一种野生铁核桃粕中多肽的提取及抗氧化测定方法
技术领域
[0001] 本
发明属于肽或
蛋白质的制备技术领域，尤其涉及一种野
生铁核桃粕中多肽的提取及抗氧化测定方法。
背景技术
[0002] 目前，最接近的
现有技术：野生铁核桃(J.sigillata Dode)，树平均高度10～20m，多年生落叶乔木，它们的平均树龄可达百年，主要分布于我国的
云南、四川的南部等地。野生铁核桃具有较高的营养价值和商业价值。核桃蛋白是一种很好的
植物蛋白，它的主要成分含有蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白，分别占该品种核桃蛋白总量的6.81％、17.57％、5.33％和70.11％，由于受到植物品种性状特征的影响，优质品种的核桃如泡核桃和外来的美国山核桃等对核桃产业发展冲击，野生铁核桃的植物群落正在逐年递减，甚至在部分山区已经很难看到它的身影。以往野生铁核桃的主要用途是榨油，其野生铁核桃
核桃油中主要成分是亚油酸和亚麻酸，占比在70％以上。值得一提的是，野生铁核桃的硫含量在50％左右，这与人脑的脂肪含量基本相同。
[0003] 核桃粕是核桃
压榨制油过程中产生的副产品，其中30％以上含量为核桃蛋白，核桃粕是优质的物美价廉并且产量丰富的植物性蛋白源。核桃中优质蛋白的含量达到15％以上，它的真实消化率和净蛋白比值都较高，各种
氨基酸含量也都接近或超过人体必需量的标准值。虽然核桃粕具有以上所述的种种优点，但是在日常工业榨油过程中，提取核桃油后的核桃粕其作用大多为动物
饲料。因此，核桃粕未能得到充分的开发和利用。
[0004] 肽(Peptide)是由10～100个α-氨基酸脱
水缩合而形成的化合物，分子
质量低于10000Da，作为蛋白质
水解过程中的中间产物。核桃多肽溶解性较高，同时受pH的影响较小。
同时核桃多肽的浓度高，
粘度低，并且具有很强的还原能
力。
[0005] 现有技术对多肽进行分析主要分析对象是大豆多肽。随着对多肽的分析深入，分析过程中逐步对一些多肽的分子结构和生理活性间的结构关系有了清晰的了解，并且确定了多肽的医疗保健功能。
[0006] 综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中并无有效的能从核桃粕中提取多肽的方法。现有技术中提取多肽的方法，提取效率低，且方法复杂。
[0007] 解决上述技术问题的难度：在提取多肽过程中要严格控制复合酶的比例，加酶量以及酶解时间。
[0008] 解决上述技术问题的意义：促进核桃废弃物核桃粕的开发及利用。
发明内容
[0009] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种野生铁核桃粕中多肽的提取及抗氧化测定方法。本发明从核桃废弃物核桃粕中提取多肽，并分析多肽的抗氧化活性。
专利中的多肽提取技术及抗氧化方法均是参考别人文献，和现有技术类似。目前关于核桃粕多肽的分析未见报道。
[0010] 本发明是这样实现的，一种野生铁核桃粕中多肽的提取方法，所述野生铁核桃粕中多肽的提取方法包括以下步骤：
[0011] 步骤一，配制核桃粕溶液，向配制好的核桃粕溶液中加入NaOH，调节溶液pH值为中性；
[0012] 步骤二，向调节好的中性溶液中加入复合酶水解3小时；
[0013] 步骤三，在80～85℃下灭活蛋白酶10min；
[0014] 步骤四，利用离心机以3000r/min的速度离心15min，取上清，即为核桃粕多肽溶液。
[0015] 进一步，步骤一中，所述核桃粕溶液配制方法包括：
[0016] 首先，选取无虫蛀、无腐烂霉变的核桃粕，称量选取好的核桃粕50g，按核桃粕与水1：8的比例溶于水中，浸泡10h；
[0017] 其次，将浸泡好的核桃粕溶液用磁力
搅拌机搅拌打浆在20min，将打好的溶液静置至室温，即得核桃粕溶液。
[0018] 进一步，步骤二中，所述加入复合酶水解还包括：
[0019] 所述复合酶由中性蛋白酶：植物蛋白酶＝2：1调配而成；
[0020] 酶解时间为3小时，酶解
温度为50摄氏度，加酶量为8000U/g。
[0021] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述野生铁核桃粕中多肽的提取方法提取的野生铁核桃粕中多肽。
[0022] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述野生铁核桃粕中多肽制备的多肽医疗保健品。
[0023] 本发明的另一目的在于提供一种所述多肽抗氧化测定方法，所述多肽抗氧化测定方法包括：
[0024] (1)多肽对DPPH自由基清除能力的测定方法：
[0025] 吸取50μL制备好的核桃粕多肽溶液，添加2mL 0.19mmo1/L DPPH溶液，充分摇晃震动，在暗处、室温的条件下放置10min，然后在517nm
波长处比色测定，用蒸馏水作为空白；选择阿魏酸用于绘制标准的曲线，并且列出回归方程为y＝451.75x+31.31；
[0026] 自由基清除能力表示为每克样品中阿魏酸当量，单位为μmol FAE/g；
[0027] DPPH自由基清除率，单位为％，计算公式如下：
[0028]
[0029] 其中，A0表示DPPH溶液本身的吸光度即空白对照；A表示样品或者阳性对照的DPPH溶液的吸光度；
[0030] (2)多肽对FRAP/总抗氧化能力的测定方法：
[0031] 1)配制FRAP溶液：乙酸缓冲溶液、六水三氯化铁和10mmol/L的三吡啶基三嗪，以体积比10:1:l充分混匀；
[0032] 2)吸取100μL核桃粕多肽溶液加入3mL FRAP溶液充分混合，于37℃反应4min，在593nm波长处测定吸光度，用蒸馏水替代上清液作为空白；用
硫酸亚铁绘制标准曲线，建立回归方程为y＝6.24x+0.0005；FRAP表示为每g上清液中Fe2+浓度当量，单位为μmol FE/g；
[0033] (3)多肽对ABTS+清除能力的测定方法：
[0034] 第一步，配制ABTS工作液的配制：将7mmol/L的ABTS和1.45mmol/L的过
硫酸钾两种溶液等体积混合，于4℃条件下反应16h，得到ABTS工作液；
[0035] 第二步，吸取50μL核桃粕多肽溶液，加入2.8mL ABTS工作液，室温条件下反应6min，于734nm波长处测定吸光度，用水替代上清液作为空白；用Trolox绘制标准曲线，建立回归方程为y＝102.95x+1.5663；自由基清除能力表示为每克样品中Trolox当量，单位为μmol TE/g；
[0036]
[0037] 其中，A0表示ABTS溶液本身的吸光度即空白对照；A1表示样品或者阳性对照的ABTS溶液的吸光度。
[0038] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供一种利用野生核桃粕提取多肽的方法，提取效率高，且方法简单，同时本发明分析核桃粕多肽的抗氧化性为核桃的二次开发利用提供了基本的理论
基础，也为开发相关的功能性食物产品提供了有效直观的数据支持。
[0039] 本发明以云南野生铁核桃粕中的蛋白质水解度作为重要的评价指标，并且结合实际的生产工艺流程，之后最终确定提取核桃粕中蛋白质的工艺条件如下：进行酶解的适宜时间长度：4h，适宜的酶解温度：50℃，适宜进行酶解得酶浓度为8000U/g。抗氧化实验结果表明：核桃粕具有一定的抗氧化能力，为其进一步开发利用提供新思路。
附图说明
[0040] 图1是本发明
实施例提供的野生铁核桃粕中多肽的提取方法
流程图。
[0041] 图2是本发明实施例提供的提取时间对核桃粕多肽提取的影响示意图。
[0042] 图3是本发明实施例提供的提取温度对核桃粕多肽提取的影响示意图。
[0043] 图4是本发明实施例提供的酶浓度对核桃粕多肽提取的影响示意图。
[0044] 图5是本发明实施例提供的时间与酶浓度的交互作用分析图。
[0045] 图6是本发明实施例提供的时间与温度的交互作用分析图。
[0046] 图7是本发明实施例提供的温度与酶浓度的交互作用分析图。
具体实施方式
[0047] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0048] 现有技术中并无有效的能从核桃粕中提取多肽的方法。现有技术中提取多肽的方法，提取效率低，且方法复杂。
[0049] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种野生铁核桃粕中多肽的提取及抗氧化测定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0050] 如图1所示，本发明实施例提供的野生铁核桃粕中多肽的提取方法包括以下步骤：
[0051] S101，配制核桃粕溶液，向配制好的核桃粕溶液中加入NaOH，调节溶液pH值为中性。
[0052] S102，向调节好的中性溶液中加入复合酶水解3小时。
[0053] S103，在80～85℃下灭活蛋白酶10min。
[0054] S104，利用离心机以3000r/min的速度离心15min，取上清，即为核桃粕多肽溶液。
[0055] 步骤S101中，本发明实施例提供的核桃粕溶液配制方法包括：
[0056] 首先，选取无虫蛀、无腐烂霉变的核桃粕，称量选取好的核桃粕50g，按核桃粕与水1：8的比例溶于水中，浸泡10h。
[0057] 其次，将浸泡好的核桃粕溶液用磁力搅拌机搅拌打浆在20min，将打好的溶液静置至室温，即得核桃粕溶液。
[0058] 步骤S102中，本发明实施例提供的加入复合酶水解还包括：
[0059] 所述复合酶由中性蛋白酶：植物蛋白酶＝2：1调配而成。
[0060] 酶解时间为3小时，酶解温度为50摄氏度，加酶量为8000U/g。
[0061] 步骤S101中，本发明实施例提供的多肽抗氧化测定方法包括：
[0062] (1)多肽对DPPH自由基清除能力的测定方法：
[0063] 吸取50μL制备好的核桃粕多肽溶液，添加2mL 0.19mmo1/L DPPH溶液，充分摇晃震动，在暗处、室温的条件下放置10min，然后在517nm波长处比色测定，用蒸馏水作为空白；选择阿魏酸用于绘制标准的曲线，并且列出回归方程为y＝451.75x+31.31。
[0064] 自由基清除能力表示为每克样品中阿魏酸当量，单位为μmol FAE/g。
[0065] DPPH自由基清除率，单位为％，计算公式如下：
[0066]
[0067] 其中，A0表示DPPH溶液本身的吸光度即空白对照；A表示样品或者阳性对照的DPPH溶液的吸光度。
[0068] (2)多肽对FRAP/总抗氧化能力的测定方法：
[0069] 1)配制FRAP溶液：乙酸缓冲溶液、六水三氯化铁和10mmol/L的三吡啶基三嗪，以体积比10:1:l充分混匀。
[0070] 2)吸取100μL核桃粕多肽溶液加入3mL FRAP溶液充分混合，于37℃反应4min，在593nm波长处测定吸光度，用蒸馏水替代上清液作为空白；用硫酸亚铁绘制标准曲线，建立回归方程为y＝6.24x+0.0005；FRAP表示为每g上清液中Fe2+浓度当量，单位为μmol FE/g。
[0071] (3)多肽对ABTS+清除能力的测定方法：
[0072] 第一步，配制ABTS工作液的配制：将7mmol/L的ABTS和1.45mmol/L的过
硫酸钾两种溶液等体积混合，于4℃条件下反应16h，得到ABTS工作液。
[0073] 第二步，吸取50μL核桃粕多肽溶液，加入2.8mL ABTS工作液，室温条件下反应6min，于734nm波长处测定吸光度，用水替代上清液作为空白；用Trolox绘制标准曲线，建立回归方程为y＝102.95x+1.5663；自由基清除能力表示为每克样品中Trolox当量，单位为μmol TE/g。
[0074]
[0075] 其中，A0表示ABTS溶液本身的吸光度即空白对照；A1表示样品或者阳性对照的ABTS溶液的吸光度。
[0076] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述野生铁核桃粕中多肽的提取方法提取的野生铁核桃粕中多肽。
[0077] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0078] 实施例1：
[0079] 本发明使用复合酶酶解野生铁核桃粕中蛋白质，分析不同酶解时间、酶解温度和酶浓度下产物的不同得率和多肽的抗氧化的特性。
[0080] 1材料与方法
[0081] 1.1实验原料
[0082] 实验材料云南野生铁核桃粕取自云南大理漾濞核桃有限责任公司。
[0084]
碳酸氢钠、浓
盐酸、浓硫酸、甲基红、
乙醇、
硼酸、亚甲基蓝、七水合硫酸亚铁、甲醇、六水三氯化铁、乙酸钠、
冰乙酸、TPTZ、阿魏酸、ABTS、过硫酸钾、DPPH
[0085]4种酶类 酶活
中性蛋白酶 100u/mg
植物蛋白酶 300u/mg
碱性蛋白酶 200u/mg
木瓜蛋白酶 800u/mg
[0086] 1.3实验器材
[0087]
[0088]
[0089] 1.4原料预处理
[0090] 1.4.1称取核桃粕
[0091] 实验之前选取无虫蛀、无腐烂霉变的核桃粕。
[0092] 1.4.2料液混合，均质
[0093] 称取出50g核桃粕样品，按1：8的比例溶于水中，浸泡满10h。将浸泡好的核桃粕溶液用磁力搅拌机进行搅拌打浆，时长控制在20min，这样的方式有助于核桃粕中蛋白质的溶出。将打好的溶液静置至室温。
[0094] 1.5酶的选取
[0095] 1.5.1单酶的比较
[0096] 本发明选取4种酶(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、植物蛋白酶、碱性蛋白酶)在各自理论最适条件下酶解核桃粕蛋白，以水解度为指标，筛选出酶解核桃粕蛋白的最佳用酶。
[0097] 表1不同蛋白酶对核桃粕蛋白的水解度
[0098]酶种类 水解度
木瓜蛋白酶 0.1504
中性蛋白酶 0.2194
植物蛋白酶 0.1950
碱性蛋白酶 0.1316
[0099] 由表1可见，在相同的酶解条件下，中性蛋白酶和植物蛋白酶对核桃粕溶液的酶解度较高。
[0100] 1.5.2酶的复配
[0101] 为提高水解度现一般都采用复合蛋白酶，能比较彻底水解核桃粕蛋白。以水解度为指标，得出最佳的复合酶的配比。
[0102] 表2不同比例复合酶不同蛋白酶对核桃粕蛋白的水解度
[0103] 复合酶比例 水解度中性蛋白酶：植物蛋白酶＝3:1 0.4387
中性蛋白酶：植物蛋白酶＝2:1 0.5014
中性蛋白酶：植物蛋白酶＝1:1 0.3760
中性蛋白酶：植物蛋白酶＝1:2 0.3290
中性蛋白酶：植物蛋白酶＝1:3 0.4387
[0104] 由表2可见，当中性蛋白酶：植物蛋白酶为2:1时，核桃粕溶液的水解度最高，所以最终决定选用复合酶(中性蛋白酶：植物蛋白酶＝2：1)作为本次实验的水解酶。
[0105] 1.6多肽提取制备
[0106] 1.6.1核桃粕多肽提取流程
[0107] 核桃粕溶液→NaOH调溶液pH值为中性→加入复合酶水解2.9h→80～85℃灭活蛋白酶10min→置于3000r/min离心机中离心15min→取上清→得到核桃粕多肽溶液[0108] 1.7复合酶水解核桃粕单因素试验
[0109] 1.7.1酶解时间对核桃粕多肽提取的影响
[0110] 取20mL配制好的核桃粕溶液，加酶量为8000U/g，温度设置为50℃时，设置时长分别为1h，2h，3h，4h，5h进行水解，分析酶解时间对核桃粕中核桃蛋白水解程度的影响。
[0111] 1.7.2酶解温度对核桃粕多肽提取的影响
[0112] 取20mL配制好的核桃粕溶液，加酶量为8000U/g，水解时长为4h时，设置温度分别为40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，分析温度对核桃粕中核桃蛋白水解程度的影响。
[0113] 1.7.3蛋白酶浓度对核桃粕多肽提取的影响
[0114] 取20mL配制好的核桃粕溶液，温度为50℃时，设置加酶量为4000U/g，6000U/g，8000U/g，10000U/g，12000U/g，水解时长为4h，分析酶浓度对核桃粕中核桃蛋白水解程度的影响。
[0115] 1.7.4酶解条件的响应面试验
[0116] 根据CCD试验设计原理进行三因素五水平试验设计，利用
软件设计专家进行数据拟合优化云南野生铁核桃粕多肽提取制备工艺。共设计20个试验点，用来估计试验误差。试验因素和水平见表3。
[0117] 表3响应面试验水平因素
[0118]
[0119] 1.8核桃粕蛋白质含量的测定
[0120] 根据国标凯氏定氮法来进行核桃粕蛋白质的测定。
[0121] 1.9核桃粕蛋白质水解度的测定
[0122] 本发明采用简易pH-stat法来测定核桃粕蛋白的水解度。
[0123]
[0124]
[0125] 1.10核桃粕多肽抗氧化能力测定
[0126] 1.10.1野生铁核桃粕中多肽对DPPH自由基清除能力的测定
[0127] 分别吸取50μL核桃粕酶解上清液，添加2mL 0.19mmo1/L DPPH溶液，摇晃震动充分后，在暗处满足室温的条件下放置10min，然后在517nm波长处比色测定，用蒸馏水替代上清液作为空白。选择阿魏酸用于绘制标准的曲线，并且列出回归方程为y＝451.75x+31.31。自由基清除能力表示为每克样品中阿魏酸当量(μmol FAE/g)。
[0128]
[0129] 1.10.2野生铁核桃粕中多肽对FRAP/总抗氧化能力的测定
[0130] FRAP溶液的配制：乙酸缓冲溶液、六水三氯化铁和10mmol/L的三吡啶基三嗪，以体积比10:1:l充分混匀。
[0131] 吸取100μL核桃粕酶解上清液加入3mL FRAP溶液充分混合，于37℃反应4min，在593nm波长处测定吸光度，用蒸馏水替代上清液作为空白。用硫酸亚铁绘制标准曲线，建立回归方程为y＝6.24x+0.0005。FRAP表示为每g上清液中Fe2+浓度当量(μmol FE/g)。
[0132] 1.10.3野生铁核桃粕中多肽对ABTS^+·清除能力的测定
[0133] ABTS工作液的配制：将7mmol/L的ABTS和1.45mmol/L的过硫酸钾两种溶液等体积混合，于4℃条件下反应16h，得到ABTS工作液。
[0134] 吸取50μL核桃粕酶解上清液，加入2.8mL ABTS工作液，室温条件下反应6min，于734nm波长处测定吸光度，用水替代上清液作为空白。用Trolox绘制标准曲线，建立回归方程为y＝102.95x+1.5663。自由基清除能力表示为每克样品中Trolox当量(μmol TE/g)。
[0135]
[0136] 2.下面结合结果与分析对本发明作进一步描述。
[0137] 2.1单因素试验结果
[0138] 2.1.1酶解时间对核桃粕蛋白提取的影响
[0139] 由图2可见，酶解温度、酶浓度都相同的条件下，随着酶解时长的增加，水解度呈先上升后逐渐平缓的趋势，当酶解时间大于3h后，水解度便无明显上升。过多的增加反应的时长并不能显著地增加水解度。因此，选择3h的酶解时间比较理想。
[0140] 2.1.2酶解温度对核桃粕蛋白提取的影响
[0141] 由图3可见，在相同的酶解时间、酶浓度条件下，水解度随着酶解温度的提高呈现先上升后下降的趋势，即随着温度的升高，核桃粕蛋白的水解程度逐渐变大，但当达到一定温度后，水解度开始下降。主要是由于酶解温度升高，蛋白酶逐渐失活，蛋白质也逐渐变性，从而降低了酶解度，导致水解度降低。所以选取的最佳多肽提取温度为50℃。
[0142] 2.1.3酶浓度对核桃粕蛋白提取的影响
[0143] 从图4可以看出，酶解温度、酶浓度都相同的条件下，随着酶浓度的增加，核桃粕蛋白水解度呈逐渐上升趋势，当酶浓度大于某一值之后，水解度变呈平缓趋势，这是因为当酶的浓度上升到一定的值的时候，会出现水解度的增加程度逐渐趋于平缓的现象，因当酶浓度接近饱和时，底物的量有限，水解度就不会跟着酶浓度的上升而显著的变化。考虑到
制造过程中的成本及酶含量过于高则会使反应系统混入杂质，从而降低多肽的产品质量。本发明选择为8000U/g最适酶浓度。
[0144] 2.2响应面优化设计试验
[0145] 2.1.1响应面试验方案及结果
[0146] 利用软件设计专家进行数据拟合，试验设计与结果见表4.
[0147] 表4 Central Composite Design试验设计及结果
[0148]
[0149]
[0150] 2.1.2模型的建立与显著性检验
[0151] 以云南野生铁核桃粕中蛋白质水解度为响应值的响应面实验设计与结果，通过统计分析软件Design-Expert对表4中实验数据进行二次多项式回归拟合，得到野生铁核桃粕中蛋白质水解度(Y)对酶解时间(X1)、酶解温度(X2)、酶浓度(X3)的二次回归多元方程如下：
[0152] Y＝0.2357-0.0004X1+0.0083X2+0.0002X3+0.0027X1X2-0.0004X1X3-0.0094X2X3-0.0212X12-0.0274X22-0.0255X32
[0153] 表5回归模型方差分析表
[0154]
[0155]
[0156] 注：*.P<0.05，差异显著；**.P<0.01，差异极显著。
[0157] 由表5可知，模型项的P值为0.0013，表明该模型回归极显著(P<0.01)。失拟项P值为0.1068>0.05，表明呈现不显著状态。该模型和纯误差的平方和以及均方值均较低。该模型的R2＝0.8840，
信噪比为7.5389>4，说明模型与试验拟合程度高，进而可以用于3个因素对提取结果的预测。综合以上各项数据表明本发明方法可靠，各变量水平间的设计合理，因此可用该回归模型代表实验真实点对实验结果进行分析。
[0158] 在实际生产中以上述条件进行提取，而得到的云南野生铁核桃粕中蛋白质的水解度为0.2087，该数值与理论预测数值0.2152相差0.0065，说明该模型具有较好的分析能力，实际结果证实实验优化得到的工艺参数是可靠的，重现性较好。
[0159] 2.1.3交互作用的响应面分析
[0160] 通过软件设计专家分析得到的本发明的响应面及等高线如图5至图7所示。
[0161] 2.3云南野生铁核桃粕中多肽的抗氧化活性
[0162] 由表6可见，野生铁核桃粕中多肽具有一定的抗氧化能力。其中DPPH自由基清除能力为(11.13±1.31)μmol FAE/g，铁离子还原/总抗氧化能力为(29.20±0.12)μmol FE/g，总抗氧化能力为(211.25±11.18)μmol TE/g。
[0163] 表6云南野生铁核桃粕中多肽的抗氧化测定
[0164]
[0165]
[0166] 本发明以云南野生铁核桃粕中的蛋白质水解度作为重要的评价指标，并且结合实际的生产工艺流程，之后最终确定提取核桃粕中蛋白质的工艺条件如下：进行酶解的适宜时间长度：4h，适宜的酶解温度：50℃，适宜进行酶解得酶浓度为8000U/g。抗氧化实验结果表明：核桃粕具有一定的抗氧化能力，为其进一步开发利用提供新思路。
[0167] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
