权利要求

급성 출혈열을 일으키는 율리 바이러스, 이 바이러스의 항원 단백질, 이 바이러스의 검출 방법 및 이 바이러스를 이용한 백신{YULERI VIRUS CAUSING ACUTE FEBRILE HEMORRHAGIC DISEASE, ANTIGENIC PROTEIN THEREOF, METHOD FOR DETECTING SAME AND VACCINE USING SAME}

본 발명은 급성 출혈열을 일으키는 신규 바이러스, 이 바이러스의 항원 단백질, 이 바이러스의 검출 방법 및 이 바이러스를 사용한 백신에 관한 것이다.

현재 국내에서 발생하는 급성 출혈열 질환(acute febrile hemorrhagic disease)은 발진열(murine typhus), 쭈쭈가무시병(scrub typhus), 렙토스피라병(leptospirosis) 및 신증후 출혈열(hemorrhagic fever with renal syndrome: HFRS) 등이 알려져 있다. 이 중 발진열, 쭈쭈가무시병 및 렙토스피라병은 세균 병원체인 리켓치아 타이피( Rickettsia typhi ), 리켓치아 쭈쭈가무시( R. tsutsugamushi ) 및 렙토스피라 인테로간스( Leptospira interrogans )에 의해 각각 일어나며, 신증후 출혈열은 바이러스 병원체인 한타 바이러스(Hantavirus)에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다. 특히 한타 바이러스는 3개로 분절된 단일가닥의 RNA를 핵산으로 포함하고 외피(envelop)로 둘러싸여 있으며 나선 대칭(helical symmetry)의 비리온을 형성한다.

그러나 급성 출혈열 질환의 1/3 이상이 병원체가 규명되지 않은 불명열 질환이며, 이들 감염증들이 비슷한 시기에 국내 전역에서 발생하고 있어 심각한 문제가 되고 있다. 특히, 급성 출혈열 질환 중 신증후 출혈열, 쭈쭈가무시병 및 발진열 질환의 발생 빈도는 각각 10 내지 25 이며 렙토스피라병의 경우는 5 미만으로서, 이들 4 종의 질환이 전체 급성 출혈성 질환의 60 내지 70 를 차지하지만, 나머지는 아직 원인 불명이다.

최근 보고에 따르면, 1987년 1월부터 1988년 12월까지의 24 개월 동안 서울,의정부, 포천, 대전, 대천, 청주, 홍성, 광주, 전주 및 제주에서 발생한 급성 열성(acute febrile episode) 환자의 혈청 3,500 여건을 분석한 결과, 약 40 의 환자(1987년에 37.8 (671/1,773), 1988년에 41.1(724/1,761))가 원인불명이었다(Chang WH et al., J. Korean Soc. Microbiol. 24 , 399-409 (1989)). 또다른 보고(Baek LJ et al., J. Korean Soc. Virol. 19 , 117-125 (1989))에 의하면, 급성 출혈성 질환자 1,216 명의 혈청을 간접 면역 형광 항체법(indirect immunofluorescent antibody stain: IFA stain)에 따라 조사한 결과 46 (566/1,216)의 환자가 원인불명이었다. 또다른 보고(Lee HW et al., J. Korean Soc. Virol. 18 , 131-142(1988))에 의하면, 1978 년부터 1987 년까지의 10 년 동안 신증후 출혈열로 의심되는 환자 12,398 명의 혈청을 조사한 결과 43.5(5,391/12,398)만이 신증후 출혈열로 확인되었을 뿐 나머지는 원인불명이었다. 특히, 신증후 출혈열 환자수는 점점 감소하는 추세로, 1987 년에는 30.3(701/2,311)까지 낮아졌으며, 1989 년에는 22(430/1886)로 더욱 감소하였으나(Lee HW et al., J. Korean Soc. Virol. 21 , 183-192 (1991)), 이와는 반대로 원인불명열 환자는 34 (628/1,886)로 변동이 없었고, 1990 년 이후부터는 증가하였다(Song JW et al., J. Korean Soc. Virol. 28 , 377-382(1998)). 따라서, 30 내지 40의 높은 점유율을 보이는 원인불명의 급성출혈열의 병원체를 규명하는 것이 매우 시급한 실정이다.

이에 본 발명자는 원인불명의 급성출혈열 환자로부터 아직 보고되지 않은 신규 병원체를 규명하고자 예의 연구하였다.

따라서 본 발명의 목적은 급성 출혈열을 일으키는 신규 바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스의 항원 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 바이러스의 검출 방법을 제공하는 데 있다.

보 발명의 또다른 목적은 상기 바이러스를 이용한 급성 출혈열 백신을 제공하는 데 있다.

도 1a는 본 발명에 따른 바이러스의 세포내 및 세포외 증식량과 항원 양성율을 나타내는 그래프이고, 도 1b 내지 1g는 각각 정상 대조 세포 단층과 바이러스로 감염된 후 2일 내지 6일 동안 시간 경과에 따른 세포 형태를 도립 현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.

도 2a 내지 2d는 각각 본 발명의 바이러스로 감염된 후 2일, 4일, 5일, 및 6일의 세포에 대한 간접 면역 형광항체법의 결과이다.

도 3a 및 3b는 본 발명의 바이러스를 각각 병아리 및 기니픽의 적혈구와 응집 반응시킨 결과를 보여주는 사진이다.

도 4는 본 발명의 바이러스로 감염된 세포단층에 형성된 플라크를 보여주는 사진이다.

도 5a 및 5b는 본 발명의 비리온을 매질 염색한 결과를 보여주는 투과 전자현미경 사진(배율은 각각 125,000 배 및 200,000 배)이고, 도 5c는 본 발명의 바이러스로 감염된 세포의 초박막 절편의 투과 전자현미경 사진이며, 도 5d 및 5e는 본 발명의 바이러스로 감염된 세포의 초박막절편을 매질염색하여 나타난 봉입체의 투과 전자현미경 사진이다.

도 6a 및 6b는 각각 선형 수크로즈 밀도 구배 및 선형 CsCl 밀도 구배에서 본 발명의 비리온의 부력 밀도를 나타내는 그래프이다.

도 7a는 본 발명의 바이러스 핵산의 DNase I 및 RNase 소화 반응물의 펄스 필드 겔 전기영동 결과를 보여주는 겔 사진이고, 도 7b는 펄스 필드 겔 전기영동된 α-[ ³² P]가 표지된 바이러스 핵산의 오토래디오그래피 결과를 보여주는 사진이고, 도 7c는 본 발명의 바이러스 핵산의 투과 전자현미경 사진이며, 도 7d는 본 발명의 비리온에서 누출된 핵산의 현미경 사진이다.

도 8a는 본 발명의 바이러스의 단백질의 SDS-PAGE 결과를 보여주는 겔 사진이며, 도 8b는 [ ³⁵ S]-메티오닌이 표지된 구조 단백질을 오토래디오그래피한 결과를 보여주는 사진이고, 도 8c는 본 발명의 바이러스 구조 단백질을 사용한 웨스턴 블랏 결과를 보여주는 사진이다.

도 9a는 pH에 따른 본 발명의 바이러스의 안정성을 나타내는 그래프이며, 도 9b는 온도에 따른 본 발명의 바이러스의 안정성을 나타내는 그래프이고, 도 9c는 유기 용매에 대한 본 발명의 바이러스의 안정성을 나타내는 그래프이며, 도 9d는 1SDS에 의해 파괴된 비리온을 보여주는 전자현미경 사진이다.

도 10a 및 10b는 각각 본 발명의 바이러스 및 한탄 바이러스에 감염된 환자의 체온 변화를 나타내는 그래프이고, 도 10c는 본 발명의 바이러스 및 한탄 바이러스에 감염된 환자의 혈압 변화를 나타내는 그래프이다.

도 11a 및 11b는 각각 본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스로 감염된 환자의 혈색소 변화를 나타내는 그래프이다.

도 12a 및 12b는 각각 본 발명의 바이러스로 감염된 환자의 혈액 뇨질소 및 크레아티닌 변화를 나타내는 그래프이며, 도 12c 및 12d는 각각 한탄 바이러스로 감염된 환자의 혈액 뇨질소 및 크레아티닌 변화를 나타내는 그래프이다.

도 13a 내지 13c는 각각 본 발명의 바이러스로 감염된 환자의 혈중 Na, K 및 Cl 변화를 나타내는 그래프이고, 도 13d 내지 13f는 한탄 바이러스로 감염된 환자의 혈중 Na, K 및 Cl 변화를 나타내는 그래프이다.

도 14a 내지 14c는 각각 본 발명의 바이러스로 감염된 환자의 적혈구, 백혈구 및 알부민 농도를 나타내며, 도 14d 내지 14f는 한탄 바이러스로 감염된 환자의 적혈구, 백혈구 및 알부민 농도를 나타낸다.

도 15a 및 15b는 각각 본 발명의 바이러스 및 한탄 바이러스로 감염된 환자의 일일 소변량을 나타내는 그래프이다.

도 16은 본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스의 항체 양성율을 월별 및 성별로 나타낸 그래프이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 급성 출혈열을 일으키고, DNA 핵산을 포함하는 직경 25 내지 35 ㎚ 크기의 정20면체 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)가 외피로 둘러싸인 직경 60 내지 70 ㎚의 비리온(virion) 구조를 가지며, 감염세포에서 다핵 거대세포를 형성하는 것을 특징으로 하는 율리(Yuleri) 바이러스를 제공한다.

다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 바이러스로부터 분리되고 72.1 kDa, 55.7 kDa, 52.6 kDa 또는 50.1 kDa의 분자량을 갖는 항원 단백질을 제공한다.

또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 혈액 시료를 이 바이러스, 이로부터 분리된 항원 단백질, 이에 대한 항체 또는 이의 유전자와 반응시키는 단계를 포함하는 상기 바이러스의 검출 방법을 제공한다.

또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 바이러스 또는 이로부터 분리된 항원 단백질을 포함하는 급성 출혈열 백신을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 바이러스는 급성 출혈열을 일으키는 신규 바이러스로, DNA 핵산을 포함하는 정20면체의 캡시드가 외피로 둘러싸인 구조를 가지며 이 바이러스로 감염된 세포의 융합을 유도하여 다핵 거대세포(multinucleated giant cell)를 형성하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바이러스의 비리온은, 직경 60 내지 70 ㎚인 구형으로, 직경 25 내지 35 ㎚의 정20면체의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)가 외피(envelope)로 둘러싸인 구조를 가진다. 이 비리온의 부력 밀도(buoyant density)는 수크로즈 중에서 약 1.12 내지 1.15 g/㎖의 범위이며 CsCl 중에서 약 1.24 내지 1.26 g/㎖의 범위이다. 이 비리온은 산과 열에 약하고, 디에틸에테르, 클로로포름, 포르말린 등의 유기 용매에 의해 감염성이 소실되며, NP-40, 소디움 도데실 설페이트(SDS)와 같은 청정제(detergent)에 의해 파괴된다. 또한 이 바이러스의 게놈은 분절되지 않은(non-segmented) 선형의 이중가닥 DNA로 약 145 kbp의 크기를 가진다. 이 바이러스의 비리온에는 18 개 이상의 단백질이 존재하며, 이 중 72.1 kDa, 55.7 kDa, 52.6 kDa 및 50.1 kDa의 4 개의 단백질이 이 바이러스로 감염된 환자의 회복기 혈청 항체와 반응하는 항원성을 가진다. 특히 이 바이러스 항원은 이 항체에 대해 면역학적 특이성(immunological specificity)을 가진다. 이 바이러스로 감염되면 이 바이러스에 특이적인 중화항체(neutralizing antibody)가 생성되며 회복기에 이르러 중화항체가가 증가하며, 감염 초기에는 특이적인 IgM 항체가 검출되고 회복기에는 3 내지 4 배 이상의 IgG 항체가가 검출된다.

이 바이러스는 세포에 감염하여 세포질내에서 증식하면서 봉입체(inclusion body)를 형성하며, 생장 주기(growth cycle)는 18 내지 22 시간이다. 특히 이 바이러스로 감염된 세포들은 융합하여 다핵의 거대세포를 형성하는 병변을 나타낸다.

본 발명의 바이러스는 인체에 감염하여 급성 출혈열을 일으키는데, 임상 경과는 발열기, 저혈압기, 이뇨기, 핍뇨기 및 회복기의 5 단계로 구분되며 경증(mild form)에서부터 중증(severe form)의 감염증을 보인다. 이 출혈열의 주 증상으로는 고열, 오한, 두통, 피부발진, 측복부통증, 요통, 복통 등이 환자의 80에서 나타나며 이외 인후통, 안면홍조, 현기증, 구역, 구토, 설사 및 기침 등이 50내지 75의 환자들에서 나타난다. 이 증상들의 지속 기간은 0.8 일에서 6.3 일이나 증상에 따라 다양하다. 이 출혈열은 성별 및 연령별 차이없이 발생한다. 본 발명자가 본 발명의 바이러스를 실험실 동물인 마우스, 쥐, 기니픽 및 토끼에 뇌내, 복강, 근육, 피하 등 여러 경로로 감염시킨 결과, 현성 감염이 성립되지 않았고 항체가도 매우 낮았다.

본 발명의 바이러스에 의한 급성 출혈열의 검사실 및 이화학적 소견을, 한타 바이러스 속의 원형 바이러스인 한탄 바이러스(Hantaan virus)에 의한 신중후 출혈열(Lee JS et al., Clinical manifestation and treatment of HFRS and HPS. In : Manual of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and Hantavirus and Pulmonary Syndrome . Lee HW, Calisher C & Schmaljohn C (eds). WHO Collaborating Center for Virus Reference and Research(Hantavirus). Asan Institute for Life Science, Seoul. pp 18-38(1998))과 비교하면 다음과 같다.

① 체온 변화

본 발명의 바이러스에 의한 출혈열과 한탄 바이러스에 의한 신증후 출혈열은 모두 발증 초기에 39 ℃ 이상의 고열을 나타내지만, 질병이 경과함에 따라 본 발명의 출혈열은 37 ℃ 이상의 열이 상당기간 지속되는 반면 신증후 출혈열은 37 ℃ 정도로 유지된다.

② 혈압 변화

본 발명의 출혈열과 신증후 출혈열은 초기에 저혈압기와 이 후 고혈압기를 보이나, 본 발명의 출혈열은 수축기(systolic)와 확장기(diastolic)의 혈압 변동폭이 신증후 출혈열보다 크다.

③ 혈색소(hemoglobin : Hb)와 혈소판(platelet) 농도

본 발명의 출혈열과 신증후 출혈열은 말초혈액내 혈색소와 혈소판이 정상치보다 감소되는 특성을 보이나, 그 감소폭은 본 발명의 출혈열의 경우가 신증후 출혈열의 경우보다 적다.

④ 혈액 뇨질소(BUN)와 크레아티닌(creatinine) 농도

본 발명의 출혈열과 신증후 출혈열은 감염 초기에 말초혈액내 혈액 뇨질소와 크레아티닌이 증가하는 특성을 보이나, 그 증가폭은 본 발명의 출혈열의 경우가 신증후 출혈열의 경우보다 적다.

⑤ 말초 혈액내 전해질(electrolyte) 농도

본 발명의 출혈열과 신증후 출혈열은 말초혈액내 Na, K, Cl 전해질 농도에 따른 차이가 없다.

⑥ 요검사(urinalysis)

본 발명의 출혈열과 신증후 출혈열은 감염 초기에 요에서 다량의 알부민(albumin), 백혈구(WBC) 및 적혈구(RBC)가 관찰되는 특징이 있으나, 신증후 출혈열이 본 발명의 출혈열보다 더 많은 적혈구와 알부민을 나타낸다. 특히 본 발명에 의한 출혈열은 요내 적혈구가 감염 초기와 후기에 2회 관찰되는 2상성(diphasic) 양상을 보이는 특징이 있다. 또한 본 발명의 출혈열과 신증후 출혈열은 감염 초기에 핍뇨기를 보이며 질병이 경과함에 따라 이뇨기를 보이는데, 오줌 양의 변화량은 본 발명의 출혈열의 경우가 신증후 출혈열의 경우보다 더 크다.

본 발명의 바이러스에 의한 출혈열의 역학적 특성을 한탄 바이러스에 의한 신증후 출혈열과 비교하면, 본 발명의 출혈열에 의한 연중 항체 양성율은 신증후 출혈열의 경우보다 4 배 이상 높고, 본 발명의 바이러스의 감염증은 연중내내 발생하며 특히 8월부터 증가하기 시작하여 가을(9월 내지 11월)에 최고 발생율을 보인다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 바이러스는 출혈열을 일으키는 것으로 보고된 아보바이러스(Arbovirus), 로보바이러스(Robovirus) 등의 RNA 바이러스와는 전혀 상이한 신규 DNA 바이러스이다. 특히 바이러스 분류에 관한 국제 바이러스 명명 위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)에 71 과(families)에 현재까지 3,600 종(species)의 바이러스가 등록되었으며(Murphy FA et al., 상기문헌) 이 중 DNA 바이러스 과에는 25개 과와 1개의 유주 속(floatinggenus)을 포함하고, 이 중 12개 과에 속한 바이러스의 핵산이 선형 이중가닥(linear double-stranded)이며, 이 중 헬피스비리대(Herpesviridae), 이리도비리대(Iridoviridae) 및 아프리카 돼지열 유사 바이러스(African swine fever-like virus)과의 바이러스가 외피로 싸인 구형의 비리온(enveloped spherical virion)으로 정20면체 대칭 뉴클레오캡시드를 가지는 것으로 보고되고 있으나, 이리도비리대는 주숙주(priciple host)가 냉혈 동물(poikilothermic animal)이고 비리온의 직경이 175 내지 215 ㎚로 본 발명의 바이러스보다 5배 이상 크며 비리온이 중� �� 구멍(central hole)이 있는 육각형 프리즘(hexagonal prism)의 외형을 보이고 핵산은 440 kbp으로서(Murphy et al., 상기문헌) 본 발명의 바이러스와는 상이하고, 헬피스비리대는 모양과 DNA 크기에 있어 본 발명의 바이러스와 유사하지만 바이러스의 증식 주기, 세포 병변, 증식성이 있는 세포주, 비리온의 크기 및 세부 구조(toroid tegument), 적혈구 응집성(헬피스비리대는 적혈구 응집성이 없음) 등에 있어서 본 발명의 바이러스와는 상이하다(Murphy et al., 상기 문헌). 실제로 본 발명자가 서울 임상병리 검사센터에 의뢰한 실험에 따르면, 본 발명의 바이러스 DNA를 주형으로 사용하고 인간 헬피스바이러스 1형(human herpesvirus type 1, HHV-1) 내지 5형의 형 특이적 프라이머 세트를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)을 수행한 결과 증폭된 PCR 산물이 없었으며, HHV-1 내지 HHV-5의 각 형에 대한 단일클론 항체를 반응시킨 후 형광 항체법을 수행한 결과에서도 비특이적 반응 또는 교차 반응이 나타나지 않았다. 이러한 결과도 본 발명의 바이러스는 현재까지 보고된 바 없는 생물학적, 혈청학적 및 분자생물학적 성상을 갖는 신규 DNA 바이러스임을 보여준다. 따라서 본 발명의 바이러스는 종래의 어떠한 DNA 바이러스과에도 속하지 않는 새로운 바이러스과의 원형(prototype) 바이러스이며, 종래의 학명으로 표기되지 못한다.

이에 본 발명자는 본 발명에 따른 바이러스를 율리 바이러스(Yuleri virus)로 명명하였으며, 이 중 한 균주인 93/90 균주를 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000년 1월 28일자 기탁번호 제KCTC 0725BP호로 기탁하였으며, 율리 바이러스에 의한 출혈열을 율리 출혈열(YHF: Yuleri hemorrhagic fever)로 명명하였다.

본 발명의 바이러스의 분리 및 동정 과정은 다음과 같다.

본 발명에서 바이러스의 분리에 사용될 시료는, 급성 출혈열 환자 또는 출혈열로 추정되는 환자의 혈액으로, 이 환자로부터 헤파린 등의 항응고제로 처리된 주사기와 항응고제가 처리되지 않은 주사기로 채혈하였다. 항응고제가 처리되지 않은 혈액 시료를 4 ℃에서 1 시간 이상 정치한 후 원심분리하여 혈청(serum)을 얻었다. 한편 항응고제가 처리된 혈액 시료를 원심분리하여 혈장(plasma)를 얻었고, 원심분리 후 얻은 세포 침전물을 완충용액과 혼합한 후 피콜/하이파크(Ficoll/Hypaque, Pharmacia) 구배 중에서 원심분리하여 단핵구(monocyte)가 모인 연층(buffy layer)를 회수한 후 완충용액으로 원심분리하여 세척하고 배지 중에 부유시켜 단핵구 시료를 얻을 수 있다. 채집된 시료를 간접 면역 형광 항체법(Peters CJ et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 142 , 526-531 (1973))에 따라 종래에 알려진 급성 출혈열 병원체, 예를 들어 한탄 바이러스, 서울 바이러스, 피코르나비리대(Picornaviridae)의 엔테로바이러스(Enterovirus), 리켓치아 타이피( R. typhi ), 리켓치아 쭈쭈가무시( R. tustsugamushi ), 렙토스피라 인테로간스( L. interrogans ) 항원에 대해 항체 양성인 시료를 제외시켜, 미확인 병원체로 감염된 시료만을 사용한다.

얻어진 시료로부터 미확인 병원체를 분리하기 위해, 상기 혈청 또는 혈장 시료는 Vero E6 세포(ATCC C1008 CRL 1586) 부유액을 세포 배양병에서 배양하여 얻은 세포 단층에 접종 흡착시켜 배양하고, 단핵구 시료는 Vero E6 세포 부유액과 함깨 세포 배양병에서 동시배양하며, 각각의 배양액을 5회 내지 7회 계대 배양한다. 일반적으로 바이러스는 숙주가 달라지면 감수성이 있는 숙주라하더라도 그 숙주에서 증식하기까지 상당 기간의 적응(adaptation) 기간을 거치기 때문에 5 회 이상 계대배양(blind passage)을 하여야 한다. 이 등(Lee HW et al., J. Infect. Dis. 137 , 298-308(1978))을 포함한 많은 연구자들이 환자 혈액 자체를 바이러스 분리용 시료로 사용한 바 있으나, 본 발명자는 적혈구를 제외시킨 단핵구를 사용하였는데, 그 이유는 성숙한 적혈구는 더 이상 분열, 성장하지 않고 적혈구에 기생하는 바이러스는 매우 희귀할 뿐만 아니라 혈액내 적혈구의 비율이 50이상이어서 바이러스가 숙주세포에 흡착되는 데 방해가 될 소지가 많기 때문이다.

본 발명자는 전신적 급성 출혈열 증상을 가진 22 세 남자 환자의 말초 혈액 단핵구로부터 본 발명의 바이러스 병원체를 분리하였다.

분리된 바이러스를 클로닝하기 위해, 바이러스로 감염된 하나의 세포의 부유액을 냉동-해동과정을 약 3회 반복하고 원심분리하여 세포를 제거한 후 상청액을 여과한 다음 한계 희석(limiting dilution)하고 Vero E6 세포 단층에 접종하여 배양하였으며 이 과정을 약 3 회 반복하여 클로닝된 바이러스를 얻는다.

클로닝된 바이러스는 문헌(Puck TT et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 41 , 432-437(1955)의 방법에 따라 증식 곡선 등의 생물학적 특성, 항원-항체 간의 면역학적 특이성, 비리온의 형태, 핵산 특성, 구조 단백질과 단백질의 항원성, 비리온의 물리화학적 특성, 병원성, 임상 증상과 검사실 소견, 및 역학적 특성을 조사하여 동정한다.

일반적으로 미확인 바이러스의 동정 과정은 이 바이러스의 생물학적 성상, 바이러스 형태, 바이러스 핵산, 단백질 구성, 항원성, 병원성, 전파 경로, 지질(lipid) 및 탄수화물(carbohydrate) 함량 등 500 내지 1000 개의 특성을 포괄적으로 조사하여 300만 내지 2,100만개의 자료(data point)를 완성해야 하는 방대한 일이다(Atherton JC et al., Monogr. Virol. 14 , 1-154 (1983): Boswell KF et al., Rev. Plant. Pathol. 65 , 221-231(1986)).

본 발명의 바이러스는 급성 출혈열을 일으키는 병원성 바이러스이므로, 급성 출혈열이 의심되는 환자의 혈액 시료를 이 바이러스에 대한 항체와 반응시킴으로써 상기 바이러스를 검출할 수 있다. 상기 항체로는 이 바이러스로 감염된 환자의 회복기 혈청을 사용할 수도 있으며, 본 발명의 바이러스에 특이적인 단일 클론 항체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 바이러스 자체, 이와 특성이 실질적으로 동일하거나 유사한 바이러스, 바이러스 항원, 바이러스에 대한 항체 및 바이러스 유전자를 이용하여 본 발명의 바이러스 또는 그에 대한 항체를 검출할 수 있으며, 그 결과에 따라 본 발명의 바이러스에 의한 감염 여부를 확인할 수 있다. 이러한 검출 방법의 대표적인 예로는, 혈액 시료를 상기 바이러스 또는 이의 항원 단백질과 반응시키는 방법, 혈액 시료를 바이러스에 대한 항체와 반응시키는 방법, 혈액 시료를 바이러스 유전자와 함께 통상적인 하이브리드화 또는 중합효소 연쇄 반응에 따라 반응시키는 방법을 들 수 있다. 상기 항원 단백질은 본 발명의 바이러스로부터 통상적인 단백질 정제 방법(Robertson D et al., Extraction of recombinant protein from Escherichia coli. In : Manipulation of Recombinant DNA . Robertson D. Shore S & Miller DM(eds). Academic Press, San Diego, pp 117-123 (1997); 및 Schmaljohn CS et al., J. Infect. Dis. 148 , 1005-1012 (1983))에 따라 정제할 수 있다. 즉, 정제된 바이러스 부유액에 5SDS 및 42-머캅토에탄올이 포함된 0.5 M 트리스-HCl(pH 6.7)을 동량으로 가하고 37 ℃에서 50 분 동안 반응시키면서 혼합하여 바이러스 단백질을 분리한 다음 차가운 포화 암모니움 설페이트를 3 배량을 가하고 0 ℃에서 30 분 동안 정치시켜 단백질을 염석(salting out)하여 침전시킨다. 단백질 침전물을 완충액 B(0.5M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 14 mM 2-머캅토에탄올 및 0.1트리톤 X-100)에 용해시켜 정제된 바이러스 단백질을 얻는다. 또한 상기 항체는 본 발명의 바이러스 또는 이로부터 분리된 항원 단백질을 사용하여 통상적인 항체 제조 방법(Brandt WE et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 16 , 330-347 (1967); 및 Boere WAM et al., J. Gen. Virol. , 64 , 1405-1408 (1983))에 따라 제조할 수 있다. 상기 유전자는 본 발명의 바이러스 핵산으로부터 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 바이러스에 의한 감염은 감염된 환자의 혈액을 사용한 적혈구 응집반응법, 특이적인 세포병변의 관찰 및 간접 면역 형광 항체법을 사용하여 확인할 수도 있다.

또한 본 발명의 바이러스 또는 이로부터 분리된 항원 단백질은 급성 출혈열을 예방하기 위한 백신으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스, 이와 특성이 실질적으로 동일 또는 유사한 바이러스, 또는 이의 변이주(variant)를 불활화시킨 다음 정제하여 사균 백신(killed vaccine)으로 제조할 수도 있으며, 상기 바이러스 또는 변이주를 세포나 동물에 계대 배양시켜 약독화 생균 백신(live attenuated vaccine)으로 유도하여 제조할 수 있으며, 상기 바이러스 또는 변이주의 항원 단백질을 코딩하는 바이러스 유전자를 공지된 유전자 재조합법에 따라 조작하여 항원 단백질을 대량생산하여 백신으로 제조할 수 있으며, 재조합된 유전자 자체를 백신(재조합 DNA 백신)으로 사용할 수도 있다. 또한 상기 바이러스 또는 변이주 항원 단백질을 아미노산 서열 분석 결과를 토대로 화학적으로 합성하거나 특정 모티프(motif) 만을 합성하여 합성 백신(synthetic vaccine)으로 사용할 수도 있다. 상기 백신은 옥배유, 올리브유, 대두유, 홍화유, 면실유, 땅콩유, 호마유, 해바라기유 등의 식용유; 미네랄 오일; 스쿠알렌; 스쿠알란; 대구 간유; 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 및 이들의 혼합물 등의 주사제 용액에 분산시켜 주사 투여할 수 있다. 또한 필요에 따라 주사제 용액에는 분산제나 방부제를 추가로 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서 세포로는 세포주 Vero E6(ATCC C1008 CRL 1586)를 사용하고, 배지로는 이글 최소 필수 배지(Eagles minimal essential medium; EMEM, Sigma) 또는 둘베코 변형 배지(Dulbecco modified medium, Sigma)에 6 우태아혈청과 항생제(페니실린 100 units/㎖, 스트렙토마이신 100 g/㎖)를 첨가한 것을 사용하였다(French GR et al., Science 211 , 1046-1048 (1981); 및 Kim GR et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 34 , 388-395 (1985)).

참조예 1: 간접 면역 형광 항체법(IFA stain)

바이러스로 감염된 세포 25 ㎕를 스팟 슬라이드 웰(spot slide well)에 넣고 건조시킨 후 차가운 아세톤으로 고정한 것을 항원으로 사용하고, 바이러스로 감염된 환자 자신의 혈청을 항체로 사용하여 반응시킨 다음, 염소 항-인간 FITC-표지된 IgG(ab') ₂ (Cappel)와 반응시켰다. 이때, 혈청 항체 16 단위와 항글로불린(antiglobulin) 8 단위를 사용하였다. 반응 후 염색하고 형광현미경(Axiophot, Zeiss)으로 관찰하였다.

참조예 2: 바이러스 감염가의 측정

바이러스의 감염가는 문헌(Burleson FG et al., Virology. A Laboratory Manual. Academic Press, New York, pp 111-120 (1992))의 방법에 따라 TCID ₅₀ /㎖로측정하였다. 즉, 바이러스 배양액을 차가운 0.01M 인산완충용액(PBS)로 10 배 계단 희석한 후, 이 희석액을 24-웰 배양 플레이트에 형성된 Vero E6 세포단층에 0.1 ㎖/웰씩 접종한 다음 90 분 동안 흡착시키고, 이어서 성장 배지(growth medium) 1 ㎖/웰을 가하여 5CO ₂ , 37 ℃에서 7 일 동안 배양하였다. 이때 각 희석액은 3 웰에 접종하였다. 배양이 끝난 후 3 웰의 배양 상청액과 세포를 혼합하여 4 ℃에서 500 xg로 10 분 동안 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상청액을 버리고 세포 침전물을 차가운 0.01M PBS로 부유시킨 후 동일하게 3회 원심분리하여 세포를 세척하였다. 얻어진 세포 침전물에 동일한 0.01M PBS를 가하여 최종 1 ㎖가 되게 희석한 후 희석액을 스팟 슬라이드 4 웰에 30 ㎕씩 놓고 건조시킨 다음 차가운 아세톤으로 4 ℃에서 5 분 동안 고정한 다음, 회복기 환자 혈청을 양성대조 혈청으로 사용하여 간접 면역 형광 항체법을 실시하여 문헌(Reed LJ & Muench HA. Am. J. Hyg. 27 , 493-497(1938))의 방법에 따라 TCID ₅₀ /㎖ 값을 계산하였다.

실시예 1: 신규 급성 출혈열 바이러스의 분리

(단계 1) 시료의 채취

1986 년부터 1998 년까지 강남 성모병원, 성모병원, 의정부 성모병원, 인천성모 자애 병원 및 국군 수도 통합병원 등 5 개 병원에서 급성 출혈열 환자 또는 출혈열로 추정되는 환자 1,617 명으로부터 혈청 시료(약 1 ㎖/건씩 2,535 건) 및 혈액 시료(평균 5 ㎖/인씩 1,423 건)을 채집하였다(총 3,040건). 이때 남자 환자는 1,236명(연령 14세-45세)이었고, 여자 환자는 381명(연령 16세-42세)이었다.

혈액 시료의 채취 방법으로는, 감염 초기 환자의 혈액을 헤파린(heparin)이 처리된 멸균 주사기로 5 내지 7 ㎖(평균 5 ㎖)의 양으로 채혈하고 이어서 헤파린이 처리되지 않은 주사기로 2 내지 3 ㎖의 양으로 다시 채혈하였으며, 이 후 5 내지 7 일 간격으로 2회 이상 동일한 방법으로 채혈하였다. 채혈된 혈액 시료를 즉시 얼음 상자에 담아 보관하였다(Lee HW et al., J. Infect. Dis. 137 , 298-308(1978); 및 Kim GR et al., Arch. Virol. 134 , 85-95(1994)).

헤파린이 처리되지 않은 혈액 시료를 4 ℃에서 1 시간 이상 정치한 후 4 ℃에서 500xg로 10분 동안 원심분리하여 혈청(serum)을 회수하였으며, 이 중 0.1 ㎖를 바이러스 분리용 시료로 사용하고 나머지는 -80 ℃에서 보관하였다. 또한 헤파린이 처리된 혈액 시료를 동일한 방법으로 원심분리하여 혈장(plasma)을 회수하였으며, 이 중 0.1 ㎖를 바이러스 분리용 시료로 사용하고 나머지는 -80 ℃에서 보관하였다. 또한, 헤파린이 처리된 혈액 시료의 원심분리 후 얻어진 세포 침전물에 혈장과 동량의 0.01 M 인산 완충용액을 가하고 잘 혼합한 후 혼합액 3 ㎖를 피콜/하이파크(Ficoll/Hypaque, Pharmacia) 구배 2 ㎖(비중 1.070)위에 중층(layering)한 다음 4 ℃에서 1,000xg로 20 분 동안 원심분리하고(Johndall J et al., J. Exp. Med. 139 , 207-217(1972), 단핵구(monocyte)들이 모여있는 연층(buffy layer)을 회수한 후 4 ℃의 0.01M PBS로 3회 원심분리하여 세척하고 단핵구 침전물을 배지 1 ㎖에 부유시켜 바이러스 분리용 시료로 사용하였다.

채집된 시료들을 참조예 1의 간접 면역 형광 항체법과 문헌(Peters CJ etal., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 142 , 526-531 (1973))의 미량 응집반응(micro-agglutination)법에 따라 한탄 바이러스(Hantaan virus, 76/118 strain), 서울 바이러스(Seoul virus, 80/39 strain), 피코르나비리대(Picornaviridae)의 엔테로바이러스(Enterovirus)(Coxsackie virus, Echovirus:ATCC서 구입), 리켓치아 타이피( R. typhi ), 리켓치아 쭈쭈가무시( R. tustsugamushi )(Gilliam, Karp, Kato), 렙토스피라 인테로간스( L. interrogans ) 항원과 반응시켜, 이들 항원에 대해 항체 양성인 시료를 제외시켰다. 이때, 한타 및 서울 바이러스는 이호왕 교수(아산 생명과학연구소)로부터 분양받았으며, 한타 바이러스 항원에 대한 항체 검색은 본 발명자가 수행하였고, 리켓치아 렙토스피라 항원에 대한 항체 검색은 국립보건원 및 서울 임상 병리 검사센터에 의뢰하였다.

(단계 2) 미확인 병원체의 분리

Vero E6 세포 부유액(1.3x10 ⁶ 세포/㎖) 6 ㎖씩을 세포배양병 T25(Costar)에 넣고 5CO ₂ , 37 ℃ 배양기에서 2 내지 3일 배양하여 세포 단층을 얻고, 여기에 단계 1에서 얻은 혈청 및 혈장 시료 0.1 ㎖를 각각 접종하고 37 ℃에서 90 분 동안 흡착(adsorption)시켰다. 이때 15 분마다 배양병을 흔들어 세포가 마르지 않게 하고 또 모든 세포에 배지에 골고루 접촉시켰다. 흡착 후 신선한 배지 6 ㎖를 각 배양병에 가하여 배양하였다.

단계 1에서 얻은 단핵구 부유액 1 ㎖(0.8±0.3x10 ⁶ 세포/㎖)을 Vero E6 세포부유액(1.3x10 ⁶ 세포/㎖) 5 ㎖와 잘 혼합하여 세포 배양병에 넣고 문헌(Lee HW et al., J. Infect. Dis. 137 , 298-308(1978); 및 Kim GR et al., Arch. Virol. 134, 85-95 (1994))의 방법에 따라 동시배양(cocultivation)하였다.

5 일 간격으로 신선한 배지로 교환하면서 15 일 동안 배양한 다음 배양액를 회수하고 트립신(trypsin)으로 처리하여 세포를 떼어내 회수한 후 배지에 부유시켰다. 얻어진 부유액의 1/3 부피를 취한 후 2/3 부피의 Vero E6 세포 부유액과 잘 혼합하여 새 배양병에 넣고 동일한 방법으로 15 일 동안 배양하는 계대배양 과정을 5회 내지 7회 반복하였다. 상기 부유액 중 1/3 부피는 -80 ℃에 보관하여 재분리용 시료나 추가검사 시료로 사용하고 나머지 1/3 부피는 간접 면역 형광 항체법을 이용한 바이러스 분리 여부를 조사하는 데 사용하였다(Peters CJ et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 142 , 526-531(1973); Lee PW et al., J. Clinc. Microbiol. 22 : 940-944(1985); 및 Kim GR et al., Arch. Virol. 134, 85-95 (1994).

그 결과, 1993 년 12 월 전형적인 전신적 급성 출혈열 증상을 가진 22세 남자 환자(시료 번호 93/90)의 말초 혈액내 단핵구(peripheral blood monocytes)의 동시배양액으로부터 미확인 바이러스 병원체를 분리하였다.

(단계 3) 바이러스의 클로닝

클로닝되지 않은 바이러스는 동일 조건에서 증식되더라도 증식기간, 증식되는 바이러스양 및 증식 상태 등에 따라 바이러스 입자들 사이에 차이가 생길 가능성이 있으므로, 균질한 특성을 나타내는 비리온을 얻기 위하여 특정 세포의 클로닝에 사용되는 희석 클로닝(dilution cloning) 법을 사용하여 클로닝하였다(Puck TT et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 41 , 432-437(1955)).

단계 2에서 얻은 바이러스로 감염된 하나의 세포병변을 배지 1 ㎖에 부유시킨 다음 냉동-해동(freezing-thawing) 과정을 3회 반복한 다음 4℃에서 5,600xg로 30 분 동안 원심분리하여 세포를 제거하였다. 얻어진 상청액을 여과지(공경 220 ㎚, Millex-GV, Millipore)를 사용하여 여과 멸균한 후 배지로 한계 희석(limiting dilution, 1 비리온/10 ㎕)한 다음 이 희석액을 Vero E6 세포단층이 형성된 24-웰 세포배양 플레이트에 웰 당 10 ㎕씩을 접종하고 배양하였다. 이 과정을 3회 반복하여 14 개 클론을 클로닝하였다. 이 클론들 사이에는 생물학적 특성에 있어 특별한 차이는 없었다. 이 중 한 클론을 증폭시킨 후(1.4x10 ^6.9 TCID ₅₀ /㎖) 1 ㎖씩 나누어 -80 ℃에 보관하였으며, 이를 후속하는 실험에서 종균(stock) 바이러스로 사용하였다.

실시예 2: 급성 출혈열 바이러스의 동정

바이러스의 동정은 방대한 과정으로, 실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스를 동정하기 위해 가장 기본적이고도 필수적인 특징인 생물학적 특성, 항원-항체 간의 면역학적 특이성, 비리온의 형태, 핵산 특성, 구조 단백질과 단백질의 항원성, 비리온의 물리화학적 특성, 병원성, 임상증상과 검사실 소견, 및 역학적 특성을 다음과 같이 조사하였다.

(단계 1) 바이러스 증식곡선(one-step growth curve)

실시예 1의 단계 3에서 얻은 종균 바이러스를 0.01M PBS로 MOI 0.01이 되게 희석하여 얻은 바이러스 희석액을, Vero E6 세포 단층이 형성된 24-웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 0.1 ㎖로 접종하고 배양하였다. 접종일(0일)과 접종 후 2일, 4일, 6일 및 8일에 4개 웰로부터 배양 상청액과 세포를 따로 회수하였다(Burleson FG et al., Virology. A Laboratory Manual. Academic Press, New York, pp 111-120 (1992)).

배양 상청액은 세포외(extracellular) 바이러스 감염가의 측정에 사용하였다. 또한 세포는 0.01M PBS로 3회 원심분리하여 세척한 다음 배지 1 ㎖에 부유시키고 냉동-해동 과정을 3회 실시하여 세포내 바이러스(intracellular virus)를 유리시킨 다음, 4℃에서 1,000xg로 10 분 동안 원심분리하고 상청액을 회수하여 세포내 바이러스 감염가의 측정에 사용하였다. 바이러스 감염가는 참조예 2의 방법에 따라 측정하였고, 바이러스 항원 양성율은 300 개의 세포 중 양성 세포수의 비율로 계산하였다.

도 1a는 본 발명의 바이러스의 세포내 및 세포외 증식량과 항원 양성율을 나타내는 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, 감염 후 초기 20 내지 24 시간에는 암흑기(eclipse period)를 보였고, 7일째에 바이러스 감염가가 1.2x10 ^6.9 TCID ₅₀ /㎖에 도달하였으며, 이 후 감소하였다. 감염 후 5일까지의 기간에는 세포내 바이러스 감염가가 세포외 바이러스 감염가보다 높았으나 5일 후에는 세포외 바이러스 감염가가 세포내 바이러스 감염가보다 높았다. 또한 도 1a에서 보듯이, 바이러스 특이 항원은 감염 후 2일째에 세포질에서 관찰되기 시작하여 6일째에는 90의 세포에서 나타났다.

도 1b 내지 1g는 각각 정상 대조 세포 단층과 바이러스로 감염된 후 2일 내지 6일 동안 시간 경과에 따른 세포 형태를 도립 현미경(inverted microscope TMS.F, Nickon)으로 관찰한 결과를 보여주는 사진이다. 도 1b 내지 1g에서 보듯이 감염 후 2일부터 감염 세포가 융합되는 본 발명의 바이러스 고유의 세포병변이 관찰되었으며, 이 후 세포들이 매우 빠르게 융합(fusion)되어 다핵 거대세포(multinucleated giant cell, syncitia)를 형성하였으며 다양한 크기의 공포(vacuole)들이 세포병변에 나타났다. 세포병변들은 시간이 경과함에 따라 배양병 표면에서 탈락(detachment)되어 상청액내로 유리되었다. 바이러스의 증식 속도도 MOI 값에 따라 증식기간이 짧아지거나 더 지연되었다.

본 발명의 바이러스에 감염된 항원 양성 세포의 증가를 조사하기 위해, 감염 후 2일, 4일, 6일 및 8일에 참고예 1의 간접 면역 형광 항체법을 실시하였다.

도 2a 내지 2d는 각각 감염 후 2일, 4일, 5일, 및 6일의 세포에 대한 간접 면역 형광항체법의 결과이다. 도 2a 내지 2d에서 보듯이, 감염 후 2 일에는 개개 세포에서 항원이 검출되었고(도 2a), 4 내지 5일 경과시엔 감염 세포들이 융합되어 메갈로세포(megalocell)가 형성되었으며(도 2b 및 2c), 6 내지 7일 경에는 다핵 거대세포가 형성되었다(도 2d).

(단계 2) 바이러스 항원-항체 반응의 특이성(specificity)

바이러스 항원과 회복기 환자 혈청내 항체간의 면역학적 특이성을 확인하기 위하여, 문헌(Goldman M. J.Exp. Med. 105 , 557-573(1957); Lee HW et al., J. Infect. Dis. 137 , 298-308(1978); 및 Kim GR et al., Arch. Virol. 134, 85-95 (1994))의 방법에 따라 2단계 차단 시험(two-step blocking test)를 실시하였다. 이때 항원으로는 실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스, 한탄 바이러스 및 서울 바이러스를 독립적으로 감염시킨 Vero E6 세포를 사용하였으며, 항체로는 신증후 출혈열, 쭈쭈가무시병, 발진열, 렙토스피라 및 단계 1에서 분리된 바이러스로 각각 감염된 환자들의 회복기 혈청(쭈쭈가무시, 발진열 및 렙토스피라 환자 혈청은 장우현 교수(한림의대)로부터 분양받음)을 사용하였다. 특히 항체 혈청으로는 개별적으로 간접 면역 형광 항체 염색을 하여 다른 바이러스와 세균에 대한 항체가 검출되지 않는 회복기 환자 혈청을 선정하여 사용하였으며, 대조 혈청으로는 정상 성인 혈청과 정상 마우스 복수액(Capple)을 사용하였고, FITC-항체로는 염소 항-마우스 IgG(Fab') ₂ (Cappel)와 염소 항-인간 IgG(Fab') ₂ (Cappel)를 사용하였다.

그 결과 본 발명의 바이러스 항원은 이 바이러스로 감염된 환자의 회복기 혈청에만 특이적으로 반응하였고, 다른 환자 혈청 또는 대조 혈청에는 전혀 반응하지 않았다. 또한 본 발명의 바이러스에 대한 항체는 다른 항원과 반응하지 않았다.또한 비특이적 반응(non-specific reaction)과 교차반응(cross-reaction)도 일어나지 않았다.

(단계 3) IFA 항체 및 중화항체가

실시예 1의 단계 1에서 얻은 혈청 시료들을 각각 0.01M PBS로 1:20 및 1:40으로 희석한 후, 각 혈청 희석액을 참조예 1의 간접 면역 형광 항체법에 따라 실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스 항원과 반응시켜, 이 바이러스에만 반응하는 1가(monovalent) 혈청 21개를 선별하였다(IFA titer, 1:160-1:2,560). 21개 혈청으로부터, 동일 환자로부터 급성기와 회복기에 채집된 짝 혈청(paired sera) 10개를 선정하였다.

10 개 혈청 시료를 0.01M PBS로 10배 계단희석한 다음, 각 혈청 희석액 0.2 ㎖을 실시예 1의 단계 3에서 얻은 종균 바이러스를 0.01M PBS로 1,000 TCID ₅₀ /㎖가 되게 희석한 바이러스 희석액 0.2 ㎖과 혼합하고 4 ℃에서 16 내지 18 시간 동안 반응시켜 바이러스를 중화시켰다(Lee PW et al., J. Clinc. Microbiol. 22 : 940-944(1985); 및 Kim GR et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 34 , 388-395 (1985)). 이때 비교군으로 800 PFU/㎖의 한탄 바이러스 희석액을 사용하였다.

얻어진 바이러스-혈청 혼합물을 Vero E6 세포단층이 형성된 24-웰 배양 플레이트에 웰 당 0.1 ㎖씩을 접종하고 90 분 동안 흡착시킨 후 배지를 1 ㎖씩 넣고 7 일 동안 배양한 다음 참조예 2의 방법에 따라 바이러스 감염가를 측정하였다. 실험은 2회 반복 실시하였다. IFA 항체가는 특이적 형광이 관찰되는 최고 희석 배수로 정하고, 중화항체가는 바이러스 감염가가 80감소하는 최고 희석 배수로 정하였다. 바이러스 대조군으로는 혈청을 포함하지 않는 바이러스 희석액만을 사용하여 동일하게 실시하였다.

그 결과는 하기 표 1과 같다.

본 발명의 바이러스의 IFA 항체가 및 중화항체가

혈청 시료	연령	성	시료채혈간격(일)	IFA 항체가	중화항체가
				첫 번째 시료	두 번째 시료	첫 번째 시료	두 번째 시료
				IgM	IgG			IgM	IgG
1 †	22	남	30	1:20	-	-	1:640	-	1:80
2	22	남	38	-	1:80	-	1:1,280	-	1:320
3	20	남	37	-	1:40	-	1:640	-	1:40
4	21	남	6	1:40	1:80	1:20	1:320	-	-
5	21	남	2	1:20	1:40	-	1:40	-	-
† 본 발명의 바이러스가 분리된 환자의 혈청(93/90)

표 1에서 보듯이, 급성기에는 본 발명의 바이러스에 특이적인 IgM 항체가 검출되었으며 IgG 항체가는 회복기에 3 배 이상 증가하였다. 중화항체는 감염 초기에 검출되지 않았으나 회복기에 검출되었다.

또한 한탄 바이러스에 대한 항체는 본 발명의 바이러스를 중화시키지 못하였고 본 발명의 바이러스에 대한 항체도 한탄 바이러스를 중화시키지 못하는데, 이로부터 본 발명의 바이러스가 한탄 바이러스와는 다른 바이러스임을 알 수 있다.

(단계 4) 적혈구 응집반응(Hemagglutination, HA) 조사

문헌(Clarke DM and Casals J., Am. J. Trop. Med. Hyg. 7 , 561-573 (1958))의 방법에 따라 병아리(chicken), 기니픽(guinea pig), 거위(goose), 면양(sheep) 및 사람 O형 적혈구를 사용하여 본 발명의 바이러스의 적혈구 응집성을 조사하였다. 이때 완충용액으로는 pH 6.4, 6.6, 7.2, 8.0으로 조정된 인산 완충용액 A(Na ₂ HPO ₄ 0.2M, NaCl 0.15M) 및 B(NaH ₂ PO ₄ 0.2M, NaCl 0.15M)를 사용하였고, 적혈구 농도는 0.33로 하였다. 또한 혈액은 알서버스 용액(Alserver's solution: 덱스트로즈 무수물 2.05g, 시트르산 나트륨 0.80g, 시트르산 0.55g 및 NaCl 0.42g을 증류수 100 ㎖에 녹임)으로 채혈하였고, 응집 반응은 4 ℃, 20 ℃ 또는 37 ℃에서 2 시간 이상 수행하였다.

그 결과는 하기 표 2와 도 3a 및 3b에 나타내었으며, 도 3a 및 3b는 본 발명의 바이러스를 각각 병아리 및 기니픽의 적혈구와 응집 반응시킨 결과이다.

적혈구 응집 반응을 보인 조건

	적혈구	온도(℃)	pH
본 발명의 바이러스	병아리, 기니픽	4, 20, 37	7.2, 8.0
	거위	4, 37 > 20	7.2, 8.0

표 2와 도 3a 및 3b에서 보듯이, 본 발명의 바이러스는 병아리, 기니픽 및 거위 적혈구와 pH 7.2와 pH 8.0 조건하에서 응집 반응하였으나, 반응 역가는 1:8 이하로 매우 낮았다. 또한 실온 조건하에서 거위 적혈구와의 응집 반응은 더욱 약했으며(반응 역가 1:4), pH 6.6 이하의 조건하에서는 어떠한 적혈구와도 응집 반응하지 않았다.

(단계 5) 플라크 형성

본 발명의 바이러스에 의한 플라크의 형성을 문헌(Porterfield JS, A simple plaque inhibition test for the study of arthropod-borne viruses. Bull. World Health Org. 23 , 373-380(1960))의 방법에 따라 다음과 같이 조사하였다.

실시예 1의 단계 3에서 얻은 종균 바이러스를 0.01M PBS로 10배 계단 희석한 후 이 희석액을 Vero E6 세포단층에 감염시켜 90 분 동안 흡착한 뒤 상층(over-lay) 배지(EMEM 45 ㎖, 비동화시킨 우태혈청 5 ㎖, 아가로스 0.2g, 뉴트랄 레드(neutral red) 최종 5)를 가하여 굳힌 후 37 ℃에서 배양하였다(Kim GR et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 34 , 388-395 (1985)).

그 결과, 감염 후 3 일경부터 플라크가 관찰되었다. 도 4는 본 발명의 바이러스로 감염된 세포단층에 형성된 플라크를 나타내며, 특히 상단 2열은 바이러스로 감염된 세포단층이고 하단 1열은 감염되지 않은 대조 세포단층이다. 도 4에서 보듯이, 본 발명의 바이러스에 의해 형성되는 플라크는 비교적 큰 구형이나, 서로 융합되어 다양한 형태로 나타나기도 한다.

(단계 6) 비리온의 형태

본 발명의 바이러스의 모양, 크기, 뉴클레오캡시드의 대칭성 및외피(envelope) 유무를 문헌(Hung, T. et al., Arch. Virol. , 78 , 137-144 (1983))의 방법에 따라 다음과 같이 조사하였다.

① 비리온의 매질 염색

실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스를 MOI 0.1로 Vero E6 세포단층에 감염시켜 배양한 다음 3회 냉동-해동시킨 후 원심분리기(J2-21 Rotor, Beckman)를 사용하여 4 ℃에서 5,600xg로 원심분리하고 상청액을 여과지(공경, 220 nm, Millipore)를 사용하여 여과 멸균하여 정화하였다. 시험관(Ti 75 Rotor, Beckman)에 5.7M CsCl(Optical Grade, 99.99, Schwarz/Mann Biotech. USA) 2 ㎖을 넣고 이 위에 바이러스 여과액 10 ㎖을 올려놓은 다음 4 ℃에서 104,000xg로 16 시간 동안 원심분리하여 바이러스 입자를 침전시켰다(Auvinen P et al., J. Gen. Virol. 71 , 2133-2139 (1990)). 이때 바이러스 여과액 80 ㎖(1.3x10 ^6.9 TCID ₅₀ /㎖)을 사용하여 8개의 시험관에서 상기 침전 과정을 수행하여 바이러스 침전물을 얻어 합하였다.

얻어진 바이러스 침전물을 멸균한 0.01M PBS 0.1 ㎖에 부유시킨 후 바이러스 부유액 6 ㎕를 0.3폼바(Formvar, Merk)가 코팅된, 구멍이 하나인 그리드(one hole grid) 위에 점적하고 여과지로 용액을 흡착제거한 후 2포스포텅스트산(phosphotungstic acid, pH7.2) 용액으로 매질 염색하였다(Almeida JD et al., Viruses. In : Electron Microscopy in Human Medicine Vol 3 , Infectious Agents. Johannessen JV(eds). McGraw-Hill Inc., NY, pp 3-45(1980)). 염색된 시료를 투과 전자현미경(JE-1200 EX, Joel, Japan)으로 관찰하였다.

도 5a 및 5b는 본 발명의 비리온을 매질 염색한 결과를 보여주는 투과 전자현미경 사진(배율은 각각 125,000 배 및 200,000 배)이다. 도 5a 및 5b에서 보듯이, 비리온은 외피가 있는 구형이고 그 직경은 65±2 ㎚이며 표면에는 길이 12 내지 14 ㎚, 폭 7 내지 8 ㎚의 짧은 돌기물이 격자와 유사한(grid-like) 양상으로 규칙적으로 배열되어 있다. 내부의 전자밀도가 매우 높으며 뉴클레오캡시드는 정20면체이고 직경은 30±1 ㎚이다.

② 감염 세포의 초박막절편(Thin-section)

실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스로 Vero E6 세포단층에 감염시킨 후 6 일째에 고무 폴리스맨(rubber policeman)으로 감염된 세포를 긁어 모으고, 원심분리기(TJ-6 Beckman)를 사용하여 4 ℃에서 986xg로 10 분 동안 원심분리하여 세포를 침전시켰다(Hung T et al., Arch. Virol. 78 , 137-144(1983)). 세포 침전물을 0.01M PBS로 3회 세척한 다음 2글루타르알데하이드로 4 ℃에서 2.5 시간 동안 고정하였다. 이어서 1O _S O ₄ 용액으로 50 분 동안 후고정한 후 50, 70, 90및 100에탄올로 차례로 20 분씩 처리하여 탈수시켰다. 탈수된 시료를 초박막절편기(ultramicrotome)를 사용하여 초박막절편을 만들어 2우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 30 분 동안 염색한 후 투과 전자현미경으로 관찰하였다.

도 5c는 본 발명의 바이러스로 감염된 세포의 초박막 절편의 투과 전자현미경 사진이다. 도 5c에서 보듯이, 비리온은 세포질에서 다량 관찰되며, 이 결과는 도 5a 및 5b의 매질 염색에서 나타난 비리온과 동일하였다.

③ 봉입체

실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스를 Vero E6 세포단층에 MOI 0.1이 되게 감염시킨 후 6 일째 세포를 회수하여 ②에서와 동일한 방법으로 초박막절편을 만들고 ①에서와 동일한 방법으로 매질염색한 다음 투과 전자현미경으로 관찰하였다.

도 5d 및 5e는 본 발명의 바이러스로 감염된 세포의 초박막절편을 매질염색한 결과를 보여주는 투과 전자현미경 사진이다. 도 5d에서 보듯이 세포질에서 무정형(amorphous) 또는 불규칙한 층판성(lamella) 봉입체가 형성되었으며, 도 5e에서 보듯이 미세한 층판성 가닥들로 구성된 봉입체도 형성되었다.

(단계 7) 바이러스의 농축

실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스를 MOI 0.1로 Vero E6 세포단층에 감염시켜 배양한 다음 3회 냉동-해동시킨 후 원심분리기(J2-21 Rotor, Beckman)를 사용하여 4 ℃에서 5,600xg로 30 분 동안 원심분리하고 상청액을 여과지(공경, 220 nm, Millipore)를 사용하여 여과 멸균하여 정화하였다. 얻어진 바이러스 여과액 400 ㎖에 폴리에틸렌 글리콜(PEG, MW 8,000, Sigma)을 최종농도 8, NaCl을 최종농도 0.5M이 되게 가하고 4 ℃에서 4 시간 동안 교반하였다. 이어서 원심분리기(SW 28 Rotor, Beckman)를 사용하여 4 ℃에서 7,900xg로 30 분 동안 원심분리한 다음 침전물을 0.01M PBS 1 ㎖에 부유시켰다(Schmaljohn CS et al., J. Infect. Dis. 148 ,1005-1012 (1983)). 부유액을 30 초 동안 마이크로원심분리한 후 상청액을 바이러스 농축액으로 사용하였다.

(단계 8) 바이러스의 부력 밀도

문헌(Creeth JM et al., Biochem. J . 117 , 879-891(1970); Schmaljohn CS et al., J. Infect. Dis. 148 , 1005-1012 (1983); 및 Kurtyka ZM et al., CRC Handbook of Chemistry and Physics. Weast RC, Astle, MJ & Beyer WH. 68 th ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, D262-D266 (1987-1988))의 방법에 따라 수크로즈(10%,W/W) 및 세슘 클로라이드(15%,W/W) 선형 밀도 구배에서 본 발명의 비리온의 부력 밀도를 다음과 같이 측정하였다.

실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스를 Vero E6 세포단층에 MOI 0.1이 되게 접종하고 20 시간 동안 배양한 다음 메틸-[ ³ H] 방사성 동위원소(비활성; 25 Ci/mmol, Amersham)이 10 Ci/㎖로 첨가된 배지로 교체하고 37 ℃에서 6 일 동안 배양하여 방사능을 표지하였다. 배양액을 단계 7에서와 동일한 방법으로 여과 정화 및 PEG 침전시켜 바이러스 농축액을 얻었다. 이때 대조군은 바이러스를 접종하지 않고 메틸-[ ³ H] 방사성 동위원소가 동일 농도로 첨가된 배지에서 6 일 동안 배양한 후 단계 7에서와 동일한 방법으로 농축하였다.

튜브(Ultra-Clear tube, Beckman)에 1xTNE 용액(0.01 M 트리스, 0.1 M NaCl 및 0.001 M EDTA, pH 7.4)으로 구배를 만들고 수크로즈 또는 CsCl을 중층하고 4 ℃에서 18 시간 정도 정치하여 선형 밀도 구배(수크로즈 10-60, CsCl 15-40)가 되게 한 다음, 바이러스 농축액 및 대조 농축액을 각 구배 상단에 중층하여 원심분리기(SW 41 Rotor, Beckman)를 사용하여 4 ℃에서 197,000xg로 6 시간 동안 원심분리하였다. 이어서 자동분획기(Fraction Collector Model 2110, Bio-Rad)를 사용하여 시험관 바닥부터 0.33 ㎖씩 30 분획을 채취하였다.

각 분획의 바이러스 감염가, 280 ㎚ 파장에서의 흡광도(OD ₂₈₀ ), 굴절률(refractive index) 및 방사능을 측정하였다. 방사능은 각 분획 5 ㎕에 칵테일 용액[Spectrofluor, 톨루엔 100 ㎖ 중에 PPO 10g, Popop 0.125g) 55 ㎖, 톨루엔 415 ㎖, Trition X-100 330 ㎖, 에탄올 200 ㎖] 5 ㎖를 가하고 액체 신틸레이션 계수기(LS 6522V, Beckman)로 5분 동안 측정하였다. 굴절률은 굴절계(Abbe refractometer)로 측정하였고, 부력 밀도는 문헌(Trudel M and Payment P, Ultracentifugation. In: Biotechnology: Application and Research. Chereminisoff, PN & Ferrante LM(eds). Technomic Publishing Co., Lancaster, PA pp 67-81 (1991))의 방법에 따라 계산하였다.

도 6a 및 6b는 각각 선형 수크로즈 밀도 구배 및 선형 CsCl 밀도 구배에서 본 발명의 비리온의 부력 밀도를 나타내는 그래프이다. 도 6a 및 6b에서 보듯이, 본 발명의 비리온의 부력 밀도는 수크로즈 구배와 CsCl 구배에서 각각 1.12 내지 1.15 g/㎖ 및 1.24 내지 1.26 g/㎖이다. 한편, 대조군에서는 감염가와 방사능이 측정되지 않았고, 280㎚에서의 흡광도도 매우 낮았다.

(단계 9) 바이러스 정제

바이러스 배양액을 단계 7에서와 동일한 방법으로 여과 정화 및 PEG 침전시켜 정제한 후 CsCl 선형 밀도 구배(15%)위에 중층하고 원심분리기(SW 41 Rotor, Beckman)를 사용하여 4 ℃에서 197,000xg로 6 시간 동안 원심분리하였다. 멸균된 주사기로 시험관을 뚫어 바이러스가 모여있는 층을 회수하고 투석용 카세트(MWCO 10,000, Pierce)에 넣은 다음 1xTNE 완충용액으로 18 시간 동안 투석하였다. 완충액은 시료의 1,000 배 양으로 사용하고 3회 교환하였다.

비리온을 더 정제하기 위해, 투석하여 얻은 바이러스 용액을 미리 형성시킨 CsCl 구배(50W/W 0.7 ㎖, 30W/W 1.5 ㎖; Trautman R and Brees SS, J. Gen. Microbiol. 27 , 231-239 (1962))위에 중층하고 원심분리기(SW 50.1 Rotor, Beckman)를 사용하여 4 ℃에서 149,000xg로 4 시간 동안 원심분리하였다. 바이러스가 모여있는 층을 회수하여 동일한 방법으로 투석하여 최종적으로 정제하였다. 최종 정제한 바이러스 양이 많을 경우에는 동결건조(lyophilization)하여 농축하였다.

(단계 10) 바이러스 핵산 분석

① 바이러스 핵산의 방사능 표지

실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스를 MOI 0.1로 Vero E6 세포단층에 접종한 후 20 시간 동안 배양한 다음, [ ³² P]오르토포스페이트(비활성 3,000 Ci/mmol,Amersham)가 150 Ci/㎖가 되게 첨가한, 인산나트륨과 중탄산나트륨이 포함되지 않은 둘베코 변형 이글 배지(DME, D3656, Sigma; Schmaljohn CS et al., J. Infect. Dis. 148 , 1005-1012 (1983)로 교체하고 6 일 동안 배양하였다. 그 후 단계 9에서와 동일한 방법으로 실시하여 방사능 표지한 바이러스를 정제하였다. 대조 세포는 바이러스를 접종하지 않고 방사능 표지하였다.

② 바이러스 핵산의 정제

①에서 얻은 방사능표지된 바이러스 및 대조 세포 정제액 150 ㎕를 1.5 ㎖ 용량의 폴리프로필렌 시험관에 넣고 여기에 5SDS가 함유된 1xTNE 완충액 150 ㎕ 씩을 가한 다음 37 ℃ 수조에서 30 분 동안 반응시켜 바이러스 핵산을 유리시켰다. 반응액에 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알콜의 혼합액(부피비 25:24:1)을 동량으로 가하여 잘 혼합한 다음 14,000 rpm으로 30 초 동안 마이크로원심분리하여 핵산을 추출하였다(DiLuca D. et al., Virology 175 , 199-210(1990)). 수용액층(aqueous phase)을 새 시험관에 옮기고 동일한 추출 과정을 2회 반복하여 단백질 혼입을 최소화하였다. 핵산 추출액을 새 시험관에 옮긴 후 여기에 동량의 클로로포름을 가하고 잘 혼합한 다음 동일한 조건으로 마이크로원심분리하여 혼입된 페놀을 제거하였다. 여기에 3 배 부피의 에테르를 가하고 잘 혼합한 후 다시 마이크로원심분리한 다음, 에테르를 음압을 이용하여 증발시키거나 실온에 정치하여 제거하였다. 여기에 차가운 100에탄올을 3 배 부피로 가하고 -20 ℃에서 30 분 내지 1 시간 동안 또는 얼음위에서 2 내지 3 시간 동안 정치하여 핵산을 침전시켰다. 침전된 핵산을 70에탄올로 세척한 후 잔량의 에탄올을 증발시켜 바이러스 핵산을 정제하였다.

③ 핵산형과 크기

②에서 정제된 바이러스 핵산을 1xTE 완충액(Tris 10 mM, pH 7.5; EDTA 1 mM)에 1 ㎍/㎕가 되게 용해시킨 후, 제조회사의 지침서에 따라 RNase 부재의 DNase I(10,000 단위/㎖, Boehringer Mannheim)과 DNase 부재의 RNase(500 ㎍/㎖, Boehringer Mannheim)를 사용하여 표 3에 기재된 조성비의 반응 혼합물 중에서 소화시켰다. 이때 DNase I을 사용한 반응 혼합물은 25 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰으며, 다른 혼합물은 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다.

바이러스 핵산의 DNase I 및 RNase 소화 반응을 위한 반응 혼합물(단위: ㎕)

반응	시료	RNase	DNase I	1M 소디움 아세테이트(최종 0.1M)	50 mM MgCl 2 (최종 5mM)	증류수	6x로딩 완충액
1	분자량 표지	-	-	-	-	10	5
2	바이러스 핵산 5 ㎕	-	-	-	-	10	5
3	바이러스 핵산 5 ㎕	5	-	-	-	5	5
4	바이러스 핵산 5 ㎕	-	5	2	2	1	5
5	대조세포의 추출물 10㎕	-	-	-	-	5	5

반응 후 제조회사의 지침서에 따라 반응 혼합물 20 ㎕를 1.0저융점 아가로스(Pulsed Field Certified Agarose, Bio-Rad) 겔에 로딩하고 0.5xTBE 완충액(89 mM Tris, 98 mM Borate, 0.001M EDTA(pH 8.0))으로 14 ℃, 90 V(6 V/cm), 제 2 스위치 시간(second switch time) 50 내지 90 초, 120°의 각도로 20 내지 24 시간 동안 전기영동하였다. 이때 전기영동기는 펄스 필드 겔 전기영동기(Pulsed Field Gel Electrophoresis, CHEF-DR II, Bio-Rad)를, 분자량 표지로는 펄스표지(Pulsed Marker, 0.1 내지 200 kb, 0.5 ㎍/20 ㎕, Sigma)를 사용하였다

도 7a는 반응 혼합물의 펄스 필드 겔 전기영동 결과를 보여주는 겔 사진이다. 도 7a에서 제M열은 펄스 표지이고, 제1열은 소화되지 않은 바이러스 핵산이며, 제2열은 RNase로 소화된 바이러스 핵산이고, 제3열은 DNase I으로 소화된 바이러스 핵산이며, 제4열은 대조세포의 추출물이다. 도 7a에서 보듯이, 본 발명의 바이러스 핵산은 단일 DNA 분자이고 그 크기는 약 145 kbp 였다.

④ 오토라디오그래프(autoradiograph)

문헌(Laskey RA. Radioisotope detection using X-ray film, In : Radioisotopes in Biology, A Practical Approach . Slater RJ ed, IRL Press, Oxford, pp 87-107 (1990))의 방법에 따라, ②에서 정제된 바이러스 핵산을 [ ³² P]로 표지한 후 ③에서와 동일한 방법으로 펄스 필드 겔 전기영동하고 겔을 건조시킨 다음 감도강화 스크린(intensifying screen)위에 올려놓고 그 위에 X-선 필름(X-OMATAR, Kodak)을 올려놓은 후 -20 ℃에서 2 내지 3 시간 동안 감광시켜 오토래디오그래피하였다.

도 7b는 펄스 필드 겔 전기영동된 바이러스 핵산의 오토래디오그래피 결과를 보여주는 사진이다. 도 7b에서 제1열은 [ ³² P]-표지된 바이러스 핵산이며, 제2열은 [ ³² P]-표지된, 바이러스로 감염되지 않은 Vero E6 세포 추출물이다. 도 7b에서 보듯이, 본 발명의 바이러스 핵산은 약 145 kbp이고, 이러한 결과는 ③의 펄스 필드 겔 전기영동에서와 동일하다.

⑤ 핵산의 형상

본 발명의 바이러스 DNA의 형상을 조사하기 위하여, 폴리라이신이 처리된 탄소 필름(polylysine-treated carbon film)을 이용한 매질 염색(Williams RC. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 , 2311-2315 (1977))과 백금(platinum)을 이용한 회전투영(rotary shadowing)법(Griffiith J. et al., J. Mol. Biol. 55 , 209-214 (1971))을 사용하여 다음과 같이 실험하였다.

폼바가 코팅된 400-메쉬 그리드에 얇은 탄소층을 입히고 45 ℃에서 1 시간 동안 정치한 다음 폴리 L-라이신(분자량 2,000, Sigma) 용액(0.7 l/ml D/W)으로 다시 코팅하고 45 ℃에서 5 분 동안 건조시켜 폴리 라이신이 처리된 탄소 필름을 얻었다. ②에서 얻은 바이러스 핵산을 10 mM MgCl ₂ 이 함유된 1xTE 완충액에 1.0 ㎍/㎖가 되게 용해시킨 후 이 용액 6 ㎕를 폴리라이신이 처리된 탄소 필름에 가하고 실온에서 60 초 동안 흡착시켰다. 이어서 증류수 4 내지 5 방울로 5회 연속하여 배수 세척(drain washing)한 다음 5우라닐 아세테이트 5 ㎕를 가하여 30 초 동안 염색하였다. 염색 후 증류수 2 내지 3 방울로 린스하여 우라닐 아세테이트를 제거하고 건조시켰다. 건조된 그리드를 회전기기(rotary)에 놓고 10 ^-6 Torr 하에서 60 rpm으로 회전시키면서 백금선(길이 10 cm, 직경 0.1 nm)을 8°각도로 비스듬하게 하여 시료와의 거리가 9.5 cm 되게 고정한 후 전압을 올려 백금이 녹는 상태에서 5초 동안 유지하다 전압을 2배로 올려 10초 정도 유지하였다. 이를 투과 전자현미경으로 관찰하였다.

도 7c는 본 발명의 바이러스 핵산의 투과 전자현미경 사진이다. 도 7c에서 보듯이, 본 발명의 바이러스 핵산은 선형 이중가닥이고, 그 폭은 4.3±0.5 ㎚이다.

또한, 단계 7에서와 동일하게 여과 정화하여 얻은 바이러스 배양상청액을 원심분리기(Ti 75 Rotor)를 사용하여 104,000xg로 원심분리하여 바이러스를 농축한 후 단계 6의 ①에서와 동일하게 매질 염색한 후 시료에서 자연적으로 파괴된 비리온에서 누출되어 흘러나온 바이러스 핵산을 촬영하였다.

도 7d는 본 발명의 비리온에서 누출된 핵산의 사진이다. 도 7d에서 보듯이 본 발명의 바이러스의 핵산은 이중가닥 핵산의 전형적인 지그자그 패턴(zig-zag pattern)을 가진다.

(단계 11) 바이러스 구조 단백질의 분석

① 바이러스 구조 단백질의 방사능 표지

실시예 1의 단계 3에서 얻은 바이러스를 MOI 0.1이 되게 Vero E6 세포 단층에 접종한 후 20 시간 동안 배양한 다음 [ ³⁵ S]-메티오닌(비활성; 1,000 Ci/mmol, Amersham)을 10 Ci/ml이 되게 첨가한, L-시스테인, L-메티오닌 및 중탄산 나트륨이 첨가되지 않은 DME 배지(D3916, Sigma)에서 6 일 동안 배양하여 단백질을 방사능표지하였다(Green M. et al., Virology 20 , 199-207 (1963)). 대조 세포는 바이러스를 접종하지 않고 동일한 조건으로 배양하였다. 이때 L-시스테인(Sigma)은 0.0313 g/ℓ가 되게 용액을 만들어 배지에 첨가하였으며 배양액의 pH는 7.2가 되게 조정하였다.

② 단백질 정제

①에서 얻은 배양액을 단계 9에서와 동일한 방법으로 정제한 다음, 정제액 150 ㎕를 1.5 ㎖ 용량의 폴리프로필렌 튜브에 넣고 여기에 5SDS와 42-머캅토에탄올이 함유된 0.5M Tris-HCl(pH 6.7) 용액을 동량으로 가하고 37 ℃ 수조에서 1 시간 동안 처리하여 비리온을 파괴시켰다. 여기에 차가운 황산암모늄 포화 용액을 3 부피로 가하고 볼텍스한 다음 0 ℃에서 1 시간 동안 정치하였다. 얻어진 용액을 원심분리기(Universal 16R, Hettich, Germany)를 사용하여 4 ℃에서 13,000 rpm으로 30 분 동안 원심분리한 다음 상청액을 버리고 다시 13,000 rpm으로 30 초 동안 원심분리하여 남아있는 여액을 제거하고 단백질 침전물을 얻었다. 단백질 침전물을 완충용액 B(NaCl 29g, 1M Tris-HCl pH 7.4 10 ㎖, 1M MgCl ₂ 10 ㎖, 2-머캅토에탄올 10 ㎖ 및 Triton X-100 1 ㎖를 증류수 1000 ㎖에 가하여 만듦) 20 ㎕에 부유시켰다(Green M. et al., Virology 20 , 199-207 (1963); 및 Robertson D et al., Extraction of recombinant protein from Escherichia coli. In : Manipulation of Recombinant DNA . Robertson D. Shore S & Miller DM(eds). Academic Press, San Diego, pp 117-123 (1997)).

③ 구조 단백질의 종류 및 분자량

②에서 얻은 단백질 시료를 5x시료 완충용액(0.5M Tris(pH 6.8) 3 ㎖, SDS 1g, 글리세롤 5 ㎖, 브로모페놀블루(1) 0.5 ㎖, 증류수로 10 ml이 되게 함) 및 2-머캅토에탄올과 부피비 15:4:1로 혼합한 후 95 ℃에서 5 분 동안 가열하여 단백질을 변성시켰다. 이 시료 20 ㎕를, 12분리 겔(separation gel; 아크릴아미드 30(bis)(29:1))과 3스태킹 겔(stacking gel; 증류수 3.2 ㎖, 0.5M Tris(pH 6.8) 1.25 ㎖, 30아크릴아미드(bis)(29:1) 0.5 ㎖, 10SDS 50 ㎕, 10암모니움 퍼설페이트 50 ㎕, TEMED 10 ㎕)로 된 SDS-PAGE 미니 겔(Laemmli UK. Nature 227 , 680-685 (1970))에 로딩한 후 전개 완충용액(gel running buffer; Tris base 3.2g, 글리신 14.4g, SDS 1g, pH 8.3)이 들어있는 탱크에 넣고 겔 두께 0.75 ㎜ 당 100 V의 전압을 가하여 브로모페놀블루가 분리 겔 내로 완전히 들어간 때에 200 V로 올려 4 시간 동안 전기영동하였다(Mini-Protean II Electrophoresis Cell, Bio-Rad). 단백질의 분자량 표지로는 SDS-PAGE 표준물질(standards, Broad range, Bio-Rad)를 사용하였다. 전기영동 후 겔을, 여과지(Whatman paper)로 여과한 염색액(메탄올 40 ㎖, Serva blue G 0.05g을 녹인 초산 10 ㎖, 증류수 50 ㎖)에 담그고 쉐이커(Rocker CR300, Finemould Precision)를 사용하여 실온에서 흔들어주면서 18 시간 동안 염색하였다. 이어서 겔을 탈염색액(메탄올 40 ml, 초산 5 ㎖, 증류수 50 ㎖)에 담그고 흔들어주어 탈색하였으며, 1 시간 간격으로 새로운 탈색액으로 3회 교환하였다. 탈색된 겔을 저장액(에탄올 10 ㎖, 초산 5 ㎖, 증류수 85 ㎖)에 하루 정도 담그어 안정화시킨 후 겔 건조기(gel dryer)를 사용하여 80 ℃에서 건조시켰다. 각 단백질의 분자량은 표지 단백질의 분자량을 기준으로 이미지 게이지(Image Gauge, Version 3.12, Science Lab 98, Fujifilm)를 이용하여 컴퓨터로 계산하였다.

도 8a는 본 발명의 바이러스의 단백질의 SDS-PAGE 결과를 보여주는 겔 사진으로, M열은 표준 단백질 분자량 표지이고, 제I열은 바이러스로 감염된 세포의 단백질 시료이며, 제U열은 바이러스에 감염되지 않은 대조 세포의 단백질 시료이다. 도 8a에서 보듯이, 총 23개의 단백질 밴드가 나타났으며, 이들의 분자량은 15.5 kDa 내지 257.7 kDa 범위이었다.

④ [ ³⁵ S]-메티오닌이 표지된 단백질 분석

바이러스 구조 단백질을 조사하기 위하여, ①에서와 동일한 방법으로 [ ³⁵ S]-메티오닌이 포함된 배지 중에서 배양하여 [ ³⁵ S]-메티오닌으로 방사능 표지된 단백질 시료를 정제하고 ③에서와 동일한 방법으로 SDS-PAGE를 수행한 다음, SDS-PAGE 겔과 막(Hybond C extra paper, Amersham Life Science)를 블롯팅 완충액(글리신 39 mM, Tris base 48 mM, SDS 0.037, 메탄올 20, 증류수로 1,000 ㎖ 되게 함)에 5분 동안 넣어 평형화시킨 다음 여과지(3M Whatman paper)위에 막(Hybond C paper)과 겔을 차례로 올려놓은 후 여과지(3M Whatman paper)로 덮었다. 이를 카세트에 전류의 방향을 맞추어 끼우고 트랜스-블롯 셀(Trans-Blot cell, Bio-Rad)에 장치한 다음 블롯팅 완충용액을 카세트가 잠기도록 채우고 바닥에 막대자석을 넣어 교반기 위에 놓고 180 ㎃의 전류를 3 시간 동안 가하여 전이되도록 하였다(Zoller L et al., J. Med. Virol. 27 , 231-237(1989)). 막을 건조시킨 후 감도강화 스크린위에 놓고 X-선 필름(X-OMATAR, Kodak)를 얹어 3일 동안 감광시켜 오토래디오그래피하였다. 단백질 분자량 표지로는 미리 염색된 SDS-PAGE 표준물질(Standards, range,Bio-Rad)를 사용하였다.

도 8b는 [ ³⁵ S]-메티오닌이 표지된 구조 단백질을 오토래디오그래피한 결과를 보여주는 사진으로, M, I 및 U의 의미는 도 8a와 같다. 도 8b에서 보듯이, 본 발명의 바이러스의 구조 단백질은 총 18 종류이고 이들의 분자량은 22.9 kDa 내지 202.4 kDa의 범위였다. 바이러스로 감염되지 않은 대조 Vero E6 세포에서는 방사능 표지된 단백질이 관찰되지 않았다.

도 8a 및 8b의 결과를 종합하면, 도 8a에서 서바 블루 G(Serva blue G)로 염색된 23개의 단백질 중 5개의 단백질 a, b, c, d 및 e는 숙주 세포인 Vero E6에서 유래된 것으로 보이며 나머지 18 개의 단백질은 본 발명의 바이러스의 구조단백질로 추정된다.

⑤ 항원 단백질

④에서 확인된 18종의 구조 단백질 중 항원성이 있는 단백질을 조사하기 위해 웨스턴 블롯팅 법(Zoller L et al., J. Med. Virol. 27 , 231-237(1989))을 다음과 같이 실시하였다.

①에서와 동일한 방법으로 바이러스 단백질 시료를 정제하고 ③에서와 동일한 방법으로 SDS-PAGE시키고 얻어진 겔을 니트로셀룰로즈 막(Hybond C paper)에 전이하였다. 얻어진 막을 차단 용액(TBST 용액(Tris-HCl(pH 8.0) 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0.05)에 탈지분유 5, 젤라틴 0.5, 나트륨산(Sodium acid) 0.05를 가하여 얻음)에 30 분 정도 담그어 비특이적 반응 부위를 차단시켰다. 차단 후 1차항체(primary antibody)로 실시예 1의 단계 1에서 얻은 회복기 환자 혈청(시료번호 1846)을 1:200로 희석하여 막에 골고루 가하고 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 후 1xTBST 용액으로 10 분 간격으로 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 여기에 HRP(horse radish peroxidase)가 콘주게이트된 면양 항-인간 IgG F(ab') ₂ (Amersham Life Science)를 1:3,000로 희석시킨 희석액을 가하여 실온에서 30 분 동안 반응시킨 후 1xTBST로 10분 간격으로 3회 세척하였다. 이어서 암실에서 막 위에 ECL 혼합용액(ECL1 1 ㎖ + ECL2 1 ㎖, Amersham Life Science)으로 골고루 도포한 후 5초 정도 반응시킨 다음 핀셋으로 한쪽 끝을 집어 세우고 남은 ECL 용액을 제거하고 카세트에 고정하고 X-선 필름에 감광시켰다.

도 8c는 본 발명의 바이러스 구조 단백질을 사용한 웨스턴 블랏 결과를 보여주는 사진이다. 도 8c에서 보듯이, 분자량이 72.1 kDa, 55.7 kDa, 52.6 kDa 및 50.1 kDa인 4 종의 구조 단백질이 회복기 환자 혈청내 항체와 반응하였다. 이로부터 4종의 단백질이 항원성을 가짐을 알 수 있다.

(단계 12) 바이러스의 물리화학적 특성

바이러스의 물리화학적 성상으로, pH, 온도 및 유기용매에 대한 본 발명의 바이러스의 안정성(stability)을 조사하였다(Burleson FG et al., Virology. A Laboratory Manual. Academic Press, New York, pp 111-120 (1992)).

① pH 감수성

실시예 1의 단계 3에서 얻은 종균 바이러스(1.4x10 ^6.9 TCID ₅₀ /ml) 0.2 ㎖를 pH 5.0, 6.0, 7.2 및 9.0으로 조정된 인산염 완충액 1.8 ㎖에 각각 가하고 잘 혼합한 다음 실온에서 24 시간 동안 방치하면서 4 시간 간격으로 참조예 2의 방법에 따라 바이러스 감염가를 측정하였다.

도 9a는 pH에 따른 본 발명의 바이러스의 안정성을 나타내는 그래프이다. 도 9a에서 보듯이, 본 발명의 바이러스의 감염가는 pH 5.0 이하의 산성 조건하에서는 1 시간내에 소실되었고, pH 6.0 조건하에서는 12 시간 경과시 1/2로 감소하였으며, pH 7.2 조건하에서는 비교적 높았으며, pH 9.0 조건하에서는 점진적으로 감소하지만 산성 pH에서보다는 안정하였다. 따라서 본 발명의 바이러스는 산성에서는 불안정함을 알 수 있다.

② 열에 대한 안정성(thermostability)

실시예 1의 단계 3에서 얻은 종균 바이러스를 30 개의 시험관에 0.5 ㎖씩 분주한 후, 1 그룹에 시험관 6개씩 모두 5 그룹으로 나누어 -20 ℃, 4 ℃, 20 ℃, 37 ℃ 및 56 ℃의 온도에 노출시키면서, 4, 8, 12 및 24 시간이 경과한 때에 각 그룹의 시험관 1 개씩을 회수하여 -80 ℃에서 ____ 일 동안 보존한 다음 참조예 2의 방법에 따라 감염가를 측정하였다. 각 그룹에서 1개의 시험관은 분주 후 즉시 -80 ℃에 보존하여 대조군으로 사용하였다.

도 9b는 온도에 따른 본 발명의 바이러스의 안정성을 나타내는 그래프이다. 도 9b에서 보듯이, 본 발명의 바이러스는 -20 ℃와 4 ℃에서 높은 안정성을 보이나, 20 ℃와 37 ℃에서는 노출 시간이 증가함에 따라 안정성이 점진적으로 감소되어 24 시간 경과시 3 log의 감염가가 감소되고, 56 ℃에서는 30 분 노출에 의해 4 log의 감염가가 감소되는 등 급격하게 불활화되었다.

③ 유기용매에 대한 저항성

디에틸에테르(ACS grade, International Specificity Chemicals), 클로로포름(Junse: Chemical Co.), 중성 포르말린(CAS 30.03 M; 포르말린을 증류수에 10가 되게 가하여 얻음) 등의 각 유기용매 0.5 ㎖를 1.5 ㎖용 폴리프로필렌 시험관에 넣고, 여기에 실시예 1의 단계 3에서 얻은 종균 바이러스 1.0 ㎖씩을 가하여 잘 혼합하였다. 유기용매 대조군은 종균 바이러스 대신 배지를 가하였고, 바이러스 대조군은 유기용매 대신 배지 0.5 ㎖를 넣고 실시예 1의 단계 3에서 얻은 종균 바이러스 1.0 ㎖를 가하였다. 각 혼합액을 10 분 간격으로 흔들어 주면서 90 분 동안 반응시켰으며, 15 분 간격으로 시료를 회수하여, 참조예 2의 방법에 따라 감염가를 측정하였다.

도 9c는 유기 용매에 대한 본 발명의 바이러스의 안정성을 나타내는 그래프이다. 도 9c에서 보듯이, 본 발명의 바이러스는 에테르, 클로로포름 또는 중성 포르말린 용액에 노출되면 20 분 이내에 감염가가 소실되어, 유기용매에 대한 저항성이 매우 낮았다.

④ 청정제에 대한 저항성

1SDS 등의 청정제를 37 ℃에서 30 분 동안 처리한 후 실시예 2의 단계 6의 ①과 동일하게 매질 염색하여 전자현미경으로 관찰하였다.

도 9d는 1SDS에 의해 파괴된 비리온을 보여주는 전자현미경 사진이다. 이러한 결과로부터 본 발명의 바이러스는 SDS 등의 청정제에 대한 저항성이 매우 낮음을 알 수 있다.

(단계 13) 바이러스의 병인성(pathogenesis)

본 발명의 바이러스 감염에 의한 급성 출혈열 환자 기록(4명)과 한탄 바이러스 감염에 의한 신증후 출혈열 환자 기록(5명)을 비교 분석하였다. 이때 환자는 바이러스성 급성 출혈열을 앓은 환자 중에서 (1) 바이러스가 분리되고, (2) 짝 혈청(paired sera)에서 각 바이러스 항원에 대한 특이적인 IgG 항체가가 최소 3배 이상 증가하였으며, (3) 각 바이러스 항원에 특이적인 IgM 항체가 검출되고, (4) 리켓치아( R.typhi, R.tsutsugamushi ) 및 렙토스피라에 대한 항체 음성으로 본 발명의 바이러스 항원 또는 한탄 바이러스 항원에만 항체 양성인 환자(본 발명의 바이러스 항원과 한탄 바이러스 항원 모두에 항체 양성인 환자는 제외)를 선정하였다. 이 환자들의 기록은 하기 표 4 및 5와 같다.

본 발명의 바이러스 감염에 의한 급성 출혈열 환자 4명의 기록

환자	발병전 야외작업 기간(일)	감염된 월/년도	발증전 증상	바이러스 분리	중화항체가	IgG 항체 증가 또는 IgM 검출
번호							성별	연령
1	남 *	22	8	11/1993	감기	+	1:80	4배 증가
2	남	22	3	11/1993	감기	-	1:320	5배 증가
3	남	20	6	11/1993	없음	-	1:40	IgM 검출
4	남	21	6	7/1995	없음	-	-	3배 증가
* 본 발명의 바이러스가 분리된 환자의 혈청(93/90)

한탄 바이러스 감염에 의한 신증후 출혈열 환자 5명의 기록

환자	발병전 야외작업 기간(일)	감염된 월/년도	발증전 증상	바이러스 분리	중화항체가	IgG 항체 증가 또는 IgM 검출
번호							성별	연령
1	남	22	3	10/1987	감기	+	1:320	5배 증가
2	남	22	2	10/1987	상기도 감염증	+	1:640	3배 증가
3	남	21	14	11/1988	감기	-	1:160	4배 증가
4	남	22	없음	11/1997	없음	-	-	IgM 검출
5	남	22	21	10/1997	없음	_	1:320	4배 증가

① 본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스의 특성 비교

본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스(한타바이러스 속의 원형 바이러스, Murphy FA et al., Key to the placement of viruses in Taxa. In: Virus Taxonomy- The classification and nomenclature of viruses : Sixth Report of the International Committee on Taxonomy Viruses. Springer-Verlag, Wien pp 30-38(1995))의 특성을 비교하여 표 6에 나타내었다. 두 바이러스의 여러 특성을 비교 분석하는 것은 환자의 진료, 치료, 진단 및 예방에 중요한 자료가 된다.

본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스의 특성 비교

특성	본 발명의 바이러스	한탄 바이러스
비리온	구형(직경 약 65 ㎚)뉴클레오캡시드: 정20면체 대칭(직경 약 30 ㎚)	구형,사상(filamentous)형(직경 80-120 ㎚)나선 대칭
핵산	DNA분절되지 않음,선형 이중 가닥, 145 kbp	RNAL, M, S의 3개 분절(segment)로 이루어짐,단일 가닥, 총11.8 kb
외피	있음	있음
증식 부위	세포질	세포질
세포 병변	다핵 거대 세포 형성,세포 융합	없음
물리화학적 특성	산 및 열에 저항성이 약함.유기용매 및 청정제에 민감함.	산 및 열에 저항성이 약함.유기용매 및 청정제에 민감함.
바이러스과	미확인	번야비리대(Bunyaviridae), 한타바이러스 속
급성 출혈열	일으킴	일으킴
자연 숙주동물	-	흰 등줄쥐, 집쥐 등 설치류와 박쥐

② 본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스에 의한 출혈열의 임상 증상 비교

본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스에 감염시 발증하는 임상 증상을 비교하여 하기 표 7에 나타내었다.

임상증상	본 발명의 바이러스에 의한 급성 출혈열	한탄 바이러스에 의한 신증후 출혈열
	빈도()	평균지속기간(일, 범위)	빈도()	평균지속기간(일, 범위)
고열/오한	100	6.3(5-7)	100	6.4(2-7)
두통	100	4.0( 3-6)	100	5.2(2-9)
피부발진	100	3.3(2.8-4.0)	100	1.2(1.2-1.8)
측복부통증	75	1.8(0-4)	100	5.4(1-11)
요통	75	0.5(0-1)	100	5.8(3-10)
복통	75	3.3(0-6)	80	4.0(0-9)
인후통	75	2.5(0-6)	0	0
현기증	75	1.0(0-2)	60	1.0(0-3)
안면 홍조	50	1.0(0-2)	80	4.4(0-8)
구역질	50	1.3(0-4)	80	2.2(2-5)
구토	25	0.8(0-3)	80	2.2(2-5)
설사	50	2.5(0-5)	0	0
기침	50	4.3(0-11)	20	1.0(0-5)
잠복기	-	7-10	-	10-14
평균 입원기간	-	35.3(13.-79)	-	53.0(18-116)

표 7에서 보듯이, 두 질환 모두에서 고열, 오한, 두통이 갑자기 발증한 다음 점점 악화되었다. 9 명의 환자 기록부를 조사하여 고열, 오한, 두통이 발증한 날을 0 일로 하고 그 전 3 주간의 야외작업 기간과 발증하기까지의 기간을 고려하여 각 증상의 지속기간과 잠복기를 계산하였다. 조사대상자 9명의 환자 기록부에서 자가 면역질환, 악성종양, 만성질환 및 유전적 질환 등에 대한 기록을 찾을 수 없었다.

표 6 및 7에서 보듯이, 본 발명의 바이러스에 의한 급성 출혈열과 한탄 바이러스에 의한 신증후 출혈열은 잠복기, 입원기간, 증상의 출현 빈도 및 지속기간 등에 차이를 보인다.

(단계 14) 검사실 및 이화학적 소견 비교

본 발명의 바이러스에 의한 급성 출혈열을 나타내는 9 명의 환자 기록부에서, 활력 징후(vital sign)중 체온과 혈압, 혈액검사, 생화학 검사, 전해질 검사, 요검사(Bauer JD, Clinical Laboratory Method , 9th ed. The CV Mosby Company, St. Louis (1982)) 등의 소견을 신증후 출혈열(Lee JS et al., Clinical manifestation and treatment of HFRS and HPS. In : Manual of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and Hantavirus and Pulmonary Syndrome . Lee HW, Calisher C & Schmaljohn C (eds). WHO Collaborating Center for Virus Reference and Research(Hantavirus). Asan Institute for Life Science, Seoul. pp 18-38(1998))과 비교하였다. 신증후 출혈열 환자 1명은 검사 소변이 충분하지 않아 제외시켰다.

① 체온

본 발명의 바이러스에 의한 급성 출혈열과 한탄 바이러스에 의한 신증후 출혈열 환자의 체온을 표 7과 도 10a 및 10b에 나타내었다. 도 10a 및 10b는 각각 본 발명의 바이러스 및 한탄 바이러스에 감염된 환자의 체온 변화를 나타내는 그래프이다. 표 7 및 도 10a 및 10b에서 보듯이, 두 질환 모두에서 감염 후 발증 초기에는 39 ℃ 이상의 고열이 평균 6 일 정도 지속되는 발열기(febrile phase)를 보이며, 두 질환은 발열기의 지속기간의 차이가 없었다. 그러나, 신증후 출혈열의 경우 발열기 후 체온의 변화가 심하지 않았으나, 본 발명의 바이러스에 의한 출혈열에서는 37.5 ℃의 미열이 7 내지 10 일간 지속되었다.

② 혈압

두 질환의 환자 중에서 혈압 변화가 뚜렷한 환자 1 명씩을 선정하여 혈압을 비교하였으며, 그 결과는 도 10c에 나타내었다. 도 10c에서 보듯이, 두 질환 모두 발증 초기에는 저혈압기(hypotension phase)를 나타내며, 이 기간은 신증후 출혈열의 경우 5 내지 7 일 정도 지속되었으나 본 발명의 바이러스에 의한 급성 출혈열의 경우에는 2 내지 3 일로 짧았다. 또한 신증후 출혈열은 발증 후 9 일경부터 고혈압기(hypertension phase)가 시작되어 3 내지 4 일 지속된데 비하여, 본 발명의 바이러스에 의한 급성 출혈열의 경우에는 발증 후 6 일경부터 고혈압기가 시작되어 4 내지 5 일 정도 지속되었다.

③ 혈색소(Hb:hemoglobin)

도 11a 및 11b는 각각 본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스로 감염된 환자의 혈색소 변화를 나타내는 그래프이다. 도 11a 및 11b에서 보듯이, 본 발명의 바이러스 감염 환자의 혈색소 값은 질병이 경과할수록 낮아졌으나 정상범위내였으며, 한탄 바이러스 감염 환자의 혈색소 값은 정상 범위내의 낮은 한계값(low limit)을 보였다.

④ 혈소판(platelet)

도 11c 및 11d는 각각 본 발명의 바이러스 및 한탄 바이러스로 감염된 환자의 혈소판 변화를 나타내는 그래프이다. 도 11c 및 11d에서 보듯이, 본 발명의 바이러스에 감염된 환자는 혈소판 값은 감소하였으나 정상범위 내였고, 신증후 출혈열 환자는 발증 후 10일까지 낮았다.

⑤ 혈액 뇨질소(BUN)와 크레아티닌(Creatinine)

도 12a 및 12b는 각각 본 발명의 바이러스로 감염된 환자의 BUN 및 크레아티닌 변화를 나타내는 그래프이고, 도 12c 및 12d는 각각 한탄 바이러스로 감염된 환자의 BUN 및 크레아티닌 변화를 나타내는 그래프이다. 도 12a 내지 12d에서 보듯이, 본 발명의 바이러스로 감염된 환자 중 한 예에는 발증후 8 일경까지 BUN과 크레아티닌 값이 높았지만 다른 예들에는 정상범위 내였으며, 신증후 출혈열의 경우에는 발증 후 10일경까지 BUN과 크레아틴 값이 매우 높았다.

⑥ 전해질(electrolyte) 농도

출혈열 환자의 혈액내 전해질 농도는 환자 치료시 매우 중요한 지표로 활용되고 있다.

도 13a 내지 13c는 각각 본 발명의 바이러스로 감염된 환자의 혈중 Na, K 및 Cl 변화를 나타내는 그래프이고, 도 13d 내지 13f는 한탄 바이러스로 감염된 환자의 혈중 Na, K 및 Cl 변화를 나타내는 그래프이다. 도 13a 내지 13f에서 보듯이, 본 발명의 바이러스로 감염된 환자의 혈중 Na 이온농도는 정상범위이거나(3개 예) 발증후 9일까지 낮았고(한 예), K 이온은 정상범위 내였으며, Cl 이온은 한 예에선 높았지만 3개 예에서는 정상범위 내인데 반하여, 신증후 출혈열은 발증 후 9 일까지 Na 이온농도가 낮았으나 K 이온은 정상범위 내였고, Cl 이온농도는 발증 후 7일 내지 11일까지 낮았다.

⑦ 요검사(urinalysis)

정상인의 소변에서는 적혈구(RBC), 백혈구(WBC) 및 알부민(albumin)이 검출되지 않거나 극미량이 검출되지만, 급성 출혈열은 환자의 소변에서 다량의 적혈구, 백혈구 및 알부민이 검출되는 것이 특징이다. 신증후 출혈열의 요검사 소견(Lee JS et al., 상기 문헌)도 참고하였다.

i) 소변내 적혈구, 백혈구 및 알부민

도 14a 내지 14c는 각각 본 발명의 바이러스로 감염된 환자의 적혈구, 백혈구 및 알부민 농도를 나타내며, 도 14d 내지 14e는 한탄 바이러스로 감염된 환자의 적혈구, 백혈구 및 알부민 농도를 나타낸다. 도 14a 내지 14f에서 보듯이, 본 발명의 바이러스로 감염된 환자의 소변내 적혈구와 알부민은 신증후 출혈열 환자의 경우보다 적은데 반해, 소변내 백혈구는 신증후 출혈열 환자의 경우보다 많았다. 본 발명의 바이러스 감염 환자의 한 예에선 적혈구 배출이 이상성(diphasic) 양상을 보인다.

ii) 일일 소변양

도 15a 및 15b는 각각 본 발명의 바이러스 및 한탄 바이러스로 감염된 환자의 일일 소변량을 나타내는 그래프이다. 도 15a 및 15b에서 보듯이, 두 질환 모두에서 발증 초기에는 일일 소변양이 감소되는 핍뇨기(oligouric phase)가 있으나, 이 기간은 본 발명의 바이러스 감염시엔 평균 4일인데 비하여 신증후 출혈열의 경우에는 평균 6일로 길었다. 신증후 출혈열은 발증후 6일 내지 9일(평균 7.5일)경부터 뇨붕증(diuretic phase)이 관찰되는데 비해 본 발명의 바이러스 감염시에는 발증후 11 일경부터 뇨붕증기가 관찰되나 신증후 출혈열의 경우보다 그 정도가 약했다.

(단계 15) 역학(epidemiology)

본 발명자가 수집한 혈청시료들을 사용한 역학 자료는 다음과 같다.

① 1988년부터 1997년까지의 항체 양성율

1988년부터 1997년까지 신증후 출혈열로 의심되어 국군 수도 통합 병원에 입원한 환자 혈청을 대상으로 연도별로 한탄 바이러스, 본 발명의 바이러스, 리켓치아 타이피( R. typhi ), 리켓치아 쭈쭈가무시( R. tsutsugamushi )에 대한 항체 양성율을 참조예 1의 간접 면역 형광 항체법에 따라 조사하였다. 이때 IFA 항체가가 1:20 이하인 경우는 음성으로 판정하였다. 그 결과는 하기 표 8과 같다.

한탄 바이러스, 본 발명의 바이러스, 리켓치아 타이피 및 리켓치아 쭈쭈가무시 항원에 대한 항체 양성율 비교()

연도	한탄 바이러스	본 발명의 바이러스	리켓치아 타이피	리켓치아 쭈쭈가무시	총계
1988	81(81.8)	0(0.0)	2(2.0)	5(5.0)	99
1989	73(91.3)	0(0.0)	0(0.0)	1(1.3)	80
1990	57(80.3)	1(1.4)	2(2.8)	2(2.8)	71
1991	43(63.2)	4(5.9)	1(1.5)	1(1.5)	68
1992	39(69.6)	2(3.6)	0(0.0)	1(1.8)	56
1993	99(65.6)	16(10.6)	3(2.0)	7(5.1)	151
1994	75(65.8)	17(14.9)	0(0.0)	1(1.3)	114
1995	39(61.9)	6(9.5)	0(0.0)	1(1.6)	63
1996	22(55.0)	12(30.0)	0(0.0)	1(2.5)	40
1997	10(58.8)	4(23.5)	0(0.0)	0(0.0)	17
총계	538(70.9)	62(8.2)	8(1.1)	20(2.6)	759

표 8에서 보듯이, 본 발명의 바이러스에 의한 급성 출혈열 환자가 1990 년도부터 발생하여 매년 증가하고 있는데 비하여 한탄 바이러스에 의한 신증후 출혈열 환자는 감소하고 있다.

② 발생빈도

발생 빈도를 조사하기 위해, 1997년 10월부터 1998년 9월까지 강남 성모병원 혈청 검사실에 의뢰된 일반 시민 혈청 2,293건을 대상으로 본 발명의 바이러스 및 한탄 바이러스(76/118 strain)의 항체 양성율과 남녀 성별 양성율을 참조예 1의 간접 면역 형광 항체법에 따라 조사하였다. 이때 중복된 혈청은 제외시켰으며, IFA 항체가가 1:20 이하인 경우는 음성으로 판정하였다. 그 결과는 하기 표 9와 같다.

월별 본 발명의 바이러스 항체 양성율과 남녀 성비

연도/월	남	여	총계
1997/ 10	35/104	34/97	69/201
1997/ 11	34/99	28/99	62/198
1997/ 12	17/106	19/90	36/196
1998/ 1	6/112	7/86	13/198
1998/ 2	15/108	14/92	29/200
1998/ 3	16/107	6/89	22/196
1998/ 4	13/123	9/77	22/200
1998/ 5	11/100	18/99	29/199
1998/ 6	8/94	10/90	18/184
1998/ 7	9/89	9/88	18/177
1998/ 8	8/61	15/102	23/163
1998/ 9	24/105	16/76	40/181
총계	196/1,208(16.2)	185/1,085(17.1)	381/2,293(16.6)

표 9에서 보듯이, 본 발명의 바이러스 항체는 연중 검출되었으며(평균 16.6), 이는 한탄 바이러스에 비해 약 3.6 배가 높았다.

본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스 항체 양성율을 계절별로 비교하여, 도 16에 나타내었다.

도 16에서 보듯이, 본 발명의 바이러스 항체는 9월, 10월, 11월에 28.5가 양성으로 나타나 가을에 많이 발생하는 것으로 확인되었으며, 가을에는 율리 바이러스의 양성율이 한탄 바이러스의 양성율보다 약 3배가 높다. 또한 표 9 및 도 16에서 보듯이, 본 발명의 바이러스 항체 양성율은 월별 또는 계절별로 남녀 성비에 차이가 없었다. 한편, 신증후 출혈열 항체 양성인 106 건 중 36 건에서 율리 바이러스 항체가 검출되어, 본 발명의 바이러스와 한탄 바이러스가 중복감염된 것으로 확인되었다.

상기 동정 자료들를 종합하여 본 발명의 바이러스는 지금까지 보고된 바 없는 신규 바이러스로 확인하였다. 본 발명자는 이 바이러스를 율리 바이러스(Yuleri virus, 93/90 strain)라 명명하였으며, 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000년 1월 28일자 기탁번호 제KCTC 0725BP호로 기탁하였다.

본 발명의 바이러스는 급성 출혈열을 일으키는 신규 바이러스로서, 상기 급성 출혈열의 치료 및 예방에 유용한 백신의 개발에 사용될 수 있으며, 상기 바이러스에 대한 항체는 상기 바이러스의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 바이러스는 강력한 세포 융합 단백질을 포함하므로, 이 단백질을 이용하여 하이브리도마(hybridoma)의 제조에서와 같은 세포의 융합에 유용하게 이용될 수 있다.