一株可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用
阅读：200发布：2020-05-08
专利汇可以提供一株可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用，其中，该勒克氏菌分离自从黄海处采摘的腐烂的 马 尾藻，其生长周期短、可产褐藻胶裂解酶，并具所产的褐藻胶裂解酶具有较高的酶活，该勒克氏菌已于2019年4月28日进行了菌种保藏，保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019314。本发明的有益之处在于：（1）筛选得到的菌株AlgM可产高活性褐藻胶裂解酶，降解褐藻胶的能 力 增强，褐藻寡糖的产量提高；（2）筛选得到的菌株AlgM生长周期较短且能同时以海藻酸钠、 葡萄糖 、蛋白胨为 碳 源生长，能够高效产酶；（3） 种子 培养基和 发酵 培养基都不含无机盐，简化了褐藻寡糖的分离纯化过程。，下面是一株可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一株可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌（Leclercia sp.），其特征在于，该勒克氏菌分离自从黄海处采摘的腐烂的马尾藻，其生长周期短、可产褐藻胶裂解酶，并具所产的褐藻胶裂解酶具有较高的酶活，该勒克氏菌已于2019年4月28日进行了菌种保藏，保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019314。
2.权利要求1所述的可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌（Leclercia sp.）在制备褐藻寡糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用权利要求1所述的可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌（Leclercia sp.）制备褐藻寡糖的方法具体如下：
步骤1：将菌株AlgM活化后接数环于种子培养基中，震荡培养得到种子液，然后将种子液接入到发酵培养基中，震荡培养得到发酵液，其中：
种子培养基的配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制；
发酵培养基的配方为：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制；
步骤2：将发酵液于4℃离心，得到粗酶液；
步骤3：将粗酶液加入到褐藻胶溶液中进行酶解，得到酶解液；
步骤4：分离纯化褐藻寡糖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤1中，菌株AlgM在Alg平板培养基上进行活化，Alg培养基的配方为：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤1中，进行种子培养和发酵培养时，培养温度均为30℃，摇床转速均为200rpm，培养时间均为28h。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤3中，褐藻胶溶液的浓度为3g/L，粗酶液与褐藻胶溶液的体积比为1:9。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤3中，酶解温度为：35℃。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤4中，分离纯化褐藻寡糖的步骤依次包括：陶瓷膜过滤-醇沉抽滤-旋转蒸发-超滤透析-离子交换-纳滤浓缩。
一株可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 褐藻胶（alginate）是一种由β-D-甘露糖醛酸（mannuronic，M）和α-L-古罗糖醛酸（guluronic，G）组成的、通过1，4糖苷键连接的、具有独特随机结构的线性杂多糖。
[0004] 褐藻胶的降解方法主要包括：化学法、生物酶解法。目前，在工业上普遍采用的是化学法——用稀酸进行水解，此方法虽然简单易行，但是降解速度慢、产量低、产物分子量分布广。相比而言，生物酶解法——通过β消除反应在非还原性末端C4和C5之间形成不饱和双键，具有条件温和、降解速度快、底物特异性高的优势。
[0005] 在生物酶解法中，褐藻胶裂解酶是制备褐藻寡糖的重要功能酶。现有的产酶菌大都酶活性较低，降解褐藻胶能力较弱，使得褐藻寡糖产量低。
[0006] 另外，在生物酶解法中，发酵培养基多采用如下配方：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，自来水配制。发酵培养基中添加有无机盐，添加的这些无机盐的种类和浓度对菌株的生长和产酶都起着非常重要的作用，但是添加的这些无机盐也使得后期褐藻寡糖的分离纯化过程变得繁琐。
发明内容
[0007] 为解决现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一株可产高活性褐藻胶裂解酶、生长周期较短且能同时以海藻酸钠、葡萄糖、蛋白胨为碳源生长的勒克氏菌，本发明的第二个目的在于以该勒克氏菌为产酶菌提供一种可以简化褐藻寡糖的分离纯化过程的发酵方法。
[0008] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一株可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌（Leclercia sp.），其特征在于，该勒克氏菌分离自从黄海处采摘的腐烂的马尾藻，其生长周期短、可产褐藻胶裂解酶，并具所产的褐藻胶裂解酶具有较高的酶活，该勒克氏菌已于2019年4月28日进行了菌种保藏，保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019314。
[0009] 前述的可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌在制备褐藻寡糖中的应用，其特征在于，利用前述的可产褐藻胶裂解酶的勒克氏菌制备褐藻寡糖的方法具体如下：步骤1：将菌株AlgM活化后接数环于种子培养基中，震荡培养得到种子液，然后将种子液接入到发酵培养基中，震荡培养得到发酵液，其中：
种子培养基的配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制；
发酵培养基的配方为：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制；
步骤2：将发酵液于4℃离心，得到粗酶液；
步骤3：将粗酶液加入到褐藻胶溶液中进行酶解，得到酶解液；
步骤4：分离纯化褐藻寡糖。
种子培养基的配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制；
发酵培养基的配方为：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制；
步骤2：将发酵液于4℃离心，得到粗酶液；
步骤3：将粗酶液加入到褐藻胶溶液中进行酶解，得到酶解液；
步骤4：分离纯化褐藻寡糖。
[0010] 前述的应用，其特征在于，在步骤1中，菌株AlgM在Alg平板培养基上进行活化，Alg培养基的配方为：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
[0012] 前述的应用，其特征在于，在步骤3中，褐藻胶溶液的浓度为3g/L，粗酶液与褐藻胶溶液的体积比为1:9。
[0013] 前述的应用，其特征在于，在步骤3中，酶解温度为：35℃。
[0015] 本发明的有益之处在于：（1）筛选得到的菌株AlgM可产高活性褐藻胶裂解酶，降解褐藻胶的能力增强，褐藻寡糖的产量提高；
（2）筛选得到的菌株AlgM生长周期较短且能同时以海藻酸钠、葡萄糖、蛋白胨为碳源生长，能够高效产酶；
（3）种子培养基和发酵培养基都不含无机盐，简化了褐藻寡糖的分离纯化过程。
附图说明
（2）筛选得到的菌株AlgM生长周期较短且能同时以海藻酸钠、葡萄糖、蛋白胨为碳源生长，能够高效产酶；
（3）种子培养基和发酵培养基都不含无机盐，简化了褐藻寡糖的分离纯化过程。
附图说明
具体实施方式
[0017] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0018] 第一部分、菌株的筛选及鉴定经过对产酶菌种的经年研究，我们从腐烂的马尾藻中分离得到了一株具有产酶活性高、生长周期短优势的产褐藻胶裂解酶的菌株。
[0019] 该具有产酶活性高、生长周期短优势的产褐藻胶裂解酶的菌株具体是通过下面的方法筛选得到的：1、获取出发菌株
2018年6月11日，我们从黄海处采摘了4棵腐烂的马尾藻，随后从中筛选分离得到了一株出发菌株，筛选分离的详细过程如下：
（1）初筛
将4棵腐烂的马尾藻放到一起均质，然后留清液，将清液分别涂布于6个MAlg平板培养基上，这6个MAlg平板培养基分别记为H1、H2、H3、H4、H5、H6，之后将这6个MAlg平板培养基于
30℃恒温培养24h，然后将各平板培养基上的产生了水解圈的单菌落挑至新的MAlg平板培养基上，在这一步中，我们从标记为H3、H4和H5的平板培养基上共计挑出了10个单菌落，这
10个单菌落对应的新的MAlg平板培养基分别记为AlgI、AlgJ、AlgK、AlgL、AlgM、AlgN、AlgO、AlgP、AlgQ、AlgR。
2018年6月11日，我们从黄海处采摘了4棵腐烂的马尾藻，随后从中筛选分离得到了一株出发菌株，筛选分离的详细过程如下：
（1）初筛
将4棵腐烂的马尾藻放到一起均质，然后留清液，将清液分别涂布于6个MAlg平板培养基上，这6个MAlg平板培养基分别记为H1、H2、H3、H4、H5、H6，之后将这6个MAlg平板培养基于
30℃恒温培养24h，然后将各平板培养基上的产生了水解圈的单菌落挑至新的MAlg平板培养基上，在这一步中，我们从标记为H3、H4和H5的平板培养基上共计挑出了10个单菌落，这
10个单菌落对应的新的MAlg平板培养基分别记为AlgI、AlgJ、AlgK、AlgL、AlgM、AlgN、AlgO、AlgP、AlgQ、AlgR。
[0020] （2）复筛我们将初筛得到的10个单菌落（挑在新的MAlg平板培养基上）于30℃恒温培养24h，之后从中挑选出水解圈最大的那个单菌落，在这一步，我们从标记为AlgM的平板培养基上挑选到了水解圈最大的单菌落，我们将该单菌落对应的菌株记为AlgM，最后将该单菌落挑至MAlg斜面培养基上并于-80℃保存。
[0021] MAlg培养基的配方：海藻酸钠5g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
[0022] 2、培养菌株AlgM获得种子液（1）培养基
Alg培养基配方：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁
0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
Alg培养基配方：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁
0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
[0023] 种子培养基配方：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。
[0024] （2）种子培养将菌株AlgM在Alg平板培养基上活化，然后将活化后的菌株接数环于种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，得到种子液。
[0025] 3、发酵培养（1）发酵培养基
发酵培养基配方：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。
发酵培养基配方：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。
[0026] （2）发酵培养条件在300mL三角瓶中装入100mL发酵培养基，每一实验组均按2%（体积分数）的接种量将种子液接入到发酵培养基中，于30℃、200rpm培养24h。
[0027] 4、褐藻胶裂解酶的活力测定将发酵液于4℃、8000g离心10min，得到粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，向上清液中缓慢加入硫酸铵，并在磁力搅拌器下使得硫酸铵的饱和度为20%，4℃过夜，之后于4℃、8000g离心10min除去杂蛋白（缓慢加入以防蛋白质变性），向上清液中继续加入硫酸铵至饱和度为
80%，4℃放置过夜，之后10000g离心30min，取沉淀，用少许的PBS缓冲液溶解沉淀物，得到浓缩酶液。
80%，4℃放置过夜，之后10000g离心30min，取沉淀，用少许的PBS缓冲液溶解沉淀物，得到浓缩酶液。
[0028] 褐藻胶裂解酶是通过β消除机制在非还原端C4和C5之间形成不饱和双键，此不饱和双键在235nm处有强吸收，在一定范围内吸光值与形成的不饱和双键的量成线性关系。取0.9ml浓度为3g/L的褐藻胶溶液（pH7.0），向其中加入0.1mL浓缩酶液，35℃保温10min，以灭活酶液作对照，测定体系在235nm处的光吸收值。
[0029] 酶活力单位定义为：每1min透明圈面积增加0.1mm2所需的酶量为一个酶活力单位（EU，enzyme unit）。
[0030] 实验测得此浓缩酶液的酶活为2.60EU。
[0031] 5、菌株AlgM的鉴定用试剂盒抽提法提取菌株AlgM的DNA，经PCR扩增获得该菌株的16S rDNA后，运用NCBI中的Blast 程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行相似性比对，并用MEGA 5.1 软件（Neighbor-Joining）构建系统发育树（见图1），分析各菌株的进化关系，确定细菌种类。
[0032] 经比对，我们确定菌株AlgM为勒克氏菌（Leclercia sp.）。
[0033] 第二部分、菌株AlgM的保藏由于菌株AlgM具有较高的酶活，所以我们将菌株AlgM保藏在了中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉，保藏日期为：2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC M 2019314，分类命名为：勒克氏菌（Leclercia sp.）。
[0034] 第三部分、菌株AlgM的应用我们筛选分离得到的菌株AlgM可产褐藻胶裂解酶，并具所产的褐藻胶裂解酶具有较高的酶活，所以我们可以将其应用到褐藻寡糖的制备中。
[0035] 下面我们将详细介绍运用菌株AlgM降解褐藻胶从而获得褐藻寡糖的方法。
[0036] 1、绘制菌株AlgM的生长曲线Alg培养基配方：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁
0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
[0037] 种子培养基配方：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。
[0038] 将菌株AlgM挑在Alg平板培养基上进行活化，然后用接种环挑取一环活化后的菌株AlgM接至种子培养基中，30℃条件下摇瓶培养，摇床转速 200rpm，每隔 3h 取样一次，稀释至合适浓度，测 600nm 光吸收值，绘制菌株AlgM的生长曲线。
[0039] 绘制得到的菌株AlgM的生长曲线见图2。
[0040] 由图2可知，菌株AlgM的生长具有明显的 3个时期：延缓期（0-9h）、对数期（9-28h）、稳定期（28-33h），在整个培养阶段的前 28h，菌株AlgM的胞内酶活随着时间的增加而上升，在培养至第28h时，菌株AlgM的胞内酶活达到最大，随后发生较明显的下降，我们推测：这种变化与培养基营养成分的消耗以及菌株自身的老化有关。
[0041] 基于图2，我们将种子培养时间确定为28h。
[0043] 在本具体实施方式中，我们主要研究了以淀粉、海藻酸钠、葡萄糖作为碳源时，在含碳量相同的情况下，不同碳源对菌株AlgM产酶的影响，实验结果见图3。
[0044] 由图3可知，菌株AlgM在以葡萄糖为碳源的培养基中进行培养时，所产的褐藻胶裂解酶的酶活最高，达到了79%。
[0045] 基于图3，我们将原发酵培养基配方中的部分海藻酸钠换成了葡萄糖。
[0046] 3、关于发酵培养基中的无机盐含无机盐的发酵培养基配方：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，自来水配制。
[0047] 不含无机盐的发酵培养基配方：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。
[0048] 将菌株AlgM挑在Alg平板培养基上进行活化，然后用接种环挑取一环活化后的菌株AlgM接至种子培养基中，30℃条件下摇瓶培养，摇床转速 200rpm，培养28h后按2%（体积分数）的接种量将种子液分别接入到含无机盐的发酵培养基中和不含无机盐的发酵培养基中，于30℃、200rpm培养24h，之后将发酵液于4℃、8000g离心10min，得到粗酶液。
[0049] 在无菌条件下，将牛津杯垂直放置于 MAlg 平板培养基上，向牛津杯中加入 200μl 粗酶液，然后置于 30°C 培养箱中培养 24h，培养结束后向MAlg平板培养基上倾倒革兰氏碘液，测量牛津杯周围透明圈直径的大小，并计算透明圈的面积。
[0050] 通过比较透明圈面积的大小，可以间接反映酶活相对大小，透明圈面积越大，酶活相对越大，反之酶活相对越小。
[0051] 革兰氏碘液染色结果见图4。
[0052] 由图4可知，与采用前述含无机盐的发酵培养基相比，当采用前述不含无机盐的发酵培养基培养菌株AlgM时，菌株AlgM所产的褐藻胶裂解酶的酶活更高一些。
[0053] 基于图4，在发酵培养阶段，我们选用前述不含无机盐的发酵培养基来发酵培养菌株AlgM。
[0054] 4、发酵培养Alg培养基配方：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁
0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
[0055] 种子培养基配方：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。
[0056] 发酵培养基配方：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。
[0057] 将菌株AlgM在Alg平板培养基上进行活化，将活化后的菌株AlgM接数环于种子培养基中，于30℃、200rpm培养28h，得到种子液，将种子液按2%（体积分数）的接种量接入到发酵培养基中，于30℃、200rpm培养28h，得到发酵液。之后将发酵液于4℃、8000g离心10min，得到粗酶液。
[0058] 5、酶解将粗酶液加入到浓度为3g/L的褐藻胶溶液中，粗酶液与褐藻胶溶液的体积比为1:9，35℃酶解22h得到酶解液。
[0059] 6、分离纯化褐藻寡糖由于种子培养基和发酵培养基都不含无机盐，所以可以简化褐藻寡糖的分离纯化过程，分离纯化褐藻寡糖的步骤依次包括：陶瓷膜过滤-醇沉抽滤-旋转蒸发-超滤透析-离子交换-纳滤浓缩，具体的：
（1）陶瓷膜过滤：使用陶瓷膜中试设备过滤酶解液中的菌体和残杂，收集透析液。
（1）陶瓷膜过滤：使用陶瓷膜中试设备过滤酶解液中的菌体和残杂，收集透析液。
[0060] （2）醇沉抽滤：向陶瓷膜过滤后的透析液中加入3倍体积浓度为95%的乙醇，使溶液中醇浓度为75%左右，静置沉淀5h，然后于抽滤瓶中抽滤除去残渣。
[0061] （3）旋转蒸发：将抽滤后的上清液置于旋转蒸发仪中，设置温度为50℃，旋转浓缩，每200mL上清液旋转蒸发20min即可蒸发出其中大部分的乙醇。
[0062] （4）超滤透析：使用卷式膜多功能小试设备，将旋转蒸发后的溶液倒入料罐，过超滤膜FMV-102（2500Da），在过膜的过程中，加入3-6倍体积的去离子水，除掉大分子物质，收集超滤透析液。
[0064] （6）纳滤浓缩：使用卷式膜多功能小试设备，将离子交换后的溶液倒入料罐，过纳滤膜FMV-102（300Da），加1倍的去离子水，约浓缩至原来体积的1/6，收集纳滤浓缩液。
[0065] 7、TLC检测取适量纳滤浓缩液，点样于TLC板上，以正丁醇：甲酸：水=4:5:1为展开剂，展开1.5h，结束后吹干，喷上显色剂（10%硫酸-乙醇）后再次吹干，于110 ℃烘箱放置30 min，检测结果见图5。
[0066] 由图5可知，标准样品为2-6糖混合溶液，样品为纳滤浓缩液，将样品所得条带与标准样品比较可得纳滤浓缩液中含有3糖、4糖、6糖，聚合程度低。
[0067] 需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
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