二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用专利检索-二氢硫辛酸酸，碱，盐，酸酐和碱专利检索查询-专利查询网

二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用

阅读：672发布：2020-05-13

专利汇可以提供二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于基因工程和酶工程技术领域，公开了二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R在地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸合成中的应用。本发明通过基因组上定点突变的方式，将来源于地衣芽胞杆菌WX-02（Baclicus lincheniformis WX-02）二氢硫辛酸脱氢酶PdhD的第213位脯氨酸编码的碱基CCA改为CGG，即213位由脯氨酸改成精氨酸，显著提高了聚γ-谷氨酸合成水平，突变菌株聚γ-谷氨酸产量相较于对照菌株至少提高了21%以上。本发明为聚γ-谷氨酸的高效生产提供了一种新策略。，下面是二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.二氢硫辛酸脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1所述的突变体或权利要求2所述的核苷酸序列在地衣芽胞杆菌发酵生产聚γ-谷氨酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌
(Bacilluslicheniformis) WX-02。
6.根据权利要求4所述的应用，在应用过程中，使用的发酵培养基配方为：
葡萄糖30-90 g/L，谷氨酸钠0~30 g/L，柠檬酸钠0~10 g/L，NaNO3 0~10 g/L，NH4Cl0-
10g/L，K2HPO4·3H2O 0.5-1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1 g/L，ZnSO4·7H2O 0-1 g/L，MnSO4·H2O 0-0.15 g/L，CaCl2 0-1 g/L；所述的谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaNO3、NH4Cl、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O和CaCl2在每一组配方中，每次至多只有一种组分取零;
或甘油20-60 g/L，谷氨酸钠25-35 g/L，柠檬酸钠8-12 g/L，NaNO3 8-12 g/L，NH4Cl 8-
12 g/L，K2HPO4·3H2O 0.7-1.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.8-1.2 g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.25 g/L，CaCl2 0.7-1.3g/L。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：葡萄糖30-90 g/L，谷氨酸钠0 30 g/L，柠~
檬酸钠9-10 g/L，NaNO3 9-10g/L，NH4Cl 9-10g/L，K2HPO4·3H2O 0.9-1 g/L，MgSO4·7H2O
0.9-1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.9-1 g/L，MnSO4·H2O 0.12-0.15 g/L，CaCl2 0.9-1 g/L;
或
甘油20-40 g/L，谷氨酸钠25-35 g/L，柠檬酸钠8-12 g/L，NaNO3 8-12 g/L，NH4Cl 8-12 g/L，K2HPO4·3H2O 0.7-1.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.8-1.2 g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.25 g/L，CaCl2 0.7-1.3g/L。

说明书全文

二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-

谷氨酸合成中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用。

背景技术

[0002] 聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种阴离子型生物高分子聚合物，分子间氢键的作用力由羧基提供，具有吸附性、水溶性、生物可降解性等优良性质，是一种良好的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、农药及肥料的缓释剂等，在食品加工、环境治理、化妆品、医疗、农业等产业均有很大的应用价值。

[0003] 目前，聚γ-谷氨酸的商业化生产主要依赖于微生物发酵法，但是由于需要添加聚γ-谷氨酸合成前体物和发酵副产物过多，导致葡萄糖向聚γ-谷氨酸的转化率偏低。从目前报道看，聚γ-谷氨酸的商业生产菌株几乎完全依赖于芽胞杆菌属，如枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等。

[0004] 二氢硫辛酸脱氢酶PdhD为丙酮酸脱氢酶复合体的一个亚基，丙酮酸脱氢酶是催化丙酮酸到乙酰CoA反应的关键酶。目前，丙酮酸脱氢酶和二氢硫辛酸脱氢酶的表达水平及表达活性与聚γ-谷氨酸合成水平之间的关系尚未研究，对二氢硫辛酸脱氢酶进行定点改造能否提高聚γ-谷氨酸合成水平也是不可预知的。本研究通过对二氢硫辛酸脱氢酶进行定点改造，提高了聚γ-谷氨酸合成水平。本发明提供了一种显著聚γ-谷氨酸合成水平的技术策略，为实现γ-PGA的工业化生产提供理论指导和技术支持。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供了二氢硫辛酸脱氢酶PdhD突变体P213R，所述的二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

[0006] 本发明的另一个目的在于提供了在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用。

[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

[0008] 二氢硫辛酸脱氢酶PdhD突变体P213R，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

[0009] 二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用，包括将地衣芽孢杆菌中的将二氢硫辛酸脱氢酶PdhD的第213位由脯氨酸变成了精氨酸，然后利用获得的重组菌株发酵生产聚γ-谷氨酸，所述的突变体P213R的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示。

[0010] 以上所述的应用中，优选的，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

[0011] 以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为能生产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌。

[0012] 以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformi s)WX-02。

[0013] 以上所述的应用中，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：

[0014] 葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠0～10g/L，NaNO3 0～10g/L，NH4Cl 0-10g/L，K2HPO4·3H2O 0.5-1g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，ZnSO4·7H2O 0-1g/L，MnSO4·H
2O 0-0.15g/L，CaCl2 0-1g/L；所述的谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaNO3、NH4Cl、ZnSO4·7H2 O、MnSO4·H2O和CaCl2在每一组配方中，每次至多只有一种组分取零。

[0015] 或甘油20-60g/L，谷氨酸钠25-35g/L，柠檬酸钠8-12g/L，NaNO3 8-12g/L，NH4Cl 8-12g/L，K2HPO4·3H2O 0.7-1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.8-1.2g/ L，MnSO4·H2O 0.1-0.25g/L，CaCl2 0.7-1.3g/L。

[0016] 以上所述的应用中，所述的发酵培养基配方优选为：

[0017] 葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠9-10g/L，NaNO3 9-10g/L，NH4Cl 9-10g/L，K2HPO4·3H2O 0.9-1g/L，MgSO4·7H2O 0.9-1g/L，ZnSO4·7H2O 0.9-1g/L，MnS O4·H2O 0.12-0.15g/L，CaCl2 0.9-1g/L。

[0018] 或

[0019] 甘油20-40g/L，谷氨酸钠25-35g/L，柠檬酸钠8-12g/L，NaNO3 8-12g/L，NH4Cl 8 -12g/L，K2HPO4·3H2O 0.7-1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.8-1.2g/L， MnSO4·H2O 0.1-0.25g/L，CaCl2 0.7-1.3g/L。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0021] 本发明通过基因组定点突变策略，将二氢硫辛酸脱氢酶PdhD的第213位脯氨酸编码的碱基CCA改为精氨酸编码的碱基CGG，获得了二氢硫辛酸脱氢酶PdhD突变体P213R，，该酶在聚γ-谷氨酸合成应用中显著提高了聚γ-谷氨酸合成水平，其聚γ-谷氨酸合成水平相较于对照菌株有显著性提高。

具体实施方式

[0022] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

[0023] 实验材料和试剂

[0024] 1、菌株：地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02，保藏号为CCTCC NO.M208065，菌株E.coli DH5α购自于北京全式金生物技术有限公司。

[0025] 2、酶类及其它生化试剂：高保真Taq酶购自武汉擎科生物技术有限公司。细菌基因组 DNA提取试剂盒购自Tiangen公司，T4DNA连接酶、限制性内切酶等分子生物学试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

[0026] 3、培养基：

[0027] LB培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L 酵母粉，10g/L 氯化钠，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min后使用。

[0028] 实施例1：

[0029] 二氢硫辛酸脱氢酶基因突变的地衣芽胞杆菌WX-P213R的构建：

[0030] 1、根据地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02基因组DNA序列通过基因合成序列突变的二氢硫辛酸脱氢酶基因P213R(SEQ ID NO.2所示)；以地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02基因组DNA为模板，PCR扩增出PdhD基因的上游同源臂(引物为T2-F1和T2-R1) 和PdhD基因的下游同源臂(引物为T2-F2和T2-R2)；

[0031] T2-F1:GACGACAATACAGATGAAGT

[0032] T2-R1:AAATCTCCTACTACCATTACATTACGCCTCCATTA

[0033] T2-F2:TAATGGAGGCGTAATGTAATGGTAGTAGGAGATTT

[0034] T2-R2:TAACAACGAAATAGTGGC 2、通过重叠延伸PCR将PdhD基因的上游同源臂、二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R基因和 PdhD基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为： PdhD基因的上游同源臂-突变体基因P213R-PdhD基因的下游同源臂；

[0035] 3、采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-Ori进行双酶切得到线性质粒片段；

[0036] 4、将步骤3得到的酶切目的片段和步骤3得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶连接，验证正确后得到质粒T2(2)-P213R；

[0037] 5、将质粒T2(2)-P213R转入地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02中，经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证；

[0038] 6、将步骤4得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3 次，每次培养12h，并以T2-F和P213R-R为引物进行菌落PCR检测单交换菌株；

[0039] T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA

[0040] P213R-R：ACAGAGGGGGTTTTTGATTTATTTTACAACGTGGAT 7、将步骤5得到的菌株和步骤6得到的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为T2-KYF和 T2-KYR)。得到阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的P213R突变菌株(即地衣芽胞杆菌WX-P213R)，该菌株中的二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；

[0041] T2-KYF:GAGATTATTCGTAAAGCCGAGATG

[0042] T2-KYR:TGGAAGGATTTCTTCTCC。

[0043] 实施例2：

[0044] 二氢硫辛酸脱氢酶突变体菌株WX-P213R在提高聚γ-谷氨酸发酵产量中的应用：

[0045] 发酵产物产量分析

[0046] 将实施例1获得的地衣芽胞杆菌WX-P213R菌株接种到LB培养基中，37℃，培养14h；向500mL三角瓶中装入50mL的聚γ-谷氨酸发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为
3％(体积百分比)接种至发酵培养基中。培养条件为转速230r/min，温度37℃，发酵周期36小时。

[0047] 本实施例，针对不同的发酵培养基配方，考察了地衣芽胞杆菌WX-P213R对聚γ-谷氨酸合成水平的影响(同时也在这24种培养基中以同样接种量接种地衣芽胞杆菌WX-02作为对照)，24组培养基配方具体如表1所示：

[0048] 表1发酵培养基配方

[0049]

[0050]

[0051] 以上培养基成分单位均为g/L。

[0052] 采用干重法测量聚γ-谷氨酸产量，具体操作步骤如下：取一定体积的发酵液样品，使用6mol/L HCl将pH调至3.0，12000r/min离心10min，上清用6mol/L NaOH将上清液pH 调至中性，加入3倍体积乙醇沉淀聚γ-谷氨酸，离心收集聚γ-谷氨酸絮状沉淀，将沉淀在 80℃烘箱烘干，测干重。根据干重法计算生产发酵的菌液中聚γ-谷氨酸产量(见表2)。

[0053] 表2发酵试验聚γ-谷氨酸的产量

[0054]

[0055]

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