生物3，再利用Suzuki偶联反应得到中 间体4，该反应适用于多种芳基代硼酸衍生物。中间体4随后去保护，所得衍生 物5可以与多种单环、双环化合物发生亲电取代，酰化，最后用氨处理可以得到 相应的通式(I)和通式(II)所示的化合物。
[0021] Scheme 1通式(I)化合物的合成与制备：
[0022] 本发明提供了所述的5-氮杂吲哚衍生物及药学上可接受的盐，以及药学 上可接受载体在制备抗肿瘤药物、Bruton's酪氨酸激酶抑制剂中的用途。
[0023] 所述药物组合物为片剂、胶囊、颗粒剂、喷雾剂或者注射剂的形式。
[0024] 所述药学上可接受的载体选自填充剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂中的一种 或多种。包括但不限于任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、吸收延迟剂等，这 样的介质和药剂用于药学活性物质在本领域中的应用。
[0025] 本发明还提供了所述的5-氮杂吲哚衍生物Bruton's酪氨酸激酶抑制剂及 药学上可接受的盐作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂的用途。
[0026] 进一步地，所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂为Bruton's酪氨酸激酶抑制剂。
[0027] 5-氮杂吲哚衍生物Bruton's酪氨酸激酶抑制剂及药学上可接受的盐或者其 药物组合物在制备用于治疗或者预防Bruton's酪氨酸激酶相关疾病的药物中的 用途。
[0028] 进一步地，所述Bruton's酪氨酸激酶相关疾病选自下组：急性淋巴细胞白 血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、大肠癌、类 风湿关节炎、抗器官移植排异、抗牛皮癣、红斑狼疮等。
[0030] 以下通过实施形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的 详细说明。但不应将此理解发本发明上述主题的范围仅于以下的实例。凡基于发 明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
[0031] 以下通过具体的实施例进一步说明本发明。
[0032] 制备具有通式(I)和通式(II)所示化合物的方法包括：起始原料1经 NBS溴代得到中间体2，然后转化为相应的甲苯磺酸酯衍生物3，再利用Suzuki 偶联反应得到中间体4，该反应适用于多种芳基代硼酸衍生物。中间体4随后去 保护，所得衍生物5可以与多种单环、双环化合物发生亲电取代，酰化，最后用 氨处理可以得到相应的通式(I)和通式(II)所示的化合物。值得说明的是，通 式(I)和通式(II)所示化合物包括但不限于下述列举的化合物。
[0034]
[0035] 中间体3-溴-4-氯-5-氮杂吲哚2的制备：
[0036]
[0037] 将起始原料1(1.48g，9.72mmol)溶于50mL二氯甲烷中，用冰水浴将 其冷却至0℃，然后分批加入N-溴琥珀酰亚胺(1.82g，10.2mmol)，半小时后 除去冰浴，继续搅拌另外半小时。滤出所需的溴化物并抽真空干燥，获得目标化 合物1.53g，收率：68％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.00(d,1H),7.80(s,1H), 7.48(d,1H).LC/MS(ESI)：m/z 231(M+H)+。
[0038] 3-溴-4-氯-1-甲苯磺酰基-5-氮杂吲哚(中间体3)的制备：
[0039]
[0040] 将碳酸钾(3.66g，26.5mmol)和中间体2(1.53g，6.62mmol)溶于35mL DMF中，然后先加入一部分p-Ts Cl(1.33g，6.95mmol)，在室温下进行搅拌。 3h后，加入另一份p-Ts Cl(1.33g，6.95mmol)，继续搅拌半小时。待反应结束 后，真空浓缩反应，然后加入水和乙酸乙酯进行洗涤、萃取，浓缩有机层，沉 淀出产物为白色固体1.98g，收率：78％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.40 (s,1H),8.30(d,1H),8.04(d,1H),8.03(d,2H),7.47(d,2H),2.37(s,3H). LC/MS(ESI)：m/z 385(M+H)+。
[0041] 4-氯-3-(4-苯氧基苯基)-5-氮杂吲哚(中间体5a)的制备：
[0042]
[0043] 将溴化物中间体3(553mg，1.44mmol)、Pd(PPh3)4(164mg，0.14mmol)、 2M K2CO3(2.14mL，4.28mmol)、4-苯氧基苯基代硼酸(399mg，1.86mmol) 溶于甲苯(25mL)与乙醇(5mL)的混合溶剂中，在85℃下搅拌反应6小时。 反应结束后用乙酸乙酯进行萃取、干燥有机相、过滤浓缩后用硅胶柱层析进行分 离，得到中间体4a直接进行下一步处理。向中间体4a中加入甲醇10mL，2M NaOH溶液6mL，将反应瓶在油浴中70℃加热。40分钟后，加入二氯甲烷和饱 和碳酸氢钠水溶液，进行洗涤、萃取。将有机层干燥浓缩，经过硅胶柱层析得到 目+
标化合物97mg，产率21％。LC/MS(ESI)：m/z 321(M+H) 。
标化合物97mg，产率21％。LC/MS(ESI)：m/z 321(M+H) 。
[0044] 1-(2-氮杂环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氯-5-氮杂吲哚(中间体6a)制备：
[0045]
[0046] 在室温下，向中间体5a(58mg，0.18mmol)的无水DMF溶液(1.5mL) 中加入NaH(60％矿物油分散体；140mg，3.50mmol)，搅拌10分钟后，加入 2-氮杂环戊基溴(27mg，0.18mmol)，反应搅拌过夜。反应结束后，用乙酸乙酯 萃取，用盐水洗涤，将有机层干燥、过滤、浓缩后，经硅胶柱层析分离提纯，得 到目标化合物6a 53mg，收率：76％。LC/MS(ESI)：m/z 390(M+H)+。
[0047] 1-(2-氮杂环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(中间体7a)制备：
[0048]
[0049] 在氮气保护下，向BINAP(12.5mg，0.02mmol)、叔丁醇钠(36mg，0.38 mmol)、二苯甲酮亚胺(49mg，0.27mmol)和中间体6a(52mg，0.13mmol) 的无水甲苯(5mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6mg，0.007mmol)， 将混合物加热至110℃保持90min。将反应混合物冷却，然后借助乙酸乙酯通过 硅藻土，然后浓缩。将残余物溶于甲醇(8mL)，然后加入盐酸羟胺(183mg， 2.63mmol)的水(2mL)溶液中，继而加入碳酸氢钠(221mg，2.63mmol)，将 混合物搅拌3小时。在真空中除去有机层，然后加入乙酸乙酯和盐水。水层用乙 酸乙酯反萃取，合并有机层进行干燥、过滤、浓缩，所得粗产物不用提纯直接投 下一步。
[0050] 1-(2-丙烯酰胺基环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(化合物101) 的制备：
[0051]
[0052] 将上一步粗产物7a溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL， 1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC 检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水 洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物101为白色固体15mg，两步收率：27％。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27-7.18(m,3H),7.06 (d,2H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.65-5.58(m,2H),3.50(m,2H), 2.15-1.84(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 425(M+H)+。
[0053] 实施例2：1-(3-丙烯酰胺基环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚 (化合物102)的制备
[0054]
[0055] 1-(3-氮杂环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氯-5-氮杂吲哚(中间体6b)制备：
[0056]
[0057] 在室温下，向中间体5a(58mg，0.18mmol)的无水DMF溶液(1.5mL) 中加入NaH(60％矿物油分散体；140mg，3.50mmol)，搅拌10分钟后，加入3-氮杂环戊基溴(27mg，0.18mmol)，反应搅拌过夜。反应结束后，用乙酸乙酯 萃取，用盐水洗涤，将有机层干燥、过滤、浓缩后，经硅胶柱层析分离提纯，得 到目标化合物6b 53mg，收率：76％。LC/MS(ESI)：m/z 390(M+H)+。
[0058] 1-(3-氮杂环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(中间体7b)制备：
[0059]
[0060] 在氮气保护下，向BINAP(12.5mg，0.02mmol)、叔丁醇钠(36mg，0.38 mmol)、二苯甲酮亚胺(49mg，0.27mmol)和中间体6b(52mg，0.13mmol) 的无水甲苯(5mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6mg，0.007mmol)， 将混合物加热至110℃保持90min。将反应混合物冷却，然后借助乙酸乙酯通过 硅藻土，然后浓缩。将残余物溶于甲醇(8mL)，然后加入盐酸羟胺(183mg， 2.63mmol)的水(2mL)溶液中，继而加入碳酸氢钠(221mg，2.63mmol)，将 混合物搅拌3小时。在真空中除去有机层，然后加入乙酸乙酯和盐水。水层用乙 酸乙酯反萃取，合并有机层进行干燥、过滤、浓缩，所得粗产物不用提纯直接投 下一步。
[0061] 1-(3-丙烯酰胺基环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(化合物102) 的制备：
[0062]
[0063] 将上一步粗产物7b溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL， 1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC 检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水 洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物102为白色固体18mg，两步收率：32％。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27-7.18(m,3H),7.06 (d,2H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.58(m,1H),3.99(m,1H),3.81- 3.50(m,4H),
2.15-1.90(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 425(M+H)+。
2.15-1.90(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 425(M+H)+。
[0064] 实施例3：1-(3-丁炔酰胺基环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚 (化合物103)的制备
[0065]
[0066] 1-(3-丁炔酰胺基环戊基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(化合物103) 的制备：
[0067]
[0068] 将上一步粗产物7b(48mg，0.13mmol)溶解在5mL四氢呋喃溶液中， 加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丁炔酰氯(15μL，0.21mmol)，搅 拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用 50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥， 浓缩，粗产品通过快速柱分离得到目标化合物103为白色固体17mg，两步收率：
30％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27 (d,2H),7.18(m,1H),7.06(d,2H),6.73-6.71(m,2H),6.39(s,2H),3.99(m,1H),3.81- 3.56(m,2H),+
3.50-3.40(m,2H),2.15-1.90(m,2H),1.80(s,3H).LC/MS(ESI)：m/z 437(M+H) 。
30％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27 (d,2H),7.18(m,1H),7.06(d,2H),6.73-6.71(m,2H),6.39(s,2H),3.99(m,1H),3.81- 3.56(m,2H),+
3.50-3.40(m,2H),2.15-1.90(m,2H),1.80(s,3H).LC/MS(ESI)：m/z 437(M+H) 。
[0069] 实施例4：1-(3-丙烯酰胺基环己基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚 (化合物104)的制备
[0070]
[0071] 1-(3-氮杂环己基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氯-5-氮杂吲哚(中间体6c)制备：
[0072]
[0073] 在室温下，向中间体5a(58mg，0.18mmol)的无水DMF溶液(1.5mL) 中加入NaH(60％矿物油分散体；140mg，3.50mmol)，搅拌10分钟后，加入 3-氮杂环己基溴(29mg，0.18mmol)，反应搅拌过夜。反应结束后，用乙酸乙酯 萃取，用盐水洗涤，将有机层干燥、过滤、浓缩后，经硅胶柱层析分离提纯，得 到目标化合物6c 58mg，收率：80％。LC/MS(ESI)：m/z 404(M+H+) 。
[0074] 1-(3-氮杂环己基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(中间体7c)制备：
[0075]
[0076] 在氮气保护下，向BINAP(12.5mg，0.02mmol)、叔丁醇钠(36mg，0.38 mmol)、二苯甲酮亚胺(49mg，0.27mmol)和中间体6c(52mg，0.13mmol) 的无水甲苯(5mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6mg，0.007mmol)， 将混合物加热至110℃保持90min。将反应混合物冷却，然后借助乙酸乙酯通过 硅藻土，然后浓缩。将残余物溶于甲醇(8mL)，然后加入盐酸羟胺(183mg， 2.63mmol)的水(2mL)溶液中，继而加入碳酸氢钠(221mg，2.63mmol)，将 混合物搅拌3小时。在真空中除去有机层，然后加入乙酸乙酯和盐水。水层用乙 酸乙酯反萃取，合并有机层进行干燥、过滤、浓缩，所得粗产物不用提纯直接投 下一步。
[0077] 1-(3-丙烯酰胺基环己基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(化合物104) 的制备：
[0078]
[0079] 将上一步粗产物7c溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL， 1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC 检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水 洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物104为白色固体15mg，两步收率：27％。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27-7.18(m,3H),7.06 (d,2H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.58(m,1H),3.85-3.75(m,3H), 3.56-3.50(m,2H),1.91-1.66(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 439(M+H)+。
[0080] 实施例5：1-(3-丁炔酰胺基环己基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚 (化合物105)的制备
[0081]
[0082] 1-(3-丁炔酰胺基环己基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(化合物105) 的制备：
[0083]
[0084] 将上一步粗产物7c(50mg，0.13mmol)溶解在5mL四氢呋喃溶液中， 加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丁炔酰氯(15μL，0.21mmol)，搅 拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用 50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥， 浓缩，粗产品通过快速柱分离得到目标化合物105为白色固体20mg，两步收率：
34％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27 (d,2H),7.18(m,1H),7.06(d,2H),6.73-6.71(m,2H),6.39(s,2H),3.85-3.75(m,3H), 3.56-3.50(m,
2H),1.91-1.66(m,7H).LC/MS(ESI)：m/z 451(M+H)+。
34％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27 (d,2H),7.18(m,1H),7.06(d,2H),6.73-6.71(m,2H),6.39(s,2H),3.85-3.75(m,3H), 3.56-3.50(m,
2H),1.91-1.66(m,7H).LC/MS(ESI)：m/z 451(M+H)+。
[0085] 实施例6：1-(5-丙烯酰胺基-5-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4- 氨基-5-氮杂吲哚(化合物106)的制备
[0086]
[0087] 1-(5-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氯-5-氮杂吲哚(中间体8a) 制备：
[0088]
[0089] 在室温下，向中间体5a(58mg，0.18mmol)的无水DMF溶液(1.5mL) 中加入NaH(60％矿物油分散体；140mg，3.50mmol)，搅拌10分钟后，加入 5-氮杂螺[3.4]辛烷-2-溴(34mg，0.18mmol)，反应搅拌过夜。反应结束后，用乙 酸乙酯萃取，用盐水洗涤，将有机层干燥、过滤、浓缩后，经硅胶柱层析分离提 纯，得到目标化合物8a 57mg，收率：74％。LC/MS(ESI)：m/z 430(M+H)+。
[0090] 1-(5-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(中间体 9a)制备：
[0091]
[0092] 在氮气保护下，向BINAP(12.5mg，0.02mmol)、叔丁醇钠(36mg，0.38 mmol)、二苯甲酮亚胺(49mg，0.27mmol)和中间体8a(56mg，0.13mmol) 的无水甲苯(5mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6mg，0.007mmol)， 将混合物加热至110℃保持90min。将反应混合物冷却，然后借助乙酸乙酯通过 硅藻土，然后浓缩。将残余物溶于甲醇(8mL)，然后加入盐酸羟胺(183mg， 2.63mmol)的水(2mL)溶液中，继而加入碳酸氢钠(221mg，2.63mmol)，将 混合物搅拌3小时。在真空中除去有机层，然后加入乙酸乙酯和盐水。水层用乙 酸乙酯反萃取，合并有机层进行干燥、过滤、浓缩，所得粗产物不用提纯直接投 下一步。
[0093] 1-(5-丙烯酰胺基-5-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂 吲哚(化合物106)的制备：
[0094]
[0095] 将上一步粗产物9a溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL， 1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC 检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水 洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物106为白色固体17mg，两步收率：28％。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27-7.18(m,3H),7.06 (d,2H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.28 (m,2H),2.17-
1.92(m,6H),1.67(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 465(M+H)+。
1.92(m,6H),1.67(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 465(M+H)+。
[0096] 实施例7：1-(6-丙烯酰胺基-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4- 氨基-5-氮杂吲哚(化合物107)的制备
[0097]
[0098] 1-(6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氯-5-氮杂吲哚(中间体8b) 制备：
[0099]
[0100] 在室温下，向中间体5a(58mg，0.18mmol)的无水DMF溶液(1.5mL) 中加入NaH(60％矿物油分散体；140mg，3.50mmol)，搅拌10分钟后，加入 6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-溴(34mg，0.18mmol)，反应搅拌过夜。反应结束后，用乙 酸乙酯萃取，用盐水洗涤，将有机层干燥、过滤、浓缩后，经硅胶柱层析分离提 纯，得到目标化合物8b 57mg，收率：74％。LC/MS(ESI)：m/z 430(M+H)+。
[0101] 1-(6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(中间体 9b)制备：
[0102]
[0103] 在氮气保护下，向BINAP(12.5mg，0.02mmol)、叔丁醇钠(36mg，0.38 mmol)、二苯甲酮亚胺(49mg，0.27mmol)和中间体8b(56mg，0.13mmol) 的无水甲苯(5mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6mg，0.007mmol)， 将混合物加热至110℃保持90min。将反应混合物冷却，然后借助乙酸乙酯通过 硅藻土，然后浓缩。将残余物溶于甲醇(8mL)，然后加入盐酸羟胺(183mg， 2.63mmol)的水(2mL)溶液中，继而加入碳酸氢钠(221mg，2.63mmol)，将 混合物搅拌3小时。在真空中除去有机层，然后加入乙酸乙酯和盐水。水层用乙 酸乙酯反萃取，合并有机层进行干燥、过滤、浓缩，所得粗产物不用提纯直接投 下一步。
[0104] 1-(6-丙烯酰胺基-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂 吲哚(化合物107)的制备：
[0105]
[0106] 将上一步粗产物9b溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL， 1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC 检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水 洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物107为白色固体17mg，两步收率：28％。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27-7.18(m,3H),7.06 (d,2H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.33- 3.28(m,4H),
1.89-1.64(m,6H).LC/MS(ESI)：m/z 465(M+H)+。
1.89-1.64(m,6H).LC/MS(ESI)：m/z 465(M+H)+。
[0107] 实施例8：1-(6-丙烯酰胺基-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4- 氨基-5-氮杂吲哚(化合物108)的制备
[0108]
[0109] 1-(6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氯-5-氮杂吲哚(中间体8c) 制备：
[0110]
[0111] 在室温下，向中间体5a(58mg，0.18mmol)的无水DMF溶液(1.5mL) 中加入NaH(60％矿物油分散体；140mg，3.50mmol)，搅拌10分钟后，加入 6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-溴(37mg，0.18mmol)，反应搅拌过夜。反应结束后，用乙 酸乙酯萃取，用盐水洗涤，将有机层干燥、过滤、浓缩后，经硅胶柱层析分离提 纯，得到目标化合物8c 61mg，收率：77％。LC/MS(ESI)：m/z 444(M+H)+。
[0112] 1-(6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂吲哚(中间体 9c)制备：
[0113]
[0114] 在氮气保护下，向BINAP(12.5mg，0.02mmol)、叔丁醇钠(36mg，0.38 mmol)、二苯甲酮亚胺(49mg，0.27mmol)和中间体8c(58mg，0.13mmol) 的无水甲苯(5mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6mg，0.007mmol)， 将混合物加热至110℃保持90min。将反应混合物冷却，然后借助乙酸乙酯通过 硅藻土，然后浓缩。将残余物溶于甲醇(8mL)，然后加入盐酸羟胺(183mg， 2.63mmol)的水(2mL)溶液中，继而加入碳酸氢钠(221mg，2.63mmol)，将 混合物搅拌3小时。在真空中除去有机层，然后加入乙酸乙酯和盐水。水层用乙 酸乙酯反萃取，合并有机层进行干燥、过滤、浓缩，所得粗产物不用提纯直接投 下一步。
[0115] 1-(6-丙烯酰胺基-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-5-氮杂 吲哚(化合物108)的制备：
[0116]
[0117] 将上一步粗产物9c溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL， 1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC 检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水 洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物108为白色固体17mg，两步收率：28％。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.67(d,2H),7.42(m,2H),7.27-7.18(m,3H),7.06 (d,2H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.82 (m,2H),3.27(s,2H),1.89-1.64(m,6H),1.44-1.42(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 479 (M+H)+。
[0118] 实施例9：1-(3-丙烯酰胺基环戊基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氨 基-5-氮杂吲哚(化合物109)的制备
[0119]
[0120] 4-氯-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-5-氮杂吲哚(中间体5b)的制备：
[0121]
[0122] 将溴化物中间体3(553mg，1.44mmol)、Pd(PPh3)4(164mg，0.14mmol)、 2M K2CO3(2.14mL，4.28mmol)、4-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺]硼酸(448mg， 1.86mmol)溶于甲苯(25mL)与乙醇(5mL)的混合溶剂中，在85℃下搅拌 反应6小时。反应结束后用乙酸乙酯进行萃取、干燥有机相、过滤浓缩后用硅胶 柱层析进行分离，得到中间体4b直接进行下一步处理。向中间体4b中加入甲醇 10mL，2M NaOH溶液6mL，将反应瓶在油浴中70℃加热。40分钟后，加入 二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液，进行洗涤、萃取。将有机层干燥浓缩，经过硅 胶+柱层析得到目标化合物105mg，产率21％。LC/MS(ESI)：m/z 349(M+H) 。
[0123] 1-(3-氮杂环戊基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氯-5-氮杂吲哚(中间 体6d)制备：
[0124]
[0125] 在室温下，向中间体5b(62mg，0.18mmol)的无水DMF溶液(1.5mL) 中加入NaH(60％矿物油分散体；140mg，3.50mmol)，搅拌10分钟后，加入 3-氮杂环戊基溴(27mg，0.18mmol)，反应搅拌过夜。反应结束后，用乙酸乙酯 萃取，用盐水洗涤，将有机层干燥、过滤、浓缩后，经硅胶柱层析分离提纯，得 到目标化合物6d 57mg，收率：76％。LC/MS(ESI)：m/z 418(M+H)+。
[0126] 1-(3-氮杂环戊基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氨基-5-氮杂吲哚(中 间体7d)制备：
[0127]
[0128] 在氮气保护下，向BINAP(12.5mg，0.02mmol)、叔丁醇钠(36mg，0.38 mmol)、二苯甲酮亚胺(49mg，0.27mmol)和中间体6d(54mg，0.13mmol) 的无水甲苯(5mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6mg，0.007mmol)， 将混合物加热至110℃保持90min。将反应混合物冷却，然后借助乙酸乙酯通过 硅藻土，然后浓缩。将残余物溶于甲醇(8mL)，然后加入盐酸羟胺(183mg， 2.63mmol)的水(2mL)溶液中，继而加入碳酸氢钠(221mg，2.63mmol)，将 混合物搅拌3小时。在真空中除去有机层，然后加入乙酸乙酯和盐水。水层用乙 酸乙酯反萃取，合并有机层进行干燥、过滤、浓缩，所得粗产物不用提纯直接投 下一步。
[0129] 1-(3-丙烯酰胺基环戊基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氨基-5-氮杂 吲哚(化合物109)的制备：
[0130]
[0131] 将上一步粗产物7d溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL， 1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC 检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水 洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，1
粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物109为白色固体16mg，两步收率：27％。H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),8.06-8.04(m,3H),7.92-7.82(m,3H),7.60(m,1H), 7.27(d,
1H),7.19(m,1H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.58(m,1H), 3.99(m,1H),
3.81-3.50(m,4H),2.15-1.90(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 453(M+H)+。
粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物109为白色固体16mg，两步收率：27％。H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),8.06-8.04(m,3H),7.92-7.82(m,3H),7.60(m,1H), 7.27(d,
1H),7.19(m,1H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.58(m,1H), 3.99(m,1H),
3.81-3.50(m,4H),2.15-1.90(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 453(M+H)+。
[0132] 实施例10：1-(3-丁炔酰胺基环戊基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4- 氨基-5-氮杂吲哚(化合物110)的制备
[0133]
[0134] 1-(3-丁炔酰胺基环戊基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氨基-5-氮杂 吲哚(化合物110)的制备：
[0135]
[0136] 将上一步粗产物7d(52mg，0.13mmol)溶解在5mL四氢呋喃溶液中， 加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丁炔酰氯(15μL，0.21mmol)，搅 拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用 50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥， 浓缩，粗产品通过快速柱分离得到目标化合物110为白色固体16mg，两步收率：
27％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),8.06-8.04(m,3H),7.92(d,1H), 7.82(d,
2H),7.60(m,1H),7.27(d,1H),7.19(m,1H),6.73-6.71(m,2H),6.39(s,2H), 3.99(m,1H),
3.81-3.50(m,4H),2.15-1.90(m,2H),1.81(s,3H).LC/MS(ESI)：m/z 465(M+H)+。
27％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),8.06-8.04(m,3H),7.92(d,1H), 7.82(d,
2H),7.60(m,1H),7.27(d,1H),7.19(m,1H),6.73-6.71(m,2H),6.39(s,2H), 3.99(m,1H),
3.81-3.50(m,4H),2.15-1.90(m,2H),1.81(s,3H).LC/MS(ESI)：m/z 465(M+H)+。
[0137] 实施例11：1-(3-丙烯酰胺基环己基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氨 基-5-氮杂吲哚(化合物111)的制备
[0138]
[0139] 1-(3-氮杂环己基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氯-5-氮杂吲哚(中间 体6e)制备：
[0140]
[0141] 在室温下，向中间体5b(62mg，0.18mmol)的无水DMF溶液(1.5mL) 中加入NaH(60％矿物油分散体；140mg，3.50mmol)，搅拌10分钟后，加入 3-氮杂环己基溴(27mg，0.18mmol)，反应搅拌过夜。反应结束后，用乙酸乙酯 萃取，用盐水洗涤，将有机层干燥、过滤、浓缩后，经硅胶柱层析分离提纯，得 到目标化合物6e 59mg，收率：76％。LC/MS(ESI)：m/z 432(M+H)+。
[0142] 1-(3-氮杂环戊基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氨基-5-氮杂吲哚(中 间体7e)制备：
[0143]
[0144] 在氮气保护下，向BINAP(12.5mg，0.02mmol)、叔丁醇钠(36mg，0.38 mmol)、二苯甲酮亚胺(49mg，0.27mmol)和中间体6e(56mg，0.13mmol) 的无水甲苯(5mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6mg，0.007mmol)， 将混合物加热至110℃保持90min。将反应混合物冷却，然后借助乙酸乙酯通过 硅藻土，然后浓缩。将残余物溶于甲醇(8mL)，然后加入盐酸羟胺(183mg， 2.63mmol)的水(2mL)溶液中，继而加入碳酸氢钠(221mg，2.63mmol)，将 混合物搅拌3小时。在真空中除去有机层，然后加入乙酸乙酯和盐水。水层用乙 酸乙酯反萃取，合并有机层进行干燥、过滤、浓缩，所得粗产物不用提纯直接投 下一步。
[0145] 1-(3-丙烯酰胺基环己基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氨基-5-氮杂 吲哚(化合物111)的制备：
[0146]
[0147] 将上一步粗产物7e溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL， 1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC 检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水 洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速 柱分离得到目标化合物111为白色固体16mg，两步收率：27％。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),8.06-8.04(m,3H),7.92(d,1H),7.82(d,2H),7.60 (m,1H),7.27(d,1H),7.19(m,1H),6.73-6.62(m,3H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),5.58 (m,1H),3.85-
3.75(m,3H),3.56-3.50(m,2H),1.91-1.66(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 467(M+H)+。
3.75(m,3H),3.56-3.50(m,2H),1.91-1.66(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 467(M+H)+。
[0148] 实施例12：1-(3-丁炔酰胺基环己基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4- 氨基-5-氮杂吲哚(化合物112)的制备
[0149]
[0150] 1-(3-丁炔酰胺基环己基)-3-[N-(吡啶-2-基)-苯甲酰胺-4-基]-4-氨基-5-氮杂 吲哚(化合物112)的制备：
[0151]
[0152] 将上一步粗产物7e(54mg，0.13mmol)溶解在5mL四氢呋喃溶液中， 加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丁炔酰氯(15μL，0.21mmol)，搅 拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用 50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥， 浓缩，粗产品通过快速柱分离得到目标化合物112为白色固体13mg，两步收率：
1
21％。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),8.06-8.04(m,3H),7.92(d,1H), 7.82(d,
2H),7.60(m,1H),7.27(d,1H),7.19(m,1H),6.73-6.71(m,2H),6.39(s,2H), 3.85-3.75(m,
3H),3.56-3.50(m,2H),1.91-1.66(m,7H).LC/MS(ESI)：m/z 479 (M+H)+。
1
21％。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),8.06-8.04(m,3H),7.92(d,1H), 7.82(d,
2H),7.60(m,1H),7.27(d,1H),7.19(m,1H),6.73-6.71(m,2H),6.39(s,2H), 3.85-3.75(m,
3H),3.56-3.50(m,2H),1.91-1.66(m,7H).LC/MS(ESI)：m/z 479 (M+H)+。
[0153] 实施例13：对激酶BTK、BTK(R28H)的体外活性抑制作用
[0154] 1.1BTK抑制活性筛选
[0155] 用激酶缓冲液(50mM HEPES、10mM MgCl2、2mM DTT、1mM EGTA、 0.01％Tween 20)将350ng/uL的BTK母液进行稀释，按每孔加入6μL 1.67×的 0.134ng/μL的工作液(终浓度为0.08ng/μL)，用纳升加样仪将DMSO溶解的不 同化合物101-112加入到孔中，使化合物终浓度为1000nM-0.244nM，阳性药终 浓度为50nM-0.0122nM，4倍梯度，共7个浓度，同时设空白对照孔(不含酶) 与阴性对照孔(含酶，加溶媒DMSO)，设2个复孔。酶与化合物或溶媒反应30 min后，将用激酶缓冲液配制好的5×的250μM ATP(终浓度为50uM)与5× 的0.5μM底物(终浓度为0.1μM，ULight-poly GT)，按1:1混合，按每孔4μL 加入孔中；封板膜封板以后，室温反应2h后，每孔加入5μL 4×的8nM检测 试剂(终浓度为2nM，Ab)，室温孵育1小时；PE仪器读板(激发620nm，发 射665nm)。计算抑制率，并计算IC50值。测定结果见表2
[0156] 1.2BTK(R28H)抑制活性筛选
[0157] 用激酶缓冲液(50mM HEPES、10mM MgCl2、2mM DTT、1mM EGTA、 0.01％Tween 20)将200ng/uL的BTK(R28H)母液进行稀释，按每孔加入6μL 1.67×的1.67ng/μL的工作液(终浓度为1ng/μL)，用纳升加样仪将DMSO溶解 的不同化合物101-112加入到孔中，使化合物终浓度为2000nM-0.488nM，阳性 药终浓度为200nM-0.0488nM，4倍梯度，共7个浓度，同时设空白对照孔(不 含酶)与阴性对照孔(含酶，加溶媒DMSO)，设2个复孔。酶与化合物或溶媒 反应30min后，将用激酶缓冲液配制好的5×的500μM ATP(终浓度为100uM) 与5×的0.5μM底物(终浓度为0.1μM，ULight-poly GT)，按1:1混合，按每 孔4μL加入孔中；封板膜封板以后，室温反应2h后，每孔加入5μL 4×的40 mM EDTA(终浓度为10mM)，室温5min，再在每孔加入5μL 4×的8nM检 测试剂(终浓度为2nM，Ab)，室温孵育1小时；PE仪器读板(激发620nm， 发射665nm)。计算抑制率，并计算IC50值。测定结果见表2
[0158] 表2显示化合物101-112对于野生型BTK、突变体BTK(R28H)的活性 数据。活性利用IC50表征，其中“A”表示IC50≤5nM；“B”表示5
[0159] ALK ALK T790M
样品编号 IC50(nM) IC50(nM)
101 A A
102 B A
103 A A
104 A A
105 B A
106 B A
107 B B
108 C D
109 A -
110 B -
111 A B
112 B C
样品编号 IC50(nM) IC50(nM)
101 A A
102 B A
103 A A
104 A A
105 B A
106 B A
107 B B
108 C D
109 A -
110 B -
111 A B
112 B C
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