一种合成对羟基扁桃酸的方法
阅读：831发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种合成对羟基扁桃酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种合成对羟基 扁桃酸 的方法，属于 生物 工程 技术领域。本发明通过分子生物学手段构建了一株双质粒重组菌，共表达丙 酮 酸 脱羧酶、苯乙 醛 脱氢酶和NADH 氧 化酶 基因，将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)。将对羟基 苯甲醛 和 乙醛酸 转化为对羟基苯甲醛，并通过NADH氧化酶辅酶再生系统，通过将NADH转化为NAD+，使得NAD+循环再生，转化能够高效进行。并通过优化底物浓度及比例，优化转化 温度 和pH，实现了对羟基扁桃酸的高效生产。在30℃、pH7的条件下反应24h，可将30mM的底物对羟基苯甲醛转化为28.5mM的对羟基扁桃酸，转化率可达到95％。，下面是一种合成对羟基扁桃酸的方法专利的具体信息内容。
1.一种生产对羟基扁桃酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述双质粒包括pETDuet-1质粒和pRSFDuet-1质粒。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述pETDuet-1质粒用于表达苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述pRSFDuet-1质粒用于表达丙酮酸脱羧酶。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶选自热带假丝酵母，所述苯乙醛脱氢酶选自大肠杆菌MG1655，所述NADH氧化酶选自枯草芽孢杆菌168。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为E.coliBL21(DE3)。
5.一种转化对羟基苯甲醛、乙醛酸生成对羟基扁桃酸的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1-4任一所述的重组菌将对羟基苯甲醛、乙醛酸转化为对羟基扁桃酸，并偶联辅酶再生系统。
+
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统以NAD为底物，通过NADH氧化酶将NADH转化为NAD+。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化的条件是：pH 6～8，转化温度为
30～37℃，转化时间20～24h。
8.根据权利要求5所述的方法，所述对羟基扁桃酸的初始反应浓度为5～30mM，对羟基扁桃酸与乙醛酸的比例为1：1～2。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，用所述重组菌的湿细胞进行转化；
所述转化体系中添加了Mg2+、TPP和NAD+。
10.权利要求1-4任一所述的重组菌在制药或化工领域的应用。
一种合成对羟基扁桃酸的方法
技术领域
背景技术
[0002] 对羟基扁桃酸，又称4-羟基扁桃酸，分子式C8H8O4，英文名称4-Hydroxyphenylglycolic acid，别名为2-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid。外观为淡黄色水合物固体，熔点109.5～110.5℃(无水物)。
[0003] 对羟基扁桃酸是重要的医药、农药和香料的中间体。特别在医药上，对羟基扁桃酸是制备抗高血压新药阿替洛尔(Ateno)的中间体，也是制备广谱抗菌素新药阿莫西林的中间体。对羟基扁桃酸临床用于治疗高血压引起的颈项强痛、头痛、偏头痛、头晕、冠心病、心绞痛及早期神经感觉性耳聋，疗效显著、应用普遍；其次还用于抗高血压新药—阿替洛尔及抗癌药物、抗糖尿病药、抗动脉硬化药、抗过敏药和消炎药、β-受体阻滞药等的合成。此外，对羟基扁桃酸在农药、高分子化合物、光电、生物化学等领域都有特殊的应用。
[0004] 对羟基扁桃酸的合成方法包括化学合成法和生物合成法，其中(1)-(4)为化学合成法，(5)为生物合成法。
[0005] (1)苯酚和乙醛酸在氢氧化钠存在下的缩合反应。该方法具有原料易得、工艺简单、成本低等优点，但是收率偏低。(2)苯酚与三氯乙醛反应，三氯甲基基团水解为羧酸基团。三氯乙醛与苯酚进行电化学反应，再将其水解得到成品。该方法产品质量好，但是三氯乙醛价格偏高。(3)对羟基苯甲醛氰醇水解，要使用剧毒的氰化钠和对羟基苯甲醛，该工艺对环境压力大，逐渐被淘汰。(4)对氨基扁桃酸水解，对氨基苯乙酸经重氨化、水解得到成品。该法环境污染及设备腐蚀严重，对氨基氯苄经腈化、水解同样具有上述缺点。(5)通过在大肠杆菌中过表达对羟基扁桃酸合酶，催化对羟基苯丙酮酸反应生成对羟基扁桃酸，但是底物价格昂贵，成本较高。
[0006] 因此，提供一种原料易得、工艺简单、成本低、收率高、环保的对羟基扁桃酸，具有广阔的市场应用价值。
发明内容
[0007] 为了解决上述问题，本发明设计了一种全新的基于C-C键连接的生物法合成对羟基扁桃酸的路径并通过构建单酶表达菌株验证了其有效性，最终通过构建双质粒将编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的基因pdc和苯乙醛脱氢酶(ALDH)基因padA及构成其辅酶循环的NADH氧化酶(NOX)的基因noxE共表达于大肠杆菌BL21中以合成对羟基扁桃酸，并对其中的反应条件进行了优化。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种生产对羟基扁桃酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述双质粒包括pETDuet-1质粒和pRSFDuet-1质粒。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述pETDuet-1质粒用于表达苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述pRSFDuet-1质粒用于表达丙酮酸脱羧酶。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶选自热带假丝酵母(Candida tropicalis)，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码丙酮酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述苯乙醛脱氢酶选自大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码苯乙醛脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述NADH氧化酶选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码NADH氧化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，构建重组菌具体包括如下步骤：以pETDuet-1为载体，将SEQ ID NO.2所示的padA和SEQ ID NO.3所示的noxE扩增后通过酶切连接的方式连接到载体上，最终构建成质粒pETDuet-padA-noxE；以pRSFDuet-1为载体，将SEQ ID NO.1所示的pdc扩增后并通过酶切连接的方式连接到载体上，最终构建成质粒pRSFDuet-pdc；将两个质粒同时导入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达。
[0015] 本发明的第二个目的是提供一种转化对羟基苯甲醛、乙醛酸生产对羟基扁桃酸的方法，所述方法利用上述重组菌将对羟基苯甲醛、乙醛酸转化为对羟基扁桃酸，并偶联辅酶再生系统。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述辅酶再生系统以NADH为底物，通过NADH氧化酶将NADH转化为NAD+的辅酶再生系统。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是以上述重组菌为生物催化剂，以对羟基苯甲醛和乙醛酸为底物，并添加Mg2+和TPP及NAD+。具体反应流程见图1。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述的底物对羟基扁桃酸的初始反应浓度为5～30mM，对羟基扁桃酸与乙醛酸的比例为1：1～2。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述的丙酮酸脱羧酶所需要的辅因子Mg2+的添加量为0.5～2mM/g湿菌体。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所1.5mM/g湿菌体，TPP的添加量为0.5～1.5mM/g湿菌体，所述的苯乙醛脱氢酶所需要的辅酶NAD+的添加量为0.5～1.5μM。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，用所述重组菌的湿细胞进行转化；湿细胞添加量为20～50g/L。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，转化过程中，以磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为缓冲液。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述转化条件是：pH 6～8，转化温度为30～37℃，转化时间20～24h，摇床转速为200～220rpm。
[0024] 本发明的第三个目的在于提供上述重组菌在制药或化工中的应用。
[0025] 本发明的有益效果：
[0026] 1、本发明设计的对羟基扁桃酸的合成方法是以乙醛酸和对羟基苯甲醛为底物首次通过生物法来合成对羟基扁桃酸，避免了化学法合成中出现的常见的副反应的发生。
[0027] 2、本发明所述的双质粒表达菌株可以通过培养来大批量获得，且不需要细胞破碎，直接用于转化反应，操作简便。
[0028] 3、本发明构建的辅酶循环系统，可以高效生产反应所需要的辅酶NAD+，降低了体外添加NAD+所需的成本，采用本方法制备对羟基扁桃酸，添加30mM的对羟基苯甲醛后，可生成28.5mM的对羟基扁桃酸，转化率可达到95％，转化周期24h。附图说明
[0029] 图1：对羟基扁桃酸的制备流程图。
[0030] 图2：转化产物的HPLC及MS检测结果；(A)：对羟基扁桃酸的标准品；(B)：反应24h的转化结果；(C)：反应24h后的检测反应液中的对羟基扁桃酸的质谱图。
[0031] 图3：底物比例对对羟基扁桃酸产量的影响。
[0032] 图4：温度对对羟基扁桃酸产量的影响。
[0033] 图5：pH对对羟基扁桃酸产量的影响。
具体实施方式
[0034] (一)丙酮酸脱羧酶的酶活定义及测定方法
[0035] 丙酮酸脱羧酶的酶活定义：一个单位酶活定义为30℃，pH为7时，每分钟生成1μmol对羟基扁桃醛所需要的酶量。
[0036] 酶活测定方法：将构建好的全细胞进行超声破碎，将丙酮酸脱羧酶进行纯化后，在1mL反应体系中，加入过量的底物对羟基苯甲醛和乙醛酸，加入一定量的Mg2+及TPP，一定量的酶，反应30min后，HPLC测定反应后生成对羟基扁桃醛的量。
[0037] (二)苯乙醛脱氢酶的酶活定义及测定方法
[0038] 苯乙醛脱氢酶的酶活定义：一个单位酶活定义为30℃，pH为7时，每分钟生成1μmol对羟基扁桃酸所需要的酶量。
[0039] 酶活测定方法：将构建好的全细胞进行超声破碎，将苯乙醛脱氢酶进行纯化后，在1mL反应体系中，加入过量的底物对羟基扁桃醛，一定量的酶，反应30min后，HPLC测定反应后生成对羟基扁桃醛的量。
[0040] (三)NADH氧化酶的酶活定义及测定方法
[0041] NADH氧化酶的酶活定义：一个单位酶活定义为30℃，pH为7时，每分钟消耗1μmol NADH所需要的酶量。
[0042] 酶活测定方法：将构建好的全细胞进行超声破碎，将NADH氧化酶进行纯化后，在1mL的反应体系中，加入过量的NADH，一定量的纯酶，反应10min后，用分光光度法直接检测NADH在340nm下的吸光度变化。
[0043] 实施例1：重组质粒pRSFDuet-pdc的构建
[0044] 人工合成的经过密码子优化的含有BamHI和SalI酶切位点的pdc基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，用限制性内切酶BamHI和SalI将pdc基因和质粒pRSFDuet-1 37℃酶切3h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的pdc基因和质粒pRSFDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氨苄霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pRSFDuet-pdc。
[0045] 实施例2：重组质粒pETDuet-padA的构建
[0046] 以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以5'CGGGATCCAATGACAGAGCCGCATGTA 3'为正向引物，以5'ACGCGTCGACTTAATACCGTACACACACCGA 3‘为反向引物(划线部分分别为BamHI和SalI的酶切位点)扩增获得padA基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，用限制性内切酶BamHI和SalI将padA基因和质粒pETDuet-padA 37℃酶切3h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的padA基因和质粒pETDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pETDuet-padA。
[0047] 实施例3：重组质粒pETDuet-padA-noxE的构建
[0048] 以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板，以5'GGAAGATCTAATGACGAATACTCTGGATGTTT 3'为正向引物，以5'CCGCTCGAGTTACAGCCAAGTTGATACTTTT 3'为反向引物(划线部分分别为BglⅡ和XhoⅠ的酶切位点)扩增获得noxE基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)，用限制性内切酶BglⅡ和XhoⅠ将noxE基因和质粒pETDuet-padA 37℃酶切3h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的noxE基因和质粒pETDuet-padA 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有卡纳霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pETDuet-padA-noxE。
[0049] 实施例4：双质粒重组大肠杆菌的构建和表达
[0050] 将实施例1构得的质粒pRSFDuet-pdc和实施例3构得的质粒pETDuet-padA-noxE经化学转化法同时转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有氨苄青霉素和卡那霉素两种抗性的LB平板中培养12h，将平板中长出的单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的种子培养基中，37℃、200rpm过夜培养。以2％(v/v)的接种量转接到100mL含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的发酵培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，25℃、200rpm下诱导12h后收集菌体用于全细胞转化。测定酶活，结果显示，丙酮酸脱羧酶的酶活为：36.7U/mg；乙醛脱氢酶的酶活为：32.1U/mg；NADH氧化酶的酶活为：87.5U/mg。
[0051] 实施例5：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化的验证
[0052] 以NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液作为全细胞转化的介质，转化的条件：
[0053] 取实施例4中获得的湿菌体，离心收集菌体后作为催化剂进行全细胞转化。在对羟基苯甲醛浓度为30mmol/L，乙醛酸浓度为60mmol/L，硫酸镁浓度为5mmol/L，TPP浓度为+5mmol/L，NAD浓度为1mmol/L时，30℃转化24h。向上述反应液中加入等体积的1M HCl终止反应。12000rpm离心10min后，用0.22μm的滤膜过滤后，稀释10倍，用HPLC检测反应液，为了进一步验证结果的可靠性，并用LC-MS检测反应液中对羟基扁桃酸的存在。结果见图2。
[0054] 实施例6：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化的底物浓度的优化
[0055] 在1mL的反应体系中加入30g/L的重组菌株，在对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为1:1的比例下进行底物浓度的优化，其中对羟基苯甲醛的浓度为(5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、
50mM、60mM和80mM)，硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD+浓度为1mM时，30℃转化24h，结果如图3a所示，当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为1:1时，对羟基苯甲醛浓度为5～80mM，转化率为2～92％，产量达0.1～28.8mM；当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为30mM：30mM时，转化率为82.2％；当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为40mM：40mM时，产物的量为28.8mM，此时转化率为72.0％。
50mM、60mM和80mM)，硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD+浓度为1mM时，30℃转化24h，结果如图3a所示，当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为1:1时，对羟基苯甲醛浓度为5～80mM，转化率为2～92％，产量达0.1～28.8mM；当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为30mM：30mM时，转化率为82.2％；当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为40mM：40mM时，产物的量为28.8mM，此时转化率为72.0％。
[0056] 在1mL的反应体系中加入30g/L的重组菌株，优化对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度比例。硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD+浓度为1mM时，30℃转化24h，结果如图3b所示，对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度比例为1:1～1:3时，转化率为26.7％～84.5％，产量为8.01～25.35mM。当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度比为30mM：60mM时，转化率为84.5％，产量为
25.35mM。
25.35mM。
[0057] 实施例7：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化温度的优化
[0058] 在1mL的反应体系中加入30g/L的重组菌株，在对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为+30mM：60mM的比例下进行温度的优化，硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD浓度为1mM时，分别25℃、30℃、37℃下转化24h，结果如图4所示，当温度为30℃时，相对转化率最高(相对转化率：以最佳转化条件下的转化率为100％，实际转化率相对于最佳转化率的比率)。
[0059] 实施例8：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化pH的优化
[0060] 在1mL的反应体系中加入30g/L的重组菌株，在对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为30mM：60mM的比例下进行温度的优化，硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD+浓度为1mM时，分别在pH为5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9条件下30℃下转化24h，结果如图5所示，当pH为
7时，相对转化率最高。
7时，相对转化率最高。
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