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一种测定 土壤 微 生物趋化性芯片的制备方法

阅读：782发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法，属于生物化学与环境技术领域，包括：将含有微腔室、通道和混合区的芯片进行打印，得到光刻掩膜；将光刻胶置于硅片中心后依次进行匀胶、烘干，将光刻掩膜与匀好胶的硅片的外边框对准后进行紫外曝光，得到曝光硅片，将所述曝光硅片烘干后用有机试剂 PEGEMEA显影，再烘干坚模，得到阳模；将PDMS预聚体和固化剂混合后，置于阳模上，静置后进行固化，得到PDMS印章；将PDMS印章进行表面亲水化改性处理，得到处理印章，将趋化剂加入到处理印章的微腔室后，与载玻片贴合，得到测定土壤微生物趋化性芯片。采用本发明制备得到的芯片能够原位、定量和可视化测定土壤微生物趋化性。，下面是一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将含有微腔室、通道和混合区的芯片进行打印，得到光刻掩膜；
2)将光刻胶置于硅片中心后依次进行匀胶、第一烘干烘干，得到匀好胶的硅片，将所述步骤1)得到的光刻掩膜与匀好胶的硅片的外边框对准后进行紫外曝光，得到曝光硅片，将所述曝光硅片进行第二烘干后用有机试剂PEGEMEA显影，再烘干坚模，得到阳模；
3)将PDMS预聚体和固化剂混合后，置于步骤2)得到的阳模上，静置后进行固化，得到PDMS印章；
4)将所述步骤3)得到的PDMS印章进行表面亲水化改性处理，得到处理印章，将趋化剂加入到处理印章的微腔室后，与载玻片贴合，得到测定土壤微生物趋化性芯片；
所述载玻片的表面经过亲水化改性处理。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)每两个微腔室通过一个通道进行连接，得到连接微腔室，每两个连接微腔室通过一个通道连接一个混合区。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述微腔室的直径为2mm～3mm；
所述通道的直径为0.3mm～0.8mm；
所述混合区的长度为6mm～7mm，所述混合区的宽度为2mm～4mm。
4.很据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)光刻胶包括光刻胶SU-8。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)匀胶包括：先800rpm～
1000rpm处理5s～15s，再1200rpm～1800rpm处理20s～40s。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)第一烘干包括：先60℃～
70℃处理10min～20min，再90℃～100℃处理1h～2h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)紫外照射的时间为6～8s。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)第二烘干包括：先60℃～
70℃处理4min～6min，再90℃～100℃处理40min～50min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)PDMS预聚体和固化剂的质量比为10～15:1。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)静置的时间为15min～
25min，所述固化的温度为60℃～70℃，所述固化的时间为2h～4h。

说明书全文

一种测定土壤 微 生物趋化性芯片的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学与环境技术领域，尤其涉及一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法。

背景技术

[0002] 土壤是地球上最大的生物资源库，特有的孔隙结构承载着数量庞大、多样性极为丰富的微生物群落，在土壤有机质分解和养分释放、能量转移等生物地球化学循环中起着重要作用。土壤中适合微生物生长繁殖的场所都有一定的离子浓度和营养成分，微生物能够感受周围环境中的化学物质，并沿着化学物质的浓度梯度定向运动，这种性质称为趋化性。微生物趋化性是微生物适应环境变化而生存的一种基本属性，能够帮助微生物更好地在外界环境中获得有利于自身的条件，更快地获取到自身所需的碳源或者能源，或是在微生物感受到环境中有害物质的刺激时，远离有害物质，避开环境的不良影响，是微生物在特定环境定居的一个重要生态学因素。营养物、异源污染物和水分条件等的不均匀分布致使土壤中微生物趋化现象普遍存在，趋化性微生物通过利用环境中碳源和氮源进行新陈代谢，不仅参与调节土壤微生物多样性及土壤养分的循环、分布等，并在土壤污染防治及土壤微生物修复等研究中意义重大。

[0003] 传统研究微生物趋化性的方法很多，各有其优缺点。毛细管检测法、群板检测法等方法能对微生物进行趋化性定性分析，但不能实现定量检测；游动细胞自动追踪检测法和栓细胞检测法可以对单个细胞的运动进行跟踪观察，为细菌趋化性机理和理论模型的研究提供了方法，但游动细胞自动追踪检测法每次只能追踪一个细胞，且需要高度复杂的数据记录设备，而栓细胞检测法不能对浓度梯度产生反应。这使得利用传统检测方法对细菌趋化性进行定量分析和对细菌运动进行精确表征较难实现。

[0004] 微流控芯片是现今出现的较新的检测技术，作为一种微加工和微操作手段，在检测微生物的趋化性时有很大优势。首先，微流控芯片与高水平的自动化操作技术相结合，不仅能够控制微流控芯片通道的构型，还能对内部流体的流动状态进行精确的控制，提供更为精确可控的趋化剂浓度梯度的方法。其次，微流控芯片的微通道尺寸很小，透明度高，便于通过显微镜观察微生物对浓度梯度的响应。通过显微摄像系统和图像分析技术进行细胞计数，可以对微生物数量进行精确地统计，还可以对细菌个体的趋化性响应进行直接观察。总之，这些基于微流控精确可控的化学梯度环境为研究化学信号对微生物动态和功能的影响带来全新的理念，具有更加微观、可控和可视化优势，是传统手段无法比拟的。但是目前的研究主要集中在大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌等常见易培养的单一菌株，且更多集中在趋化剂浓度梯度调控，对微生物所处的微环境的其它要素缺少调控，不能反映微生物在真实复杂环境中的行为。因此，构建基于原位、可控可视化的土壤微生物趋化性定量测定平台，对理解土壤微生物空间分布、植物根际微生物热区形成和利用微生物治理环境方面都具有重要意义。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法，能够原位、定量和可视化测定土壤微生物趋化性。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 1)将含有微腔室、通道和混合区的芯片进行打印，得到光刻掩膜；

[0009] 2)将光刻胶置于硅片中心后依次进行匀胶、第一烘干，得到匀好胶的硅片，将所述步骤1)得到的光刻掩膜与匀好胶的硅片的外边框对准后进行紫外曝光，得到曝光硅片，将所述曝光硅片进行第二烘干后用有机试剂PEGEMEA显影，再烘干坚模，得到阳模；

[0010] 3)将PDMS预聚体和固化剂混合后，置于步骤2)得到的阳模上，静置后进行固化，得到PDMS印章；

[0011] 4)将所述步骤3)得到的PDMS印章进行表面亲水化改性处理，得到处理印章，将趋化剂加入到处理印章的微腔室后，与载玻片贴合，得到测定土壤微生物趋化性芯片；

[0012] 所述载玻片的表面经过亲水化改性处理。

[0013] 优选的，所述步骤1)每两个微腔室通过一个通道进行连接，得到连接微腔室，每两个连接微腔室通过一个通道连接一个混合区。

[0014] 优选的，所述微腔室的直径为2mm～3mm；

[0015] 所述通道的直径为0.3mm～0.8mm；

[0016] 所述混合区的长度为6mm～7mm，所述混合区的宽度为2mm～4mm。

[0017] 优选的，所述步骤2)光刻胶包括光刻胶SU-8。

[0018] 优选的，所述步骤2)匀胶包括：先800rpm～1000rpm处理5s～15s，再1200rpm～1800rpm处理20s～40s。

[0019] 优选的，所述步骤2)第一烘干包括：先60℃～70℃处理10min～20min，再90℃～100℃处理1h～2h。

[0020] 优选的，所述步骤2)紫外照射的时间为6～8s。

[0021] 优选的，所述步骤2)第二烘干包括：先60℃～70℃处理4min～6min，再90℃～100℃处理40min～50min。

[0022] 优选的，所述步骤3)PDMS预聚体和固化剂的质量比为10～15:1。

[0023] 优选的，所述步骤3)静置的时间为15min～25min，所述固化的温度为60℃～70℃，所述固化的时间为2h～4h。

[0024] 本发明提供了一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法，包括以下步骤：1)将含有微腔室、通道和混合区的芯片进行打印，得到光刻掩膜；2)将光刻胶置于硅片中心后依次进行匀胶、第一烘干，得到匀好胶的硅片，将所述步骤1)得到的光刻掩膜与匀好胶的硅片的外边框对准后进行紫外曝光，得到曝光硅片，将所述曝光硅片进行第二烘干后用有机试剂PEGEMEA显影，再烘干坚模，得到阳模；3)将PDMS预聚体和固化剂混合后，置于步骤2)得到的阳模上，静置后进行固化，得到PDMS印章；4)将所述步骤3)得到的PDMS印章进行表面亲水化改性处理，得到处理印章，将趋化剂加入到处理印章的微腔室后，与载玻片贴合，得到测定土壤微生物趋化性芯片；所述载玻片的表面经过亲水化改性处理。

[0025] 采用本发明的制备方法制备得到的土壤微生物趋化性芯片埋入土壤原位检测微生物趋化性，再运用泵推法结合荧光染料染色法检测不同趋化剂腔室微生物量与活性，定量可视化表征土壤原位微生物对不同趋化剂的选择性趋化性。附图说明

[0026] 图1为整个光刻掩膜的示意图；

[0027] 图2为单个PDMS印章的光刻掩膜示意图；

[0028] 图3为根际、非根际芯片死菌活菌在不同培养天数时灰度直观情况；

[0029] 图4为根际、非根际芯片死菌活菌在不同培养天数时灰度变化趋势情况。

具体实施方式

[0030] 本发明提供了一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法，包括以下步骤：

[0031] 1)将含有微腔室、通道和混合区的芯片进行打印，得到光刻掩膜；

[0032] 2)将光刻胶置于硅片中心后依次进行匀胶、烘干，将所述步骤1)得到的光刻掩膜与匀好胶的硅片的外边框对准后进行紫外曝光，得到曝光硅片，将所述曝光硅片烘干后用有机试剂PEGEMEA显影，再烘干坚模，得到阳模；

[0033] 3)将PDMS预聚体和固化剂混合后，置于步骤2)得到的阳模上，静置后进行固化，得到PDMS印章；

[0034] 4)将所述步骤3)得到的PDMS印章进行表面亲水化改性处理，得到处理印章，将趋化剂加入到处理印章的微腔室后，与载玻片贴合，得到测定土壤微生物趋化性芯片；

[0035] 所述载玻片的表面经过亲水化改性处理。

[0036] 本发明将含有微腔室、通道和混合区的芯片进行打印，得到光刻掩膜。本发明优选使用Auto CAD绘制含有微腔室、通道和混合区的芯片，得到图案，将所述图案送至胶片公司，由胶片公司将图案打印在菲林胶片上，制成特定图案的胶片，即为光刻掩膜。

[0037] 在本发明中，每两个微腔室优选通过一个通道进行连接，得到连接微腔室，每两个连接微腔室优选通过一个通道连接一个混合区。在本发明中，所述微腔室的直径优选为2mm～3mm，所述微腔室的数量优选为4个，所述微腔室中可放置趋化剂，每个微腔室中趋化剂的放置量优选为2～4μl，所述趋化剂优选含有碳元素的溶液，所述溶液中碳元素的浓度优选为0～12g/L，在本发明中，所述趋化剂的作用是：通过趋化剂在微腔室和通道中的扩散作用，通道口附近的细菌感受到趋化剂的浓度梯度，作出相应的趋化反应，游动进入微腔室，通过微腔室中的细菌进行染色计数，来定量分析细菌的趋化反应。在本发明中，所述通道的直径优选为0.3mm～0.8mm，所述通道的数量优选为2个。在本发明中，所述混合区的长度优选为6mm～7mm，所述混合区的宽度优选为2mm～4mm，所述混合区的数量优选为1个，所述混合区的作用是：使进入土壤微生物趋化性芯片的微生物混匀，按其趋化性选择不同的微腔室。在本发明中，光刻掩膜的灰色区域为透光区域，其余部分不透光。在本发明中，所述光刻掩膜是直径为100mm的圆形菲林胶片。

[0038] 本发明将光刻胶置于硅片中心后依次进行匀胶、第一烘干，得到匀好胶的硅片，将得到的光刻掩膜与匀好胶的硅片的外边框对准后进行紫外曝光，得到曝光硅片，将所述曝光硅片进行第二烘干后用有机试剂PEGEMEA显影，再进行烘干坚模，得到阳模。

[0039] 在本发明中，所述硅片的直径优选为100mm，厚度优选为0.4mm。在本发明中，所述光刻胶优选包括光刻胶SU-8，本发明对所述光刻胶SU-8的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，在本发明中，所述光刻胶SU-8的使用量优选为每张硅片使用1～2ml。在本发明中，所述匀胶优选包括：先800rpm～1000rpm处理5s～15s，再1200rpm～1800rpm处理20s～40s，更优选先900rpm处理10s，再1500rpm处理30s。在本发明中，所述第一烘干优选包括：先
60℃～70℃处理10min～20min，再90℃～100℃处理1h～2h，更优选先65℃处理15min，再95℃处理2h。在本发明中，第二烘干优选包括：先60℃～70℃处理4min～6min，再90℃～100℃处理40min～50min。在本发明中，所述紫外照射的时间优选为6s～8s。经过紫外照射后，透光区域，紫外线和光刻胶反应固化，不透光区域未固化。在本发明中，所述坚模的条件优选包括：先65℃处理5min再135℃处理2h。

[0040] 本发明将PDMS预聚体和固化剂混合后，置于得到的阳模上，静置后进行固化，得到PDMS印章。

[0041] 在本发明中，所述阳模优选为已显影坚膜后的硅片。

[0042] 在本发明中，所述PDMS预聚体和固化剂的质量比优选为10～15:1，更优选为13:1，本发明对PDMS预聚体和固化剂的来源没有特殊限定，优选购买于产地为中国上海的以禄贸易(上海)有限公司，产品型号为 184即可，PDMS预聚体和固化剂为184中的配套产品。在本发明中，所述PDMS预聚体和固化剂的作用是制备PDMS。本发明优选将PDMS预聚体和固化剂在搅拌下混合，采用真空泵将PDMS中的气泡排除后，置于阳模上，厚度优选为4mm～6mm。在本发明中，所述静置的时间优选为15min～25min，更优选为20min；所述固化的温度优选为60℃～70℃，更优选为65℃，所述固化的时间优选为2h～4h，更优选为3h。本发明优选将固化后的阳模按照图2中图形上的边进行切割，得到PDMS印章。在本发明中，所述PDMS印章的长度优选为10mm～13mm，宽度优选为6.5mm～
9.5mm，厚度优选为2mm～4mm。

[0043] 本发明将得到的PDMS印章进行表面亲水化改性处理，得到处理印章，将趋化剂加入到处理印章的微腔室后，与载玻片贴合，得到测定土壤微生物趋化性芯片；所述载玻片的表面经过亲水化改性处理。

[0044] 本发明对所述PDMS印章和载玻片进行表面亲水化改性处理的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。在本发明中，每个微腔室中趋化剂的放置量优选为2～4μl，所述趋化剂优选含有碳元素的溶液，所述碳元素优选以葡萄糖的形式存在，所述溶液中葡萄糖的浓度优选为0～12g/L，在本发明中，所述趋化剂的作用是：通过趋化剂在微腔室和通道中的扩散作用，通道口附近的细菌感受到趋化剂的浓度梯度，作出相应的趋化反应，游动进入微腔室，通过微腔室中的细菌进行染色计数，来定量分析细菌的趋化反应。在本发明中，经过亲水化改性处理的PDMS印章和载玻片通过硅氧硅键的形成而粘连在一起。在本发明中，所述载玻片的大小优选与PDMS印章相同。

[0045] 本发明优选将制备得到的测定土壤微生物趋化性芯片放入土壤中，培养一周后，借助蠕动泵用荧光染料给不同微腔室的微生物进行染色，在显微镜下观察。

[0046] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0047] 实施例1

[0048] 土壤微生物趋化性芯片的构建方法包括结构设计、SU-8模板制作、PDMS印章制作及芯片构建。其步骤是：

[0049] A、结构设计：

[0050] 采用AutoCAD辅助制图工具设计结构，制作含有微腔室(图1中圆形部分，d＝2.6mm)和通道(图1中两个微腔室之间的连接管道，d＝0.5mm)的芯片。如图1所示，两通道设置一个入口，微生物从混合区(长×宽：6.5mm×3mm)进入含有趋化剂(每个微腔室各加3μL的0g/L和10g/L的葡萄糖溶液)的微腔室。将设计的结构以PDF格式送至公司进行打印得到光刻掩膜。掩膜中灰色区域为透光区域，而其余部分为不透光区域。

[0051] B、SU-8模板制作：

[0052] 将适量光刻胶SU-8滴在清洗干净并烘干的硅片中心，经过900rmin 10s和1500rmin 30s匀胶后，将硅片放在热平板上前烘(65℃烘15min，再95℃烘2h)。将掩膜与已匀胶的硅片的外边框对准，紫外照射6～8秒。透光区域，紫外线和光刻胶反应固化，而不透光区域未固化。将曝光后的硅片置于平板加热器上后烘(65℃烘5min，再95℃烘45min)；采用有机试剂PEGMEA将未经紫外曝光的光刻胶溶解掉，然后放在热平板坚模(先65℃烘5min，再135℃烘2h)，是为SU-8阳模，保存备用。

[0053] C、PDMS印章制作：

[0054] PDMS预聚体和固化剂( 184)13:1质量比混合，充分搅拌后，采用真空泵将PDMS中气泡排除后，倒在SU-8阳模上，厚度在.12～.24之间，常温静置20min。然后在65℃下固化3h后取出，将PDMS脱模按照图形上的边切割，即PDMS印章，待用。

[0055] D、芯片构建：

[0056] 采用氧等离子体将干净的载破片和PDMS印章进行表面亲水化改性处理，将趋化剂加入对应微腔室后，将玻片和PDMS贴合，此时，PDMS和玻片会因为硅氧硅键的形成而粘连在一起，芯片制作完成。

[0057] 实施例2

[0058] 采用实施例1制备得到的土壤微生物趋化性芯片，进行水稻土根际非根际土壤微生物对碳源的选择性趋向性。

[0059] 选取亚热带地区典型水稻田，将制作好的芯片埋入水稻根际和非根际的土壤中，运用泵推法结合死活细胞染色法检测活体微生物数量，探讨根际非根际条件下土壤原位微生物的选择性趋向性。以葡萄糖作为碳源，在微腔室内分别加入灭菌水和10g/L葡萄糖溶液，分别在5d，10d，20d采样，检测芯片不同微腔室内微生物的变化。

[0060] 如图所示，图3为根际、非根际芯片死菌活菌在不同培养天数时灰度直观情况，图4为根际、非根际芯片死菌活菌在不同培养天数时灰度变化趋势情况。以下CK是指：加无菌水溶液的微腔室内的微生物的数量。由图4所得结果可知，培养第5d时，活菌和死菌最大灰度值均为CK-根际处理，最低均为CK-非根际；培养第10d时，活菌和死菌最大灰度值分别为C-根际和CK-非根际，最低值分别为CK-非根际和C-根际；培养第20d时，活菌和死菌最大灰度值分别为CK-根际和C-根际，最低均为C-根际。可能是由于芯片中添加的外源葡萄糖碳浓度与根际碳浓度存在差异，对微生物生长存在抑制作用，在5d时，C处理活菌灰度值低于CK处理；随着培养时间增长，微生物通过自身调整，逐渐适应新的生存环境，外源碳的添加提供了微生物所需营养，繁殖数量大于CK处理，C-根际处理碳提供更充足，因此，在10d时，C处理的活菌灰度值大于CK处理，且C-根际处理死菌灰度值小于C-非根际；在第20d时，由于外源碳的添加有限，碳营养元素的提高小于微生物生长的需求，C-非根际处理营养缺乏更为显著，因此，C处理活菌灰度值小于CK处理，且C-非根际处理死菌灰度值大于C-根际。

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一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法

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