技术领域
[0001] 本
发明涉及太门哲罗卵子
质量的物理评价方法。
背景技术
[0002] 太门哲罗鲑属鲑科Salmonisdae、哲罗鲑属Hucho。太门哲罗鲑主要分布在俄罗斯、中国、蒙古和日本。目前哲罗鲑在我国已经濒危，仅乌苏里江，黑龙江和新疆的哈纳斯湖有少量的繁殖群体生存。太门哲罗鲑作为我国土著冷
水性鱼类的典型代表，无论从种质资源保护，还是从养殖效益考虑，研究该鱼都具有极其重要的意义和社会价值。太门哲罗鲑是我国少数几种土著鲑科鱼类中唯一的大型鱼类，属珍稀名贵品种，经研究太门哲罗鲑人工繁殖成功，并实现了仔鱼
摄食人工
饲料的规模化驯化。太门哲罗鲑经过10多年的研究推广，目前该鱼已在
云南、四川、黑龙江、辽宁、吉林和山东等全国20多个省市自治区进行了推广养殖和增殖放流，深受养殖户和社会的欢迎。近年随着太门哲罗鲑人工养殖产业的扩大，苗种的需求量也在成倍的增长，在实际生产过程中出现了成熟卵子优劣参差不齐现象。由于太门哲罗鲑受精卵培育要求在4-8°C清澈的流水环境下孵化时间长达30天以上，并且在孵化过程极易感染水霉(
真菌的一种)，由于鱼卵主要由
蛋白质组成，而蛋白质又是水霉优良天然培养基，特别是死亡或者质量较差的受精卵不但自身极易感染水霉，而且会将好的鱼卵成片的传染，导致卵子的受精率和孵化率极大的降低，个别孵化桶孵化率甚至不到10%。即使受精卵能顺利度过孵化阶段存活下来，但由于部分卵子本身质量优劣差异较大，导致鱼苗破膜后的死亡率和畸形率也十分高。以上问题，不但在养殖过程中降低了生产效率，同时也极大浪费了物质和经济资源，严重的制约了太门哲罗鲑种质资源复壮和养殖产业的进一步发展，因此，太 门哲罗鲑的成熟卵子优劣的早期辨别已成为亟待解决的
瓶颈问题。
[0003] 太门哲罗鲑在我国规模化人工开发时间较短，因此太门哲罗鲑成熟的卵子的评价目前尚无有效的方法，只能是人工繁殖过程中由操作人员凭经验直观的评价。由于为保证卵子的成活率，成熟卵子自亲鱼
腹腔取出后必须要在2h内完成人工受精，因此人工繁殖过程中必须要求在有限时间内完成卵子优劣的辨别。由于时间紧迫和操作人员技术水平不同，导致卵子优劣的评价误差十分的大，也就导致目前部分太门哲罗鲑成熟卵子的发眼率不足10%，破膜苗种畸形率高达20%，上浮苗种成活率不足60%。
发明内容
[0004] 本发明是要解决现有的太门哲罗鲑繁殖过程中成熟的卵子的评价方法是由操作人员凭经验直观的感觉，不能实现早期、快速和准确评价，从而导致受精率、孵化率降低，破膜苗种畸形率和上浮苗种死亡率增高的技术问题，而提供一种快速物理辨别太门哲罗鲑成熟卵子优劣的方法。
[0005] 本发明一种快速物理辨别太门哲罗鲑成熟卵子优劣的方法按以下步骤进行:
[0006] 一、将鲑鱼用卵子缓冲清洗液加入到洁净的产卵盆中；[0007] 二、将性成熟的太门哲罗鲑雌性亲鱼麻醉，将成熟卵子从鱼体腹腔中挤出至盛有鲑鱼用卵子缓冲清洗液的产卵盆内，一个产卵盆只放一条亲鱼的成熟卵子，然后将产卵盆放置于通
风避光处；
[0008] 三、从产卵盆随机取出数粒鱼卵，加入到清水中静止25~30min后，测量单粒鱼卵的重量和直径，接着计算出单粒鱼卵重量的平均值X1和标准差SV1，单粒鱼卵直径的平均值X2和标准差SV2 ;按CV1=(SV1A1) X100计算鱼卵重量的离散系数CV1，按CV2=(SV2A2) x ioo计算鱼卵直径的离散系数CV2 ；
[0009] 四、从产卵盆随机取出数粒鱼卵，测量每粒鱼卵的脂肪滴分布
密度，并计算出脂肪滴分布密度的平均值X3 ；
[0010] 五、若同时满足条件①、②、③、④和⑤，则判定该亲鱼的鱼卵为优级；其中条件①为 62.262mg ^ X1 ^ 65.145mg ;条件②为 CV1 ( 3.207 ;条件③为 5.610mm ≤ X2 ≤5.878mm ;条件④为CV2 ( 2.948 ;条件⑤为12.8个/mm2≤X3≤19.4个/mm2 ;
[0011] 六、不满足优级标准，但同时满足条件⑥、⑦、⑧、⑨和⑩，则判定该亲鱼的鱼卵为中级；其中条件⑥为59.912mg ( X1 ;条件⑦为CV1 ( 4.461 ;条件⑧为5.545mm ( X2< 5.878mm ;条件⑨为CV2 ( 3.339 ;条件⑩为9.7个/mm2≤X3≤22.6 ;
[0012] 七、不满足中级标准的鱼卵判定为差级；完成太门哲罗鲑成熟卵子优劣的辨别。
[0013] 本发明采用采用物理测量和
生物统计技术相结合，测量成熟鱼卵的重量、直径、月旨肪滴的分布密度等物理指标，做为评价卵子优劣的间接指标，但其具有早期、快速和便捷的特性，同时很短的时间内就能完成，对太门哲罗鲑成熟卵子的下一步处理没有任何影响。能够在太门哲罗鲑成熟卵子尚未受精前，对卵子优劣实现早期评价，提前快速淘汰劣质卵子。以这些数据为
基础确定出分级标准，保留优级的鱼卵，进行人工培育，对于中级的成熟鱼卵也保留进行人工培育，生产过程中如养殖孵化设施不够，可与其他中级卵混合培育，但要坚决避免与优级卵混在一起培育，有效降低人工繁殖过程中真菌的相互传染，以免影响优级卵的效果，而对于差级的成熟鱼卵及时淘汰，没必要继续进行人工培育，可用作鱼子酱使用。用本方法判定的优级太门哲罗鲑卵子，其受精率大于95%、发眼率大于90%、畸形率小于1.5%，上浮苗种的成活率大于85% ;用本发明方法判定的中级太门哲罗鲑卵子，其受精率达到75%~95%、发眼率达到70%~90%、畸形率在1.5%~2.4%,上浮苗种的成活率达到65%~85% ;用本发明的方法判定的差级太门哲罗鲑卵子，其受精率小于75%、发眼率达小于70%、畸形率大于2.4%，上浮苗种的成活率小于65%。本发明的方法可用于太门哲罗鲑养殖领域。
附图说明
[0014] 图1是试验I中鱼卵脂肪滴分布密度测量图；
具体实施方式
[0015] 具体实施方式一:本实施方式的一种快速物理辨别太门哲罗鲑成熟卵子优劣的方法按以下步骤进行:
[0016] 一、将鲑鱼用卵子缓冲清洗液加入到洁净的产卵盆中；
[0017] 二、将性成熟的太门哲罗鲑雌性亲鱼麻醉，将成熟卵子从鱼体腹腔中挤出至盛有鲑鱼用卵子缓冲清洗液的产卵盆内，一个产卵盆只放一条亲鱼的成熟卵子，然后将产卵盆放置于
通风避光处；
[0018] 三、从产卵盆随机取出数粒鱼卵，加入到清水中静止25~30min后，测量单粒鱼卵的重量和直径，接着计算出单粒鱼卵重量的平均值X1和标准差SV1，单粒鱼卵直径的平均值X2和标准差SV2 ;按CV1=(SV1A1) X100计算鱼卵重量的离散系数CV1，按CV2=(SV2A2) x ioo计算鱼卵直径的离散系数CV2 ；
[0019] 四、从产卵盆随机取出数粒鱼卵，测量每粒鱼卵的脂肪滴分布密度，并计算出脂肪滴分布密度的平均值X3 ；
[0020] 五、若同时满足条件①、②、③、④和⑤，则判定该亲鱼的鱼卵为优级；其中条件①为 62.262mg ^ X1 ^ 65.145mg ;条件②为 CV1 ( 3.207 ;条件③为 5.610mm ≤ X2 ≤ 5.878mm ;条件④为CV2 ( 2.948 ;条件⑤为12.8个/mm2≤X3≤19.4个/mm2 ;
[0021] 六、不满足优级标准，但同时满足条件⑥、⑦、⑧、⑨和⑩，则判定该亲鱼的鱼卵为中级；其中条件⑥为59.912mg ( X1 ;条件⑦为CV1 ( 4.461 ;条件⑧为5.545mm ( X2< 5.878mm ;条件⑨为CV2 ( 3.339 ;条件⑩为9.7个/mm2≤X3≤22.6 ;
[0022] 七、不满足中级标准的鱼卵判定为差级；完成太门哲罗鲑成熟卵子优劣的辨别。
[0023] 具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一中所述的鲑鱼用卵子缓冲清洗液按以下方法配制:向I升蒸馏水中依次加入NaC18.0g、KC10.3g，CaCl20.3g,NaHCO30.04g,搅拌至溶解，得到鲑鱼用卵子缓冲清洗液。其它与具体实施方式一相同。
[0024] 具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:单粒鱼卵重量、鱼卵重量平均值X1的测量方法如下:在被测的鱼卵中随机
抽取鱼卵组成n组，每组m粒卵子，将卵子带的水分用
滤纸吸干，然后将第i组的m粒卵子放入分析天平上测量，记录各组卵子的总重量Gi,再按单粒鱼卵重量Ai=GiAi计算出第i组的单粒鱼卵重量Ai ;其中i=l，2，3，......，n ;单粒鱼卵重量平均值X1= (AjA2+......+Ai+......+An)/n。其他与具体实施方式
一或二相同。
[0025] 具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式三不同的是单粒鱼卵重量、鱼卵重量平均值X1的测量方法中n=25~30。其它与具体实施方式三相同。
[0026] 具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式三或四不同的是单粒鱼卵重量、鱼卵重量平均值X1的测量方法中m=5~8。其它与具体实施方式三或四相同。
[0027] 具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是单粒鱼卵直径的测量方法如下:随机抽取25~30粒鱼卵，分别放置在带有的最小刻度为1mm的
钢板尺上，用
数码相机照相，得到图像，测量图像中鱼卵的长度X和Imm标尺在图像中的长度Y，通过公式为B = X/Y计算，得到鱼卵直径B，单位为mm，即完成了鱼卵直径的测量。其它与具体实施方式一至五之一相同。
[0028] 具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是脂肪滴的分布密度的测量方法如下:用吸管将鱼卵放置
载玻片上，将带有卵子的载玻片一起放置在解剖镜下，上下左右调节载玻片，使卵子的最顶端正好在解剖镜的物镜下，在显微成像系统下拍摄卵子最顶端的照片一张，用显微成像
软件在图像中心
位置取面积为Z的圆，Z的单位为mm2，计算圆内的脂肪滴个数B，其中脂肪滴> 1/2的面积在圆内的脂肪滴按照I个脂肪滴进行统计；脂肪滴分布密度C=B/Z。其它与具体实施方式一至六之一相同。[0029] 具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式七不同的是Z=10mm2。其它与具体实施方式七相同。[0030] 具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤三中从产卵盆随机取出的鱼卵的粒数为180~200粒。其它与具体实施方式一至八之一相同。[0031] 具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤四中从产卵盆随机取出的鱼卵的粒数为30~40粒。其它与具体实施方式一至八之一相同。[0032] 用下面的试验验证本发明的有益效果:[0033] 试验1、本试验的一种快速物理辨别太门哲罗鲑成熟卵子优劣的方法按以下步骤进行:[0034] 一、将鲑鱼用卵子缓冲清洗液加入到6个洁净的产卵盆中；所述的鲑鱼用卵子缓冲清洗液按以下方法配制::向I升蒸馏水中依次加入NaC18.0g、KC10.3g, CaCl20.3g,NaHCO30.04g,搅拌至溶解，得到鲑鱼用卵子缓冲清洗液；将产卵盆依次编号为I #、2 #、3#、4 #、5 #、6 #、7 #、8 #、9 #、10 #、11 #和 12 # ;[0035] 二、将12条性成熟的太门哲罗鲑雌性亲鱼麻醉，分别将每条亲鱼的成熟卵子从鱼体腹腔中挤出至产卵盆的鲑鱼用卵子缓冲清洗液中，每条亲鱼对应一个产卵盆，然后将各个产卵盆放置于通风避光处；[0036] 三、从1#产卵盆随机取出200粒鱼卵，加入到清水中静止30min后，再从中随机抽取鱼卵组成30组，每组5粒鱼卵，将卵子带的水分用滤纸吸干，然后将第I组的5粒卵子放入分析天平上测量，记录第I组卵子的总重量G1，再按单粒鱼卵重量A1=G1/^计算出第I组的单粒鱼卵重量A1 ;同理计算出其余各组的单粒鱼卵重量A2, A3,……，A3tl ;按&=(A^A2+……+A3Q)/30计算出单粒鱼卵重量平均值X1 ;再计算出单粒鱼卵重量标准差SV1,再按CV1=(SV1A1) X 100计算鱼卵重量离散系数CV1 ;再从I #产卵盆中随机抽取30粒鱼卵，分别放置在带有最小刻度为1_的钢板尺上，用数码相机照相，得到图像，再用计算机
图像处理测量软件，测量图像中鱼卵的长度X和Imm标尺在图像中的长度Y，通过公式为B = X/Y计算，得到鱼卵直径B，单位为mm，将测量得到的各粒鱼卵直径的平均值X2 ;然后计算得标准差SV2 ;按CV2=(SV2A2) X 100计算鱼卵直径的离散系数CV2 ；[0037] 四、从I #产卵盆中随机取出30粒鱼卵，每粒鱼卵的脂肪滴的分布密度的测量方法如下:用吸管将鱼卵放置载玻片上，将带有卵子的载玻片一起放置在解剖镜下，上下左右调节载玻片，使卵子的最顶端正好在解剖镜的物镜下，在显微成像系统下拍摄卵子最顶端的照片一张，用显微成像软件在图像中心位置取面积为IOmm2的圆，如图1所示，计算圆内的脂肪滴个数B，其中脂肪滴> 1/2的面积在圆内的脂肪滴按照I个脂肪滴进行统计；按脂肪滴分布密度C=B/10计算该粒鱼卵脂肪滴分布密度C ;并计算出这30粒鱼卵的脂肪滴分布密度的平均值X3 ；[0038]同理按步骤三和四，测出 2 #、3 #、4 #、5 #、6 #、7 #、8 #、9 #、10 #、11 #和12 #产卵盆中鱼卵的XpCVpXyCV2和X3的值，结果如表1所示；[0039] 表1亲鱼鱼卵的测量结果[0040]
[0041] 五、若同时满足条件①、②、③、④和⑤，则判定该亲鱼的鱼卵为优级；其中条件①为 62.262mg ≤ X1 ≤ 65.145mg ;条件②为 CV1 ≤ 3.207 ;条件③为 5.610mm ≤ X2 ≤ 5.878mm ;
条件④为CV2 ≤ 2.948 ;条件⑤为12.8个/mm2≤X3≤19.4个/mm2 ;
[0042] 六、不满足优级标准，但同时满足条件⑥、⑦、⑧、⑨和⑩，则判定该亲鱼的鱼卵为中级；其中条件⑥为59.912mg ≤ X1 ;条件⑦为CV1 ≤ 4.461 ;条件⑧为5.545mm ( X2
< 5.878mm ;条件⑨为CV2 ≤3.339 ;条件⑩为9.7个/mm2≤X3≤22.6 ;
[0043] 七、不满足中级标准的鱼卵判定为差级；完成太门哲罗鲑成熟卵子优劣的辨别。
[0044] 根据步骤五、六和七进行辨别后的优劣结果如表2所示，
[0045] 表2亲鱼鱼卵的优劣结果
[0046]
[0047]从 I #、2 #、3 #、4 #、5 #、6 #、7 #、8 #、9 #、10 #、11 #和 12 #产卵盆中各分别随机取出5000粒鱼卵，人工受精后，放在
温度为4~8 °C清澈的流水环境下进行单独孵化，即每条鱼的鱼卵一个孵化箱，待孵化10天后，测定鱼卵的受精率，待孵化22天后测定鱼卵的发眼率，待受精卵全部破膜后统计畸形率，待鱼苗上浮后统计上浮苗种的成活率。得到的养殖生物学性状具体指标结果如表3所示，
[0048] 表3养殖生物学性状具体指标结果
[0049]
[0050] 本试验的6 #产卵盆中的鱼卵在孵化过程感染了氺霉，水霉导致卵子的受精率和孵化率大大的降低。从此养殖生物学性状具体测试指标来看，本试验对于鱼卵的评价方法是可信的。本试验采用物理测量和生物统计技术相结合，测量成熟鱼卵的重量、直径、脂肪滴的分布密度等物理指标，做为评价卵子优劣的间接指标，具有早期、快速和便捷的特性，同时在1.5h的时间内就能完成，对太门哲罗鲑成熟卵子的下一步处理没有任何影响。能够在太门哲罗鲑成熟卵子尚未受精前，对卵子优劣实现早期评价。
