技术领域
[0001] 本
发明属于
疾病生物标志物筛选技术领域，尤其涉及一种筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法。
背景技术
[0002] 阿尔茨海默病(AD)，最常见的痴呆类型，是一种神经退行性疾病，其病因和发病机制不确定，主要影响老年人。随着全世界人口老龄化，AD的患病率迅速增加，对所有国家来说都将是一个沉重的经济负担。肠道
微生物群(Gut microbiota，GM)通过肠道微生物群-脑轴调节神经胶质细胞的活化，参与神经元的突触传递和大脑中脂质的代谢。肠道微生物群异常代谢产生的代谢产物可引起大脑
炎症和免疫反应，病理改变可引起临床表现，如精神和行为异常。研究表明GM在AD的发病机制中起着潜在的作用，与健康对照组相比，AD患者的
粪便中富含蛋白细菌丰富，而firmicute
门的比例显着降低，中枢神经系统免疫和神经内分泌发生变化。此外，Harach等人的另一项研究发现，老年AD小鼠的GM移植到无菌幼鼠体内，发现脑内Aβ斑
块显着增加。然而，GM对AD的机制尚不清楚。细菌分泌的外膜囊泡(OMVs)，直径20～250nm，携带细菌脂多糖，蛋白酶，膜受体，DNA，RNA等。Koeppen K等报告称，OMV在通信和监管中起着至关重要的作用。然而，来自AD的GM的OMVs中的
代谢物生效是一个关键问题。但目前还没有关于GM中AD和OMVs的研究。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于：针对
现有技术的不足，而提供一种筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法，通过提取并纯化粪菌外膜囊泡并对其进行多重分析，筛选出阿尔茨海默病患者和健康对照者的粪菌外膜囊泡的差异代谢产物，并将其作为用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物，对阿尔茨海默病的诊断具有重要意义。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0005] 一种筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法，包括以下步骤：
[0006] S1，分别从阿尔茨海默病患者和健康对照者获取粪便；
[0007] S2，分别提取步骤S1获取的粪便的粪菌外膜囊泡，并进行纯化；
[0008] S3，使用气相色谱-质谱联用仪分别对步骤S2纯化后的粪菌外膜囊泡的代谢产物进行GC-MS分析；
[0009] S4，对步骤S3获得的GC-MS数据进行分析，识别出差异代谢产物，即为用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物。
[0010] 作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，步骤S2的具体操作为：
[0011] 1)分别将粪便与甘油以9：1的体积混合后储存在-80℃
冰箱中；
[0012] 2)每个样品取30～40g的粪便分别溶解在冰上，并将解冻的粪便加入到4ml的0.9％生理盐
水中，得到粪便混合物；
[0013] 3)将粪便混合物充分搅拌直至均质化，然后过滤2～3次以除去大颗粒，并将滤液分别置于50ml离心管中进行差速离心，以除去肠道菌群中的粪便物质杂质和小
片段，最后将最终得到的上清液分别通过孔径为0.45μm和0.22μm的
过滤器过滤，得到滤液。
[0014] 作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，所述差速离心的具体操作为：先以400×g的转速离心10分钟，重复2次；再以1000×g的转速离心15分钟，重复5次；然后以3000×g的转速离心30分钟；最后以5000×g的转速离心1小时，重复2次；以上所有操作均在4℃下进行，每次离心后仅取上清液进行下一次离心。
[0015] 作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，在步骤S3中，所述GC-MS分析的具体操作参数为：将5％二苯基DB-5MS毛细管柱与95％二甲基聚
硅氧烷交联，以不分流模式注射1μL等分试样的分析物；使用氦气作为载气，前入口吹扫流量为3mL/min，通过柱子的气体流量为1mL/min；初始
温度保持在50℃1分钟，以20℃/min的速率升温至310℃，然后注入温度，传输线温度和离子源温度分别为280℃，280℃和250℃；
电子轰击模式中的
能量为-70eV，在
溶剂延迟4.78分钟后，以全扫描模式以12.5每秒的
光谱速率获得质谱数据。
[0016] 作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，在步骤S4中，所述分析包括数据
质量控制，基于峰面积值计算QC样本之间的Pearson相关系数，获得可重复和准确的代谢组结果。
[0017] 作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，在步骤S4中，所述分析还包括将获得的GC-MS数据标准化并输出到Chroma TOF4.3X
软件和LECO-Fiehn Rtx5
数据库中进行分析，鉴定代谢产物。
[0018] 作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，在步骤S4中，所述分析还包括进行主成分分析和偏最小二乘判别分析，以评估所获得的代谢产物的数据分布，揭示阿尔茨海默病患者和健康对照者的粪菌外膜囊泡的代谢产物的差异。
[0019] 作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，还包括S5，对差异代谢产物进行KEGG富集分析，确定参与差异代谢物的最重要的生物化学代谢途径和
信号转导途径。
[0020] 作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，还包括S6，通过接受者操作特征曲线说明差异代谢产物的
预后性能，确定
鉴别能
力及曲线下面积。
[0021] 本发明的有益效果在于：本发明通过收集阿尔茨海默病患者和健康对照者的粪便，提取和纯化粪菌外膜囊泡，然后使用气相色谱-质谱(GC-MS)检测粪菌外膜囊泡中代谢产物的变化，揭示阿尔茨海默病患者和健康对照者的粪菌外膜囊泡的代谢产品存在显着差异，确定了一系列差异代谢物和几种最常见的代谢途径，这些差异代谢产物可作为新的生物标志物，用于识别诊断阿尔茨海默病。
具体实施方式
[0022] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不限于此。
[0024] 研究对象
[0025] 从阿尔茨海默病患者(n＝9)和健康对照者(n＝9)获得粪便，均来自广东医科大学附属医院(中国湛江)。根据阿尔茨海默病诊断标准，所有患者均接受国家神经和交流障碍和中
风研究所以及阿尔茨海默病和相关疾病协会的标准化诊断测试，详细记录病史，体检，相应的考试和功能评估。具有相关脑
血管疾病或脑外伤，无意识受试者的受试者被排除在研究之外。所有人在收集任何数据之前都获得了知情同意该研究得到了广东医科大学附属医院伦理委员会(中国湛江)的批准。
[0026] 粪菌外膜囊泡的提取和纯化
[0027] 将粪便与甘油以9：1的体积混合后储存在-80℃冰箱中，取每个样品30～40g的粪便溶解在冰上，并将解冻的粪便加入到4ml的0.9％生理盐水中；将粪便混合物置于搅拌器中并充分搅拌直至均质化，然后将匀浆物通过过滤器过滤2-3次以除去大颗粒，然后将滤液分别置于50ml离心管中进行差速离心，以除去肠道菌群中的粪便物质杂质和小片段；最后将最终得到的上清液分别通过孔径为0.45μm和0.22μm的过滤器过滤，得到滤液。其中，差速离心整个过程如下：先以400×g的转速离心10分钟，重复2次；再以1000×g的转速离心15分钟，重复5次；然后以3000×g的转速离心30分钟；最后以5000×g的转速离心1小时，重复2次；以上所有操作均在4℃下进行，每次离心后仅取上清液进行下一次离心。
[0028] GC-MS分析
[0029] 使用气相色谱系统(Agilent 7890-Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)结合飞行时间质谱(Pegasus HT-LECO，St Joseph，MI，USA)进行GC-MS分析。具体操作参数为：将％二苯基DB-5MS毛细管柱(J&W Scientific，Folsom，CA，USA)与95％二甲基聚硅氧烷交联，以不分流模式注射1μL等分试样的分析物；使用氦气作为载气，前入口吹扫流量为3mL/min，通过柱子的气体流量为1mL/min。初始温度保持在50℃1分钟，以20℃/min的速率升温至310℃，然后注入温度，传输线温度和离子源温度分别为280℃，280℃和250℃；电子轰击模式中的能量为-70eV；在溶剂延迟4.78分钟后，以全扫描模式以12.5每秒的光谱速率获得质谱数据。
[0030] 数据分析
[0031] 将原始文件(.raw)导入Compound Discoverer 3.0(OPTON-30863，Thermo Scientific，USA)软件进行光谱处理和数据库搜索，从而获得定性和定量代谢物结果。Chroma TOF 4.3X软件(版本4.5，LECO，USA)和LECO-Fiehn Rtx5数据库用于原始峰提取，基线过滤和校准，峰校准，反卷积分析，峰识别和峰面积积分。质量控制(quality control,QC)是获得可重复和准确的代谢组结果的必要步骤，用于及时发现异常并尽早解决问题，以确保收集的最终数据的质量。使用SIMCA包(V14，Umetrics AB，Umea，Sweden)，进行主成分分析(Principal component analysis，PCA)和偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA))以评估所获得的代谢组学谱的数据分布和辨别能力，揭示差异在阿尔茨海默病的粪菌外膜囊泡和健康对照者的粪菌外膜囊泡中的代谢物。
[0032] 接受者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线说明了差异代谢物的预后性能，并进一步确定了鉴别能力以及曲线下面积(Area under the curve，AUC)。粪菌外膜囊泡的差异代谢物由京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG,www.kegg.jp/kegg/kegg1.html)进一步验证，它是体内代谢分析和代谢网络研究的有力工具。使用超几何测试在KEGG途径中计算富集结果，以找到与所有鉴定的代谢物背景相比富含差异代谢物的途径。最终确定了参与差异代谢物的最重要的生物化学代谢途径和信号转导途径。
[0033] 分析结果
[0034] GC-MS数据的质量控制
[0035] QC反映了仪器的
稳定性和代谢物检测过程中的信号响应强度。基于峰面积值，计算QC样本之间的Pearson相关系数。其中，R2(0.993,0.995,0.986,0.992)接近1，QC样品在总样品中表现出高度的相关性，表明系统运行稳定并准确获取数据。
[0036] 为了有效评估血清样品中的代谢变异性，将获得的GC-MS数据标准化并输出到Chroma TOF4.3X软件和LECO-Fiehn Rtx5数据库中进行分析。在该研究中，通过四分位数范围，在粪菌外膜囊泡样品中成功鉴定了总共407个峰和331个代谢物。
[0037] PCA主要用于观察两组之间的整体分布趋势，这降低了数据的维数，并总结了相似之处和不同之处。显示阿尔茨海默病患者的粪菌外膜囊泡组和健康对照者的粪菌外膜囊泡组的样品点完全分离，每组中的样品点聚集在一起。两组之间明显的分歧表明，阿尔茨海默病患者和健康对照者在整体上具有代谢特征，并且代谢改变发生在特定途径中。
[0038] 为了获得改进的分离并更好地理解负责分类的变量，应用了监督聚类PLS-DA模型分析。该模型的R2Y值为0.95(即，模型解释了数据中观察到的99％的变化)和Q2Y值为0.87，表明该模型具有非常好的预测能力。PLS-DA分析的得分图显示阿尔茨海默病患者的粪菌外膜囊泡和健康对照者的粪菌外膜囊泡之间的明显分离。
[0039] 总之，这些结果表明阿尔茨海默病患者的粪菌外膜囊泡中代谢组分水平发生了显着变化，采用了一系列多变量统计方法。
[0040] 阿尔茨海默病患者粪菌外膜囊泡中的差异代谢物
[0041] 通过测量归一化后的峰面积来量化代谢物的丰度。发现与健康对照者的粪菌外膜囊泡相比，阿尔茨海默病患者的粪菌外膜囊泡中有90种不同丰度的代谢物。通过根据它们在模型中的显着性对VIP值进行排序，确定在阿尔茨海默病患者的粪菌外膜囊泡中18种特定代谢物显着改变。在天冬
氨酸，L-谷氨酸，吲哚-3-乙酸，L-天冬氨酸，4-甲基伞形
酮，咪唑-4-乙酸酯，前列腺素G2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)中，阿尔茨海默病患者的粪菌外膜囊泡的代谢物的水平显着增加。相反，阿尔茨海默病患者中4-半
醛，富
马酸，杆菌素，黄嘌呤，N2-琥珀酰-L-谷氨酸5-半醛，十三烷酸，L-吡喃
葡萄糖和胆
碱的水平显着降低。
[0042] 差异代谢物表现出良好的ROC曲线和极高的AUC值。七种代谢物，包括4-半醛(AUC＝0.951)，PGE2(AUG＝0.938)，20-羟基-二十
碳四烯酸(AUG＝0.938)，杆菌素(AUG＝0.938)，L-吡喃葡萄糖(AUG＝0.926)，吲哚-3-乙酸(AUG＝0.914)，4-甲基伞形酮(AUG＝
0.901)具有前7个AUC值(均超过0.90)，表明优异的灵敏度。咪唑-4-乙酸酯(AUG＝0.889)，L-天冬氨酸(AUG＝0.877)，富马酸(AUG＝0.864)，十三烷酸(AUG＝0.0.852)和胆碱(AUG＝
0.0.815)具有相对高的AUC值。这些结果表明，粪菌外膜囊泡的差异代谢物可能是阿尔茨海默病的有效临床指标。
[0043] 代谢途径和功能分析
[0044] 为了更好地了解潜在的代谢紊乱，通过搜索KEGG数据库将AD-OMVs的代谢物
定位到代谢网络中，并发现最重要的生化代谢途径和信号转导途径涉及差异代谢物，包括组氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，胆碱能突触代谢，
色氨酸代谢，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成。
[0045] 在花生四烯酸(AA)代谢途径中，PGE2，白三烯B4水平在AD-OMVS中显着上调。值得注意的是，L-天冬氨酸咪唑-4-乙酸酯具有最高的VIP值并且支持AD中组氨酸代谢的重要作用。
[0046] 根据上述
说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和
修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的
基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
