技术领域
[0001] 本
发明属于
生物检测技术领域，涉及微量样本快速处理，快速扩增和
免疫层析判读等多项技术集成和改进的便携式检测平台，尤其适用于室外快速检测。
背景技术
[0002] PCR又称聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction )，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA
片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。PCR的问世，引起了一场分子生物学的革命，它大大加快了各种生物基因组结构研究的过程，有
力地推动了现代生物学由细胞
水平向分子水平、基因水平的发展，在分子生物学史上具有跨时代的意义。
[0003] 近些年来，PCR技术发展突飞猛进，不但在
基础生物学研究方面起到了重要的工具作用，在医学检测，防疫学检测等领域等发挥的作用越来越重要，在医学检测方面，已经有成熟的
荧光定量PCR产品面世，不但能够检测传染病系列，还能检测目标SNP位点、癌症检测等。为
疾病诊断提供直接的证据。另外，在农业、工业、海关、检疫等方面的检测学应用上，已经有机构或公司开始研发各类荧光定量PCR检测
试剂盒，PCR技术相对于传统的检测方式，有特异，敏感，时效短，准确度强等优势。
[0004] 随着PCR技术在上述相关领域的应用，也有其相应的局限性也逐渐凸显。如，在
基层医疗PCR检测方面，目前的PCR检测方式只能适用于大型医疗机构使用，原因在于荧光定量PCR仪造价昂贵，属于精密仪器，并且需要建立规范的PCR实验室，将取样、核酸提取、核酸扩增等区间严格分开，以避免
气溶胶的污染，不适用于基层或偏远地区的检测；另外，PCR检测技术在海关、农业、防疫等应用的过程中，很多情况下需要现场取样，现场处理并判读结果，当前的技术还不能满足这些要求，需要发明研发相应的便携式核酸检测装置以解决这些问题。
[0005] 由此可以看出，传统的PCR检测技术有严苛的环境要求，对仪器要求高，本发明涉及一种密闭环境下
采样、反应、检测管，通过
螺纹旋接的方法，减少了各反应过程之中的气溶胶污染；同时，在个反映管之中预装相应的反应液储存，搭配微型的温控仪和免疫层析
试纸，搭建用于PCR层析法的便携式核酸检测平台，十分适于野外现场检测和基层医疗机构的应用推广。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的一个技术问题是整合和改进现有的技术，提供一种适用于基层医疗机构和其他现场实时检测的基因检测平台。本发明要解决的另一个技术问题是解决在PCR反应过程中的气溶胶污染，以及杜绝野外环境下对PCR反应的不利影响。
[0007] 一种适用于PCR层析法的便携式核酸检测平台，包括反应耗材、预装反应液、便携式
温度循环仪等几个模
块。
[0008] 其中：所述的采样管具有可密闭的管盖，底部具有耐高温
薄膜材料，中间
位置设有只允许气体和液体
自上而下单方面通过的刚性瓣膜。瓣膜和耐高温薄膜材料之间形成的空间预装核酸微量释放剂。
[0009] 所述的反应管具有
内螺纹结构，中间部分具有能够刺破薄膜的棱锥结构，可以使液体在离心的情况下汇入下端预装了PCR扩增反应液的空间内。
[0010] 所述的检测卡，应该具有反应管类似的棱锥突起，可以刺破反应管底部的薄膜结构，汇聚PCR扩增产物至胶体金试纸的加样垫上，从而判读结果。
[0011] 作为优选方案，取样管的瓣膜使用高
密度聚丙烯薄膜，为三瓣结构，在
离心力的作用下，可以使瓣膜以上的液体穿过瓣膜，与下层预装的微量核酸释放剂混匀，取样管底端包裹的耐高温薄膜，一种优选方案为PP材料。在高温下不
变形，并且影响反应。
[0012] 作为优选方案，反应管使用PP材料制作，棱锥的尖
角为20-45o,棱锥地盘为楼空，可以使得裂解反应液向下流汇入预装的PCR扩增体系。底部包裹的耐高温薄膜为PP材质。
[0013] 作为优选方案，检测卡使用PE塑料制作，中央的棱锥与反应管类似。
[0014] 在使用过程中，去微量血液、体液、蚊虫
研磨液或菌液，加入到采样管的上腔，再加入适量的封闭剂进行封闭，封闭剂可以是液体
石蜡或矿物油，离心混合，将取样管旋入PCR仪的带内螺纹的加热模块中，运行裂解程序。作为一个优选方案，裂解程序为90℃10min-4℃5min。
[0015] 将采样管在PCR仪上选下，取相对应的反应管，旋入到反应管中。此时反应管的棱锥结构轻易刺破取样管底部的薄膜结构，裂解产物流下，与反应管中预装的PCR扩增试剂混合。由于使用了螺纹接合的方式，保证了空间的密闭性。
[0016] 将上述反应管旋入到PCR仪的带内螺纹的加热模块中，运行相应的PCR扩增程序。待反应结束后，将上述反应管取下，取相应的检测卡，将反应管竖立旋入到检测卡中，采样卡刺破反应管底部的薄膜，其中液体汇聚到检测卡加样孔，由于使用螺旋接合的方式，保证了气密性，液体沿着胶体金检测试纸层析，判读结果。
[0017] 和
现有技术相比，本发明具有以下优点：1，使用螺纹结构接合，在整个裂解、扩增以及检测过程中，保证气密性，可以解决PCR反应过程中的气溶胶污染的情况。2，取样管和反应管中预装相应的试剂，可以解决在野外实时检测中取样加样等过程的污染。3，本发明介绍的一种一种便携式
温度控制循环仪结构简单，只包含加热模块和制冷模块，耗能低，体积小。由于使用了圆形的代内螺纹的结构，使加热的面积扩大，增大了热传递的效率。通过设置相应的反应程序，可以适用于DNA或RNA的全部PCR程序，也可以运行恒温扩增PCR（LAMP）程序。简单的结构使得其兼容性强。4，检测卡可以设计为联卡或单卡，通过胶体金免疫层析技术，是反应直观可读，提高检测效率，及适用于卫生监察、户
外科学考察、基层医疗机构诊断、海关快速检疫等相关领域的推广。
[0019] 图1 采样管、反应管和检测卡的接合方式。
[0020] 图2 采样管立体图及剖面结构。
[0021] 图3 反应管立体图及剖面结构。
[0022] 图4 棱锥结构示意图。
[0023] 图5 检测卡结构示意图。
[0024] 图6 一种便携式温度控制循环仪的
概念图。
具体实施方式
[0025] 一下接合附图和具体
实施例对本发明进一步介绍。
[0026] 实施例1。
[0027] 使用本发明介绍的平台检测猪携带流行性乙型脑炎病毒携带率，养殖场现场检测。其步骤如下。
[0028] 1）用一次性
注射器取猪
耳静脉血5ul，加入到取样管中，加入30-50ul的灭菌液体石蜡，瞬时离心，使血液经过瓣膜，与预装的RNA核酸微量释放剂混合。
[0029] 所述的RNA微量核酸释放机的组成为：500mM的 KCl、 20% Triton X-100、100mg/ ml的蛋白酶K、120mM 的 NaOH、pH值6的 DMS0、终浓度 10%的BSA。将上述取样管旋入到PCR仪中，运行裂解程序：90℃10min-4℃5min。
[0030] 2）裂解程序完成后，将取样管竖直旋入到反应管中，反应管预装的PCR扩增试剂组成为：无RNA酶水 23.8ul， 5×buffer 10ul ，DNTP Mix 2.0ul，Enzyme Mix 2.0ul，JEV-F1（10mM） 0.6ul，JEV-R1（10mM） 0.6ul，RNA酶
抑制剂 1ul。
[0031] 根据流行性乙型脑炎特异性设计引物，并在引物上标记可以被蛋白
抗体特异性识别的分子，举例设计的引物如下：JEV-F1:DIG-CTCGTGCTTTCGCCTCGAAACTCTA;
JEV-R1:CTCGTGCTTTCGCCTCGAAACTCTA-Biotin。
[0032] 3）将上述反应管旋入PCR仪中，运行PCR扩增反应，程序如下：第一阶段：95℃，1min酶激活；第二阶段：50℃，30min逆转录；第三阶段：95℃，5min预变性；第四阶段：[95℃，15sec；60℃，45sec] 45个循环；第五阶段：25℃，10sec仪器冷却。
[0033] 4）待扩增反应结束后，将反应管旋下，去对应的检测卡，垂直旋入，待层析结束后判读结果。
[0034] 使用的免疫层析试纸制备如下：胶体金颗粒标记鼠IgG和地高辛抗体；检测线标记生物素抗体，控制线标记羊抗鼠抗体。
[0035] 结果分析，若
血液样本中含有流行性乙型脑炎病毒，则检测卡T线显色，若不携带流行性乙脑病毒，试纸T线不显色。
[0036] 实施例2使用本发明介绍的平台检测食品生产设备表面志贺氏菌。
[0037] 根据本发明的特点，其步骤可以分为以下几步。
[0038] 1）采样：使用一次性灭菌的
棉签，沾取无菌水，在规定区域进行涂抹取样，后将棉签上的水滴入取样管中，约5-10ul。加入30-50ul无菌液体石蜡进行封闭。
[0039] 2）裂解：瞬时离心，使血液经过瓣膜，与预装的RNA核酸微量释放剂混合。
[0040] 所述的DNA微量核酸释放机的组成为：50mM的 KCl、 25% Triton X-100、10mg/ ml的蛋白酶K、120mM 的 NaOH、pH值8的 DMS0、终浓度 15%的BSA。将上述取样管旋入到PCR仪中，运行裂解程序：90℃10min-4℃5min。
[0041] 3）裂解程序完成后，将取样管竖直旋入到反应管中，反应管预装的PCR扩增试剂组成为：纯化水 24.8ul， 5×buffer 10ul ，DNTP Mix 2.0ul，Enzyme Mix 2.0ul，SC-F1（10mM） 0.6ul，SC-R1（10mM） 0.6ul。
[0042] 根据志贺氏菌不同亚型基因的保守型，设计通用性引物，并使用分子标记，引举例为：Shi-F1:DIG-ATTACGGTAATCCGAATTAACCGA;
Shi-R1:ATTGTTGCCATTACGTCGAGGTCA-Biotin。
[0043] 4) 将上述反应管旋入PCR仪中，运行PCR扩增反应，程序如下：。
[0044] 5) 待扩增反应结束后，将反应管旋下，去对应的检测卡，垂直旋入，待层析结束后判读结果。
[0045] 使用的免疫层析试纸制备如下：胶体金颗粒标记鼠IgG和地高辛抗体；检测线标记生物素抗体，控制线标记羊抗鼠抗体。
[0046] 结果分析，若样本中含志贺氏菌，则检测卡T线显色，若无志贺氏菌感染，试纸T线不显色。
[0047] 本文应用了具体个例对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上实施例说明只用于帮助理解本发明的核心思想和方法，帮助本领域的技术人员了解实施。此外，本领域技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
