5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用
阅读：216发布：2020-05-11
专利汇可以提供5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了通过增强5- 氨 基乙酰丙酸生产菌株中丙氨酸: 乙 醛 酸 转氨酶的活性或在5-氨基乙酰丙酸生产菌株中导入外源性的丙氨酸:乙醛酸转氨酶来构建ALA高产菌株的方法。本发明还公开了利用所述方法构建的ALA高产菌株和利用所述菌株制备ALA的方法。利用本发明的菌株无需添加外源甘氨酸即可高效、低成本、低污染地产生ALA。，下面是5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用专利的具体信息内容。
1.5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：
增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株中丙氨酸:乙醛酸转氨酶的活性或导入外源性的丙氨酸:乙醛酸转氨酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括增强菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性；
和/或
增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中异柠檬酸裂解酶(AceA)的活性；
和/或
减弱所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中苹果酸合成酶(AceB)的活性。
4.一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中丙氨酸:乙醛酸转氨酶的活性增强或包含外源性的丙氨酸:乙醛酸转氨酶。
5.如权利要求4所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其特征在于，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径增强。
6.如权利要求5所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强；
和/或
所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中异柠檬酸裂解酶(AceA)的活性增强；
和/或
所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中苹果酸合成酶(AceB)的活性减弱。
7.一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：
1)发酵培养权利要求4-6中任一项所述的菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和
2)任选从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。
8.权利要求4-6中任一项所述菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体下游产物。
5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一种重要的高附加值生物基化工产品，在农业、医药、饲料、保健品等领域应用广泛。目前ALA主要通过化学合成法生产，成本高污染重，限制了其在各领域的推广应用。近年来，利用微生物发酵法合成ALA由于低成本和无污染的优势而逐渐成为研究的热点。
[0003] 生物体内ALA主要有两种合成途径，其中碳4(C4)途径以琥珀酰辅酶A和甘氨酸为底物，由ALA合成酶一步催化直接合成ALA；碳五(C5)途径以谷氨酸为底物，通过3步催化反应得到ALA。现有技术针对ALA合成的代谢途径改造包括强化ALA合成途径中关键酶的表达(CN101063104A、CN102206606A)、提升关键酶的酶学性质(CN108251396A)、增强四碳回补途径(CN103981203B)、强化辅酶A供给途径(CN103710374B)、弱化ALA下游代谢途径(CN103695364B、CN104830748A)、增强ALA转运蛋白的表达(CN106047916A、CN106434513A)等策略。
[0004] 由于只涉及一步酶促反应，C4途径相对于多步催化反应的C5途径具有明显优势，但其双底物的供应问题存在较大限制。其中底物琥珀酰辅酶A为TCA循环中间代谢物，目前通过途径改造基本摆脱了传统工艺中外源添加琥珀酸的限制(蒲伟等,生物工程学报,2013.10.25,29(10):1494-1503)；但胞内甘氨酸合成途径不足，现有利用C4途径合成ALA的菌株和工艺中通常需要外源添加甘氨酸，以保证ALA的过量合成和积累。
[0005] 细菌体内甘氨酸主要通过丝氨酸合成代谢途径产生，并伴随1碳单位的代谢。有研究者试图利用该途径，通过对ALA合成菌株代谢工程改造达到甘氨酸胞内合成和供给的目的。例如Ding等在利用C4途径合成ALA的工程菌株中表达解除丝氨酸反馈抑制的SerA，拟通过打通丝氨酸-甘氨酸代谢通路实现甘氨酸的胞内供给，但ALA产量只比对照菌株提升14％(Ding et al.J Ind Microbiol Biotechnol,2017,44(8):1127-1135)；Zou等在谷氨酸棒状杆菌中打通丝氨酸合成(serABC)途径，ALA产量提高70％，进一步强化丝氨酸转化为甘氨酸的酶(glyA)，ALA产量提高150％，达到了590mg/L(Zou et al.Biotechnology Letters,2017,39(9):1369)。
[0006] 虽然上述工作已经取得一定成效，但通过丝氨酸合成途径提供甘氨酸的代谢通路较长，涉及多步酶促反应，且关键酶甘油醛-3磷酸脱氢酶受到严谨的反馈调控，不仅难以实现甘氨酸的胞内有效供给，而且多酶表达也会加重工程菌的代谢负担，进而影响菌体的生长和代谢，因此，虽然工程菌株中ALA的产量有所增加，但其最终的产量依然很低，无法满足工业化规模的生产应用。
[0007] 因此本领域仍需要构建新的甘氨酸供给途径，进一步优化构建ALA工程菌株的代谢通路，从而能够高产量、低成本地制备ALA。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于构建一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，从而能够高产量、低成本地制备ALA。
[0009] 在第一方面，本发明提供5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0010] 增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株中丙氨酸:乙醛酸转氨酶的活性或导入外源性的丙氨酸:乙醛酸转氨酶。
[0011] 在具体的实施方式中，所述方法还包括增强菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径。
[0012] 在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸合成途径包括各种酶，例如(但不限于)5-氨基乙酰丙酸合成酶，优选5-氨基乙酰丙酸合成酶。
[0013] 在优选的实施方式中，增强菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径包括增强所述菌株中5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性或使得所述菌株包含外源性的5-氨基乙酰丙酸合成酶。
[0014] 在具体的实施方式中，所述方法还包括增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性；
[0015] 和/或
[0016] 增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中异柠檬酸裂解酶(AceA)的活性；
[0017] 和/或
[0018] 减弱所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中苹果酸合成酶(AceB)的活性。
[0019] 在优选的实施方式中，所述丙氨酸:乙醛酸转氨酶来自酿酒酵母。
[0020] 在优选的实施方式中，所述丙氨酸:乙醛酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0021] 在优选的实施方式中，所述增强酶的活性可通过以下方法之一或组合实现：表达同源或异源的所述酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。
[0022] 在优选的实施方式中，所述减弱酶的活性包括将所述酶缺失。
[0023] 在优选的实施方式中，所述减弱酶的活性可通过以下方法之一或组合实现：部分或全部敲除所述酶的编码基因、基因突变失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等。
[0024] 在优选的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的5-氨基乙酰丙酸产量。
[0025] 在优选的实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸生产菌株可以无需添加外源甘氨酸而高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。
[0026] 在优选的实施方式中，所述菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等；优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，最优选大肠杆菌。
[0027] 在第二方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中丙氨酸:乙醛酸转氨酶的活性增强或包含外源性的丙氨酸:乙醛酸转氨酶。
[0028] 在具体的实施方式中，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径增强。
[0029] 在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸合成途径包括各种酶，例如(但不限于)5-氨基乙酰丙酸合成酶，优选5-氨基乙酰丙酸合成酶。
[0030] 在优选的实施方式中，所述菌株的5-氨基乙酰丙酸合成酶活性增强或包含外源性的5-氨基乙酰丙酸合成酶。
[0031] 在具体的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强；
[0032] 和/或
[0033] 所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中异柠檬酸裂解酶(AceA)的活性增强；
[0034] 和/或
[0035] 所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中苹果酸合成酶(AceB)的活性减弱。
[0036] 在优选的实施方式中，所述丙氨酸：乙醛酸转氨酶来自酿酒酵母。
[0037] 在优选的实施方式中，所述丙氨酸：乙醛酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0038] 在优选的实施方式中，所述菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等；优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，最优选大肠杆菌。
[0039] 在第三方面，本发明提供一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：
[0040] 1)发酵培养第二方面所述的菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和
[0041] 2)任选从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。
[0042] 在优选的实施方式中，所述方法可以在不额外添加甘氨酸的情况下能实现5-氨基乙酰丙酸的高产。
[0043] 在第四方面，本发明提供第二方面所述菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体下游产物。
[0044] 在优选的实施方式中，所述下游产物是以ALA为前体的血红素或VB12。
[0046] 图1显示了pZPA26质粒的结构。
具体实施方式
[0047] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现通过在ALA的生产菌株中增强丙氨酸:乙醛酸转氨酶的活性，能够显著增强ALA生产菌株中ALA的合成底物甘氨酸的供应，从而显著提高ALA的产量。在此基础上完成了本发明。
[0048] 术语定义
[0049] 本文中的术语“丙氨酸:乙醛酸转氨酶”是指催化丙氨酸和乙醛酸生产甘氨酸和丙酮酸反应的酶，关于本发明的目的，它可以来源于酿酒酵母，例如氨基酸序列如SEQ ID NO:1(MTKSVDTLLIPGPIILSGAVQKALDVPSLGHTSPEFVSIFQRVLKNTRAVFKSAAASKSQPFVLAGSGTLGWDIFASNFILSKAPNKNVLVVSTGTFSDRFADCLRSYGAQVDVVRPLKIGESVPLELITEKLSQNSYGAVTVTHVDTSTAVLSDLKAISQAIKQTSPETFFVVDAVCSIGCEEFEFDEWGVDFALTASQKAIGAPAGLSISLCSSRFMDYALNDSKNGHVHGYFSSLRRWTPIMENYEAGKGAYFATPPVQLINSLDVALKEILEEGLHKRWDLHREMSDWFKDSLVNGLQLTSVSRYPSNMSAHGLTAVYVADPPDVIAFLKSHGVVIAGGIHKDIGPKYIRIGHMGVTACNKNLPYMKNCFDLIKLALQRKK)所示的丙氨酸:乙醛酸转氨酶。此外，显然，具有与SEQ ID NO:1的活性等同的活性的任何序列，虽然它不是来源于酿酒酵母，也包括在本发明的范围内。例如，可包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的保守序列和在一个或多个位置一个氨基酸或者几个氨基酸(可依据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和类型的变化，优选2-20个，更优选2-10个，最优选2-6个氨基酸残基)的置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，只要能保持或提高其催化化丙氨酸和乙醛酸生产甘氨酸和丙酮酸反应的活性；还可以包括与SEQ ID NO:1同源性大于80％，优选90％，更优选95％以上且具有丙氨酸:乙醛酸转氨酶活性的多肽，并且氨基酸的置换、缺失、插入、添加或倒位还包括天然存在于具有丙氨酸:乙醛酸转氨酶活性的微生物中的突变序列或者人工修饰的序列。
[0050] 本文所用的术语“内源性”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。
[0051] 本文所用的术语“与内源性相比增强蛋白质的活性”指的是通过修饰蛋白增强在微生物中蛋白质的细胞内活性与以自然状态具备的蛋白质活性相比提高细胞内活性。本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，包括但不限于通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的酶的编码基因，从而在该菌株中表达该酶，则该酶对于该菌株是“外源性”的。
[0052] 本文所用的术语“增强”不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性，也可以非限制性地包括任何已经的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白质的活性或增强引入蛋白质的活性。
[0053] 本文所用的术语“引入蛋白质的活性”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白质的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝数，和/或改造具有编码蛋白质的多核苷酸的多核苷酸启动子以增强转录启动速度，和/或对编码蛋白质的多核苷酸的转录进行修饰以增强其活性，和/或修改携带有所述编码蛋白质的多核苷酸的信使RNA的翻译调控序列以增强翻译强度，和/或修改编码蛋白质的多核苷酸本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白质活性的方法。
[0054] 如上面所述，调控序列包括能够起始转录的启动子，用于转录调控的任何操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合结构域的序列，调控转录和翻译终止的序列。对调控序列的修改包括但不限于，如：在多核苷酸序列中缺失、插入、保守突变或非保守突变、或其组合引入修改，也可以通过用具有增强活性的多核苷酸序列置换原始的多核苷酸序列。载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的，并且其可以使用本领域已知的热河载体构建。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、pET、pUC载体等。另外，通过将载体插入到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，如：通过同源重组。多核苷酸包括编码的靶蛋白的DNA和RNA，其可以以任何形式插入到宿主细胞的染色体上，只要其能够在宿主细胞中表达。包括但不限于，如：多核苷酸可以以原始状态、和/或表达盒的形式引入宿主细胞。表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体，也可以是能够自我复制的表达载体，可以包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。
[0055] 类似地，本文所用的术语“减弱”是指降低、削弱、减小或完全消除某种蛋白，例如酶的活性。在具体的实施方式中，减弱酶的活性可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行调控等方法或其组合来实现，包括但不限于以上方法。
[0056] 本文所用的术语“5-氨基乙酰丙酸合成途径”是指微生物中通过碳4(C4)途径产生5-氨基乙酰丙酸的具体途径，其中包括各种酶，例如5-氨基乙酰丙酸合成酶等等。类似地，本文所用的术语“5-氨基乙酰丙酸合成途径增强”是指涉及碳4(C4)途径的相关酶，例如5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性增强。在优选的实施方式中，所述酶包括但不限于来源于沼泽红假单胞菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶。
[0057] 本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法
[0058] 本发明公开了一种ALA生产菌株的构建方法，该方法通过新途径的搭建可以在胞内提供ALA合成的底物甘氨酸。本发明还公开了利用上述生产菌株在生产ALA中的应用。
[0059] 具体地说，本发明公开的ALA生产菌株的构建方法包括在ALA生产菌株中增强丙氨酸:乙醛酸转氨酶的活性。所述增强丙氨酸:乙醛酸转氨酶的活性可以通过引入外源性丙氨酸：乙醛酸转氨酶和/或增强所述生产菌株中丙氨酸：乙醛酸转氨酶的活性来实现。
[0060] 本发明采用的丙氨酸:乙醛酸转氨酶可以来自各种具体的物种，包括但不限于来自酿酒酵母的丙氨酸:乙醛酸转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。基于本发明的教导，本领域技术人员可以理解本发明的构建5-氨基乙酰丙酸生产菌株的方法可以应用于已经能够产生5-氨基乙酰丙酸的菌株，即已经包括5-氨基乙酰丙酸合成途径的菌株；本发明的构建5-氨基乙酰丙酸生产菌株的方法也可以应用于从头构建5-氨基乙酰丙酸生产菌株，即，增强丙氨酸:乙醛酸转氨酶的活性的同时在菌株中导入外源性的5-氨基乙酰丙酸合成途径。
[0061] 本发明人还发现，如果在通过上述方法构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌株中进一步增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性；和/或减弱所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中苹果酸合成酶(AceB)的活性；和/或增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中异柠檬酸裂解酶(AceA)的活性，则可以进一步提高，甚至显著提高ALA的产量。
[0062] 因此，本发明构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌株是5-氨基乙酰丙酸高产菌株。该菌株可以在不添加外源性甘氨酸的情况下高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。
[0063] 本领域技术人员知道许多菌株可以用于产生5-氨基乙酰丙酸。这些菌株虽然不同，但它们合成5-氨基乙酰丙酸的合成体系、途径却是类似的。基于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员可以采用各种合适的菌株实施本发明，所述菌株包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等；优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，最优选大肠杆菌。
[0064] 在本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株的基础上，本发明还提供了一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：发酵培养本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和任选从获得的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。
[0065] 除了高水平地获得ALA，本领域技术人员还会知晓，本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株还可用于产生以5-氨基乙酰丙酸为前体下游产物，例如(包括但不限于)以ALA为前体的血红素或VB12，等等。
[0066] 本发明的优点：
[0067] 1.本发明在5-氨基乙酰丙酸生产菌株中构建了全新的甘氨酸供给途径，从而优化了5-氨基乙酰丙酸生产菌株的代谢通路；
[0068] 2.本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株能够高水平地生产ALA；
[0069] 3.本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株能够在不额外添加甘氨酸的情况下实现5-氨基乙酰丙酸的高产，从而显著降低生产成本和操作复杂程度。
[0070] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0071] 实施例1.丙氨酸:乙醛酸转氨酶(AGT)表达载体的构建
[0072] 为了验证丙氨酸:乙醛酸转氨酶(AGT)在甘氨酸及ALA合成中的作用，首先利用pZPA26载体(p15A ori，Cm抗性，本实验室保藏，其结构如图1所示)和强启动子J23100构建AGT表达质粒。根据NCBI公布的酿酒酵母的基因组序列设计引物AGT-F和AGT-R(表1)，以酵母基因组为模板通过PCR扩增得到带有J23100启动子的AGT编码基因片段。同时利用引物p26-F和p26-R(表1)扩增获得pZPA26载体的片段，上述片段回收后重组，获得AGT表达载体pAGT。
[0073] 实施例2.异柠檬酸裂解酶(AceA)和AGT共表达载体的构建
[0074] 为了构建异柠檬酸裂解酶(AceA)和AGT共表达载体，根据NCBI公布的大肠杆菌aceA基因的序列序列设计引物AceA-F和AceA-R(表1)，以大肠杆菌BW25113基因组为模板通过PCR扩增得到aceA基因片段。片段回收后与BamHI酶切处理的pAGT重组，获得AGT和AceA共表达的载体pAGT-AceA。
[0075] 表1.引物列表
[0076]
[0077] 实施例3.苹果酸合成酶(AceB)缺失突变株的构建
[0078] 为了打通乙醛酸合成甘氨酸的合成通路，需要在宿主菌中缺失乙醛酸循环中的苹果酸合成酶编码基因aceB，使乙醛酸成为终产物。从keio collection中挑取aceB:kan菌株JW3974，制备感受态，转入pCP20(表达重组酶FLP)，热诱导后去除kan标记基因及pCP20质粒，获得aceB缺失的菌株BW25113ΔaceB。并将上述载体以及pZGA24(ALAS表达载体)或pZPA6(ALAS和PPC共表达载体)转入该菌株，分别获得重组工程菌株BW25113/pZGA24/pZPA26、BW25113/pZGA24/pAGT、BW25113/pZGA24/pAGT-AceA、BW25113/pZPA6/pZPA26、BW25113/pZPA6/pAGT、BW25113/pZPA6/pAGT-AceA、BW25113ΔaceB/pZGA24/pZPA26、BW25113ΔaceB/pZGA24/pZPA26、BW25113ΔaceB/pZGA24/pAGT-AceA、BW25113ΔaceB/pZPA6/pZPA26、BW25113ΔaceB/pZPA6/pAGT、BW25113ΔaceB/pZPA6/pAGT-AceA。
[0079] 实施例4.不同菌株ALA产量比较
[0080] 将上述重组菌单菌落及其对照菌株BW25113/pZGA24和BW25113/pZPA6分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，30℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为50μM的IPTG，诱导培养24h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培养基为添加酵母粉的M9培养基，主要成分为：Na2HPO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO4 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，MgSO42mM，CaCl2 0.1mM，葡萄糖15g/L，酵母粉2g/L。ALA的检测方法如下：200μL稀释的发酵液加入100μL pH 4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL 70％高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10min后测553nm波长下的吸光度。
[0081] 重组菌发酵结果见表2，由表可见不同的出发菌株AGT表达后，ALA产量比对照菌株都有不同程度的提升，最大提升率在136％，效果非常显著。
[0082] 表2.AGT表达对ALA产量的影响
[0083]
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