技术领域
[0001] 本
发明属于
植物组织培养技术领域，具体涉及一种生姜的液体浅层快繁方法。
背景技术
[0002] 生姜是姜科多年生单子叶草本植物，生产上多为１年生栽培，在我国广泛栽培。生姜由于其营养丰富，药用效果好，已成为重要的调味蔬菜和医药、化工及食品工业原料；加上其经济价值高，耐贮运，近年来已成为我国主要的特产创汇蔬菜之一。
[0003] 由于生姜不开花或很少开花，在育种上很难利用有性繁殖，而只能靠少数品种长期
无性繁殖，从而导致姜植株体内积累多种病毒，产量下降，品质退化，抗逆性下降。近年来，随着
生物技术的发展，植物组织培养技术也逐渐应用到了生姜的生产上，取得了良好的经济效益。生姜脱毒后，植物长势强，产量显著提高，抗病性增强。采用生姜组培苗替代姜
块，可大大节省种姜用量，提高生姜的产量和品质，获得更好的经济效益。同时，使用组织培养可以克服生姜种质资源因为
自然灾害和病虫害所导致的丢失，并可对植物品质进行改良，通过改变生姜
染色体组成和基因结构，达到改良生姜品质的目的。
发明内容
[0004] 针对
现有技术中存在的问题，本发明提供一种生姜的液体浅层快繁方法。
[0005] 本发明通过以下技术方案加以实现：
[0006] 所述的一种生姜的液体浅层快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
[0007] 1）材料
热处理：精选块大、肉厚、色泽黄亮、芽眼饱满、未腐烂的健壮姜块，在自来
水下洗净泥土，用50 %多菌灵500倍液浸泡30 min消毒，然后用高温灭菌后的细沙
覆盖，置于恒温
培养箱内催芽，培养条件为
温度36-38 ℃，空气湿度为70-80 %，整个过程不需要光照，姜芽长出后，取培养箱中催芽的姜，50 ℃超高温处理5 min用于接种；
[0008] 2）外植体消毒与接种：切取经热处理后1-2 cm的姜芽，
自来水冲洗30 min，然后置于70%的
乙醇中浸泡30 s，弃去乙醇，无菌水冲洗1次，再用10% NaClO消毒10-15 min，弃去NaClO溶液，无菌水冲洗5次，沥干水后，取出在超净
工作台上利用双目解剖镜剥取0.2-0.4 mm的茎尖分生组织；
[0009] 3）初代培养：将茎尖分生组织接种到初代培养基内进行培养，所述的初代培养基为：MS培养基+2-3 mg/L的6-苄
氨基腺嘌呤（6-BA）+0.1-0.3 mg/L的
萘乙酸（NAA）+7 g/L的琼脂+30 g/L的食用白糖，pH值范围为5.5-5.8；配制好的培养基分装在240 mL的组培瓶中，每瓶25 mL，121 ℃灭菌15 min；
[0010] 4）继代培养：选择初代培养后苗高在3 cm以上，且具有3-6个
腋芽的外植体，接种于继代培养基中培养，待外植体产生丛生芽后，从每个丛芽上选择1株，用灭菌的
剪刀，剪取芽基部0.5 cm以上的植物材料，用酶联
免疫吸附法进行黄瓜花叶病毒和
烟草花叶病毒检测；然后用消毒后的解剖刀从无毒姜丛生芽切取带两个或两个以上的芽，连带基部切掉所有的根及0.5 cm以上部分的茎段，转接至初代培养基中使腋芽伸长，苗高4 cm以上后再转接至液体继代培养基中继续增殖，所述的继代培养基为：MS培养基+10-30 g/L的食用白糖+2-5 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1-0.5 mg/L的萘乙酸+0.1-1.7 g/L的抗
氧化剂， pH值范围为5.5-5.8；配制好的培养基分装在240 mL的组培瓶中，每瓶10 mL，培养过程中培养基不得没过培养材料，否则影响增殖，121 ℃灭菌15 min；
[0011] 5）生根培养：选择苗高3 cm以上，具有3-6个腋芽的外植体，接种于液体生根培养基中培养，所述生根培养基为：MS培养基+5-20 mg/L的食用白糖+0.1-0.4 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.2-0.6 mg/L的萘乙酸+0.4-2.0 mg/L的多效唑+100 g/L的土豆汁，pH值范围为5.5-5.8；配制好的培养基分装在240 mL的组培瓶中，每瓶10 mL；
[0012] 6）炼苗：将组培苗从培养室取出，放置于炼苗室中，温度保持在22-29 ℃，湿度保持在70-75 %，避免阳光直射；放置3-4 d后，打开瓶盖，让
幼苗逐渐适应外部环境，早晚用
喷雾器对幼苗和室内进行喷雾，经过约1周的炼苗过程，即可移栽；
[0013] 7）移栽：把重量比为蛭石:珍珠岩=1:1的基质放到经过消毒的营养袋中，每个处理100袋。移栽时用
镊子把各组培苗从培养瓶中取出，分成单株，用清水冲洗干净根上残留的培养液，要做到不伤根，用500倍多菌灵溶液浸泡20 min，然后小心栽入营养袋中，浇足定根水，移栽后要用
遮阳网遮荫，常浇水和喷雾，湿度保持在75-85 %，温度22-25 ℃之间；每周施1次0.1 %的尿素和0.2 % KH2PO4，同时进行
病虫害防治。
[0014] 所述的一种生姜的液体浅层快繁方法，其特征在于步骤3）初代培养的培养条件为：培养温度25-30 ℃，光照时间为每天照射12-14 h,光照强度为1200-1500 Lx，培养时间为15-30 d。
[0015] 所述的一种生姜的液体浅层快繁方法，其特征在于步骤4）继代培养的培养条件为：培养温度25-30 ℃，光照时间为每天照射12-14 h,光照强度为1200-1500 Lx。
[0016] 所述的一种生姜的液体浅层快繁方法，其特征在于步骤5）生根培养的培养条件为：培养温度25-30 ℃，光照时间为每天照射12-14 h,光照强度为1200-1500 Lx。
[0017] 所述的一种生姜的液体浅层快繁方法，其特征在于步骤4）中的抗
氧化剂为0.5 g/L的
硫代硫酸钠、0.1 g/L的硫脲、0.5 g/L的二硫苏糖醇、0.5 g/L的半胱氨酸、0.1 g/L的
抗坏血酸中的一种或多种。
[0018] 所述的一种生姜的液体浅层快繁方法，其特征在于步骤5）中的生根培养基还包括有机添加物，所述有机添加物为100 g/L的土豆汁、100 g/L的玉米汁、100 g/L的小麦面粉、0.2 g/L的
水解酪蛋白、0.2 g/L的
酵母提取物中的任一种。
[0019] 本发明以生姜芽作为外植体进行培养，采用茎尖-热处理脱毒技术，获得脱毒脱菌生姜种苗，与传统的只使用乙醇、HgCl2等消毒剂对外植体消毒方式相比，脱毒率高，成活率高。并采用优选的培养体系进行组织培养，大大节约成本，为生姜良种的快速繁殖提供技术参考。
[0020] 本发明中生姜的组织培养采用液体培养体系，无论是在生姜继代还是生姜生根试验中，具有相同
激素水平的液态培养基增殖与生根在一定程度上均要优于固体培养基，同时液态培养基在很大程度上节省了大量人
力和财力。此外，在本发明中，用食用白糖代替组织培养常用的
蔗糖，同时采用液体培养体系，有利于生产成本的降低。
具体实施方式
[0021] 以下结合具体
实施例对本发明作进一步详细说明，并给出具体实施方式。
[0022] 实施例1：
[0023] 1）材料热处理：精选块大、肉厚、色泽黄亮、芽眼饱满、未腐烂的健壮姜块，在自来水下洗净泥土，用50%多菌灵500倍液浸泡30 min消毒，然后用高温灭菌后的细沙覆盖，置于恒温培养箱内催芽，培养条件为温度36-38℃，空气湿度为70-80%，整个过程不需要光照，姜芽长出后，取培养箱中催芽的姜，50℃超高温处理5 min用于接种；
[0024] 2）外植体消毒与接种：切取经热处理后1-2 cm的姜芽，自来水冲洗30 min，然后置于70%的乙醇中浸泡30 s，弃去乙醇，无菌水冲洗1次，再用10 % NaClO消毒10-15 min，弃去NaClO溶液，无菌水冲洗5次，沥干水后，取出在超净工作台上利用双目解剖镜剥取0.2-0.4 mm的茎尖分生组织；
[0025] 3）初代培养：将茎尖分生组织接种到121 ℃灭菌15 min，每瓶 20 mL的初代培养基（MS培养基+2 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.25 mg/L的萘乙酸+7 g/L的琼脂+30 g/L的食用白糖，pH 5.6），25-30 ℃，光照12-14 h/d,光照强度为1200-1500 Lx，培养28 d，出芽率为98.2 %，且芽
质量好，黄化现象少，采用热处理消毒，芽的污染率低，成活率达90 %。
[0026] 4）继代培养：选择初代培养后苗高在3 cm以上，且具有3-6个腋芽的外植体，接种于121 ℃灭菌15 min，每瓶10 mL的液体继代培养基（MS培养基+15 g/L的食用白糖+3 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.3 mg/L的萘乙酸+0.5 g/L硫代硫酸钠+0.1 g/L硫脲+0.5 g/L二硫苏糖醇+0.5 g/L半胱氨酸+0.1 g/L抗坏血酸， pH 5.6）中，25-30 ℃，光照12-14 h/d,光照强度为1200-1500 Lx，培养30 d，外植体产生丛生芽后，用灭菌的剪刀，剪取芽基部0.5 cm以上的植物材料，用消毒后的解剖刀从无毒姜丛生芽切取带两个或两个以上的芽，连带基部切掉所有的根及0.5 cm以上部分的茎段，转接至初代培养基中使腋芽伸长，苗高4 cm以上后再转接至液体继代培养基中继续增殖，增殖倍数为6.58，材料的褐化率6.5 %,褐化现象明显降低。
[0027] 5）生根培养：选择苗高3 cm以上，具有3-6个腋芽的外植体，接种于121℃灭菌15 min，每瓶10 mL的液体生根培养基（MS培养基+10 mg/L的食用白糖+0.2 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.4 mg/L的萘乙酸+1.6 mg/L的多效唑+100 g/L的土豆汁，pH 5.6）中，25-30 ℃，光照12-14 h/d，光照强度为1200-1500 Lx，培养30 d。出根数为8.3，根长为39.0 mm，色白而粗，茎粗0.32 cm，
叶片大，肥厚，色浓绿。
[0028] 6）炼苗：将组培苗从培养室取出，放置于炼苗室中，温度保持在22-29℃，湿度保持在70-75%，避免阳光直射；放置3-4d后，打开瓶盖，让幼苗逐渐适应外部环境，早晚用喷雾器对幼苗和室内进行喷雾，经过约1周的炼苗过程，即可移栽。
[0029] 7）移栽：把重量比为蛭石:珍珠岩=1:1的基质放到经过消毒的营养袋中，每个处理100袋。移栽时用镊子把各组培苗从培养瓶中取出，分成单株，用清水冲洗干净根上残留的培养液，要做到不伤根，用500倍多菌灵溶液浸泡20 min，然后小心栽入营养袋中，浇足定根水，移栽后要用遮阳网遮荫，常浇水和喷雾，湿度保持在75-85 %，温度22-25 ℃之间；每周施1次0.1 %的尿素和0.2 % KH2PO4，同时进行病虫害防治，组培苗成活率达98 %。
[0030] 实施例2：茎尖诱导出芽率
[0031] 在MS培养基中加入7 g/L的琼脂，30 g/L的食用白糖，改变激素配比，在27±2 ℃，光照时间每天照射12-14 h，光照强度为1200-1500 Lx，培养25 d后，观察不同激素配比对出芽率的影响。
[0032] 表1不同激素配比对出芽率的影响
[0033]
[0034] 从表1中我们可以看出，当激素6-BA浓度大于2 mg/L后，诱导出芽率降低，而随着激素NAA浓度的加大，诱导出芽率升高，最合适的激素配比为6-BA浓度2 mg/L，NAA浓度0.25 mg/L。
[0035] 实施例3：热处理脱毒效果及初代培养成活率
[0036] 分别采用传统HgCl2消毒和热处理消毒的方法，诱导培养10天后分别检测其污染率，并在初代培养后检测其成活率，对比二者的脱毒效果及对初代培养成活率的影响，结果见表2。从表2可以看出，经本发明热处理消毒方法处理过的材料，污染率低于传统只经升汞消毒方法，且在初代培养中其成活率明显高于经传统消毒方法处理的材料，进一步说明，该发明热处理消毒方法对茎尖的损伤较小，易于成活。
[0037] 表2 不同消毒方法对初代培养污染率和成活率的影响
[0038]消毒方法 处理瓶数 污染率（%） 成活率（%）
传统消毒方法 100 8 71
热处理消毒方法 100 6 90
[0039] 实施例4：激素配比对继代培养增殖的影响
[0040] 表3 激素配比对继代培养增殖的影响
[0041]
[0042] 将芽接种到不同的激素配比的继代培养基中进行培养，增殖倍数见表3。从表可知，激素的浓度对继代培养的增殖倍数有显著的影响，随着6-BA浓度的增大，其增殖倍数显著上升，但是当增加到3 mg/L时，其增值倍数达到最大，而后增加6-BA浓度，反而会抑制增殖；NAA浓度加大，会促进增殖，在0.3 mg/L时达到最大值，而后开始下降，最佳的配比为6-BA浓度3 mg/L，NAA浓度0.3 mg/L，即8号培养基。
[0043] 实施例5：加入抗氧化剂对继代培养过程中褐变的影响
[0044] 褐化是指在外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化严重影响外植体的分化，甚至导致培养的失败，有效的抑制褐化对液体培养有着关键的作用。在培养液中加入抗氧化剂、氨基酸等能有效的抑制褐化。本实验中加入了硫脲、二硫苏糖醇、半胱氨酸、硫代硫酸钠、抗坏血酸及其组合考察了对褐化的抑制作用，培养30 d后观察外植体生长情况，结果见表4。与对照相比，在培养基中添加抗氧化剂能明显降低茎秆基部愈伤组织褐化率，4 种抗氧化剂中，0.1 g/L 抗坏血酸较其余3 种抗氧化剂使用量小，且效果佳。而在培养基中添加抗坏血酸、硫代硫酸钠、硫脲、二硫苏糖醇的抗氧化剂组合成分，同时添加半胱氨酸，既能降低茎秆基部愈伤组织褐化率，又能大大提高丛生芽增值倍数，更有利于组培苗的继代培养。
[0045] 表4 抗氧化剂、氨基酸对培养过程中褐变的影响
[0046]编号 添加物 材料褐化率 增殖倍数
0 无 32.5 % 4.16
1 0.5g/L 硫代硫酸钠 28.9 % 4.57
2 0.1 g/L硫脲 29.2 % 4.38
3 0.5 g/L二硫苏糖醇 19.8 % 4.97
4 0.1 g/L抗坏血酸 14.2 % 5.11
5 0.5 g/L半胱氨酸 16.5 % 5.06
6 0.5g/L 硫代硫酸钠+0.1 g/L硫脲 23.6 % 4.65
7 0.5 g/L半胱氨酸+0.5 g/L二硫苏糖醇 12.5 % 5.34
8 0.5 g/L硫代硫酸钠+0.1 g/L硫脲+0.5 g/L半胱氨酸+0.5 g/L二硫苏糖醇 10.8 % 5.49
9 0.5 g/L硫代硫酸钠+0.5 g/L半胱氨酸+0.5 g/L二硫苏糖醇+0.1 g/L抗坏血酸 7.5 % 5.73
10 0.5 g/L硫代硫酸钠+0.1 g/L硫脲+0.5 g/L二硫苏糖醇+0.5 g/L半胱氨酸+0.1 g/L抗坏血酸 6.5 % 6.50[0047] 实施例6：培养体系类型对继代培养增殖的影响
[0048] 以实施例3中的8号培养基为
基础，加入7 g/L琼脂，配制成固体培养基，培养温度为27±2 ℃，光照时间每天照射12-14 h，光照强度为1200-1500 Lx，液体、固体培养体系均设置三组平行，培养28天观察增值倍数，结果见表5。
[0049] 表5 液体/固体培养体系继代培养增殖率
[0050]
[0051] 从表5我们可以看出，与固体培养基相比，液体培养体系对继代培养的增殖几乎没有影响，且平均增值倍数较固体培养略高。因液体培养基更有利于生姜组培苗的吸收，故生长速度较快，增殖倍数较固体培养高。
[0052] 实施例7：糖浓度对继代培养增殖的影响，结果见表6。
[0053]
碳源是植物组织培养不可缺少的物质，它不仅能够给外植体提供
能量，而且也能维持一定的渗透压，且在组织培养各个阶段所需要的糖浓度是不一样的。
[0054] 表6 糖浓度对继代培养增殖倍数的影响
[0055]糖浓度（g/L） 出芽数（个）
0 0.6
10 3.9
15 4.9
20 4.8
25 4.8
30 4.6
[0056] 从表6中可看出，糖浓度在15 g/L时，出芽数最多，糖浓度继续升高，芽分化个数有所降低。
[0057] 实施例8：激素配比对生姜生根的影响
[0058] 表7激素配比对生姜生根的影响
[0059]
[0060] 由表7可知，在培养基中加入外源激素很容易使生姜生根，只是在不同的培养基上生根根长、数量有所不同，在6-BA浓度0.2 mg/L，NAA浓度0.4 mg/L时生根数量最多，根长也较长，根色白而粗，虽然苗高并非最大值，但移栽后成活率较高。
[0061] 实施例9：液体培养体系对生姜生根的影响
[0062] 在MS培养基中加入在6-BA（浓度0.2 mg/L），NAA浓度（0.4 mg/L），分别配制成液体培养基和固体培养基（加入7 g/L的琼脂），观察其生根情况，每个做三组平行，结果见表8。生姜苗在液体培养基中的出根数高于固体培养基，根长和株高影响不明显。且固体培养基在炼苗时需用水洗净粘在根上的琼脂，这会导致根的损伤，造成成活率下降。且液体培养基减少了琼脂的用量，降低了培养基成本。
[0063] 表8 液体培养体系对生姜生根的影响
[0064]
[0065] 实施例10：白糖浓度对生姜生根的影响
[0066] 将继代培养的生姜苗接种到不同糖浓度的生根培养基中培养，结果见表9。糖浓度在10 g/L时，每株出根数最多，根最长。随着糖浓度的增大，出根数和根长均下降。
[0067] 表9 白糖浓度对生姜生根的影响
[0068]白糖浓度（g/L） 出根率（%） 出根数（条/株） 根长（mm）
0 100 1.67 0.26
5 100 6.85 26.3
10 100 7.00 29.5
15 100 6.62 25.5
20 100 6.48 25.2
25 100 6.33 24.8
[0069] 实施例11：碳源的选择对生姜脱毒苗继代和生根的影响
[0070] 将初代培养基、继代培养基和生根培养基中白糖均用蔗糖代替，其他操作及条件不变，结果见表10。选择食用白糖或蔗糖作为碳源，在继代培养的增殖倍数以及苗的生根方面几乎没有影响，而且白糖比蔗糖在价格上更占有优势，完全可以使用白糖来降低组培成本。
[0071] 表10 食用白糖与蔗糖对生姜脱毒苗继代和生根的比较
[0072]
[0073] 实施例12：不同浓度的多效唑对生姜壮苗及生根的影响
[0074] 一定浓度的多效唑可抑制生姜苗的纵向生长，促进其横向生长，茎加粗，叶片变宽加厚，起到壮苗的作用，同时可以促进根系发育生长，使苗易于移栽成活。在MS培养基+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.4 mg/L培养液中，分别加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/L 多效唑，以不添加多效唑为对照实验，观察其对生姜壮苗及生根的影响，结果见表11。
[0075] 表11 多效唑对生姜壮苗及生根的影响
[0076]
[0077] 从表11我们可以看出，在0.4-2.0 mg/L浓度梯度中，多效唑具有壮苗的作用，在1.6 mg/L以下，多效唑具有促进根系发育的作用，综合考虑，采用1.2-1.6 mg/L浓度的多效唑有利于同时壮苗和促进生根。
[0078] 实施例13：不同有机添加物对生姜组培苗生根壮苗的影响，
[0079] 将不同类型的有机添加物加入生根培养基中，30 d进行观察，结果见表12。添加100 g/L土豆汁的组培苗生长旺盛、深绿色，健壮度高，生根壮苗的效果最好。有机添加物汁液中含有氨基酸、激素、酶等有机物，其营养丰富，是复杂的营养混合物，可为植物生长提供一些生理活性物质，补充一些未知的微量成分。且添加天然有机物的培养基容易配制，成本低廉，对器官分化、
细胞增殖有明显的促进作用，可应用于生产中。
[0080] 表12 有机添加物对生姜组培苗生根壮苗的影响
[0081]
[0082] 实施例14：不同基质对生姜组培苗株高、根长和成活率的影响
[0083] 表13 不同基质对生姜组培苗株高、根长和成活率的影响
[0084]基质类型 平均株高(cm) 平均根长(cm) 成活率(%)
蛭石:珍珠岩=1:1 8.9 6.7 98
珍珠岩 8.0 6.1 88
蛭石 7.8 5.7 83
[0085] 移栽30 d后不同基质对生姜组培苗的影响，结果见表13。成活率越高，移栽越成功。生姜试管苗移栽后的成活率在珍珠岩:蛭石=1:1 的基质中最高为98 %，且株高、根长高于珍珠岩和蛭石条件的生长状态。正是由于不同基质具有不同的理化特性，才导致了生姜试管苗在移栽后生长的差异。蛭石主要起保水作用，其孔隙度大，保水能力强，而珍珠岩主要起通气作用。因此，结合两者的优点，蛭石:珍珠岩 =1:1的基质最适于生姜试管苗的移栽生长。
