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质谱检测乳制品中A1、A2型β酪蛋白的质谱模型及其构建方法

阅读：296发布：2020-05-11

专利汇可以提供质谱检测乳制品中A1、A2型β酪蛋白的质谱模型及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开一种检测乳品中A1、A2型β 酪蛋白的质谱模型，该质谱模型包括A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的标准特征多肽组，其中所述乳制品包括牛乳、羊乳，所述A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的标准特征多肽序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2所示。本发明还公开了该质谱模型的构建方法。利用本发明的方法能够准确地检测出乳品中是否含有A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，并能对其二者含量进行相对定量。，下面是质谱检测乳制品中A1、A2型β酪蛋白的质谱模型及其构建方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于质谱检测乳制品中A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的质谱模型，该质谱模型包括A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的标准特征多肽组，其中所述乳制品包括牛乳、羊乳，所述A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的标准特征多肽序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的质谱模型，其中所述A1β-酪蛋白的特征多肽质谱峰值为单电荷
5360m/z(5‰)或双电荷2680m/z(5‰)，当出现该单电荷或双电荷的质谱多肽峰值时，表示待检样品为A1型乳，或A1/A2杂合型乳。
3.权利要求1或2所述的质谱模型，其中所述A2β-酪蛋白的特征多肽峰质谱峰值为单电荷5320m/z(5‰)或双电荷2660m/z(5‰)，当出现该单电荷或双电荷的质谱多肽峰值时，表示待检样品为A2型乳，或A1/A2杂合型乳。
4.制备权利要求1-3任一所述的质谱模型的构建方法，包括：
1)收集多例普通纯牛奶(含A1型或A1/A2杂合型)和A2型牛奶作为两组标本备用；
2)对牛奶蛋白进行质谱前预处理；
3)对预处理过的两组牛奶蛋白进行质谱检测读取，获得两组牛奶多肽的指纹图谱；
4)对所有的普通纯牛奶(含A1型或A1/A2杂合型)和A2型牛奶的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；
5)对所得数据进行质控处理，筛选出具有下列质荷比峰的两个特征多肽：单电荷
5360m/z(5‰)或双电荷2680m/z(5‰)、单电荷5320m/z(5‰)或双电荷2660m/z(5‰)，对所述特征多肽进行测序并确定其序列为SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2所示，并根据这两个质荷比峰建立检测乳品定性及半定量的质谱模型。
5.权利要求1的构建方法，其中步骤2)预处理的方法包括使用胰蛋白酶酶解，得到乳品中的特异多肽片段。
6.权利要求1的构建方法，其中所述步骤3)采用试剂盒对两组乳品样本进行还原、烷基化及酶解处理，并对乳品酶解后的多肽片段进行读取，获得两组乳品多肽的指纹图谱。
7.权利要求1的构建方法，其中所述步骤5)所述的质控处理，保留信噪比大于3的质谱图谱数据，并采用组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选，所述变异系数为15％。

说明书全文

质谱检测乳制品中A1、A2型β酪蛋白的质谱模型及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物光电检测技术领域，具体涉及质谱检测乳制品中A1、A2型β酪蛋白的质谱模型及其构建方法。技术背景

[0002] 酪蛋白是乳品中含量最高的蛋白质，占牛乳蛋白含量的80％左右。根据氨基酸组成和电泳行为的不同，酪蛋白可分为αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占牛乳酪蛋白总量的30-35％。β-酪蛋白又存在多种变体，最常见的是A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，两者的区别在于氨基酸链的第67位存在变异，前者为组氨酸，后者为脯氨酸。既含有A1β-酪蛋白又含有A2β-酪蛋白的乳品为A1/A2型奶，只含有A2β-酪蛋白的乳品为A2型奶，只含有A1β-酪蛋白的乳品为A1型奶。

[0003] 现已发现，BCM-7能穿过胃肠壁进入血液循环，并通过阿片受体影响全身和细胞活动。此外，BCM-7和其他β-酪蛋白衍生物为阿片受体的强效外源性激动剂—外啡肽，其中与μ受体的亲合力最大。因此，BCM-7可能影响多个器官/系统的活动，尤其消化系统和免疫细胞。此外，BCM-7也可能与婴幼儿的各种疾病有关，如Ⅰ型糖尿病和呼吸功能障碍，消化功能疾病，促使产生肛瘘，免疫功能疾病，并影响中枢神经系统活动。因此含有A2β-酪蛋白的乳制品更加健康安全，在国内外市场上也更受欢迎。

[0004] 另外，乳业是一个国家发达程度和食品消费现代化水平的重要标志，其发展对优化农业结构，促进畜牧业产业升级，增加农民收入，提高国民身体素质，都具有重要意义。当前我国的乳业正处于从传统乳业向现代乳业转型的关键时期，未来乳业的发展将从注重数量型向质量型升级。由于并不是所有的奶牛都能产出只含纯净A2型β-酪蛋白而不含A1型β-酪蛋白的牛奶，因此A2型β-酪蛋白的奶源非常稀有。现今，西方的奶牛中只有约30％的奶牛为纯正的A2奶牛，由其所产的牛奶只含100％纯净A2型β-酪蛋白。如果我国能掌握A2β-酪蛋白的奶制品的鉴定技术，根据我国庞大的奶牛牲畜资源，从中筛选出纯产A2型奶的奶牛，从而发展中国特色的A2奶制品加工产业，对于提升中国的乳业行业发展水平具有不可估量的作用。

[0005] 中国发明专利申请号201610784180.6、发明名称为“检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法”。该方法包括：(1)将待测样品依次进行加热、离心、冷冻及解冻，以便得到待测储备液；(2)将所述待测储备液进行预处理，以便得到待测液，其中，所述预处理包括将所述待测储备液与预处理液进行混合；以及(3)利用毛细管电泳法对所述待测液进行检测，以便确定牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。然而，该方法所用的毛细管电泳法存在检测时间长、检测样本数量低、检测成本高、检测结果灵敏度不高等缺点，不能适应现代化奶业的发展需要。

[0006] 中国发明专利申请号201810487863.7、发明名称为“一种用于检测牛乳品中A2β-酪蛋白含量的特征肽及方法”公开了一种检测牛乳品中A2β酪蛋白含量的方法。该方法包括：(1)将待测样品用水稀释，依次进行变性处理、胰蛋白酶酶解处理、二甲基化处理后，得到二甲基化的内标肽溶液；(2)将特征内标肽经相同处理，得到二甲基化的内标肽溶液；(3)将内标肽溶液与样品溶液混合，采用高效液相色谱-质谱联用技术对所述待测样品进行检测；(4)，计算待测样品中A2β-酪蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积比，得到样品中A2β-酪蛋白的含量。然而，该方法所用的液相质谱法需要针对A2β酪蛋白的特定氨基酸片段设计处理过程，同时需要引入特定序列的内标肽，因此存在检测时间长、检测样本数量低、检测成本高等缺点，不能适应现代化奶业的发展需要。

[0007] 中国发明专利申请号201810316627.6、发明名称为“一种A1/A2β-酪蛋白的质谱检测方法”公开了一种A1/A2β-酪蛋白的质谱检测方法，包括如下步骤：a)获取A2β-酪蛋白的氨基酸序列；b)将A2β-酪蛋白的67位氨基酸脯氨酸修改为组氨酸，获得A1β-酪蛋白的氨基酸序列；c)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与前面的氨基酸序列进行比对，定性判断是否存在A1或A2β-酪蛋白的特征肽段；d)挑选定性为A1或A2β-酪蛋白的特征肽段，合成其同位素内标肽段，利用串联四级杆质谱建立多反应监测方法进行定量分析。然而，该方法需要预习处理特定氨基酸序列，并且反复优化HPLC参数和ESI-QqQ条件，检测过程繁琐复杂，也不能适应现代化奶业的发展需要。

[0008] 综上，关于A1β-酪蛋白及A2β酪蛋白的检测方法普遍存在操作繁琐，通量低的缺陷。因此，有必要建立一种检测成本低、检测通量高、检测速度快的新方法。

发明内容

[0009] 本发明第一个发明原理在于通过大数据分析，筛选出可以表征乳制品中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的标准特征多肽质谱峰，通过将待测样品的质谱峰与标准的特征多肽质谱峰进行比较，从而确定乳制品中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。

[0010] 本发明第二个发明原理在于通过质谱结果，首次证明可以检测出乳制品的A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的相对比例。

[0011] 本发明第三个发明原理是基于上述原理的情况下，通过检测乳制品的标准特征多肽，从而完成对A2型产奶牲畜的鉴定、育种以及生产A2奶的方法。

[0012] 因此，本发明第一个目的是提供一种用于同时检测乳制品中A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的标准特征多肽组，其中所述乳制品包括牛乳、羊乳，所述A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的标准特征多肽序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2所示：

[0013] SEQ ID No.1：

[0014] IHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK；

[0015] SEQ ID No.2：

[0016] IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK；

[0017] 在一个实施方案中，所述A1β-酪蛋白的特征多肽质谱峰值为单电荷5360m/z(5‰，表示质荷比偏差允许范围±5‰，下同)或双电荷2680m/z(5‰)，当出现该单电荷或双电荷的质谱多肽峰值时，表示待检样品为A1型乳，或A1/A2杂合型乳。

[0018] 在另一个实施方案中，所述A2β-酪蛋白的特征多肽峰质谱峰值为单电荷5320m/z(5‰)或双电荷2660m/z(5‰)，当出现该单电荷或双电荷的质谱多肽峰值时，表示待检样品为A2型乳，或A1/A2杂合型乳。

[0019] 在上述实施方案中，由于所述特征多肽具有单电荷和双电荷的两种带电形式，因此双电荷多肽在质谱谱图中的位置与同质量单位的单电荷多肽相差一半，即二者质荷比相差一半。

[0020] 本发明的第二个发明目的是提供一种用于同时检测乳制品中A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的质谱模型，该质谱模型包括A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的标准特征多肽组，其中所述乳制品包括牛乳、羊乳，所述A1β-酪蛋白、A2β酪蛋白的标准特征多肽序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2所示。

[0021] 在一个实施方案中，所述A1β-酪蛋白的特征多肽质谱峰值为单电荷5360m/z(5‰)或双电荷2680m/z(5‰)，当出现该单电荷或双电荷的质谱多肽峰值时，表示待检样品为A1型乳，或A1/A2杂合型乳。

[0022] 在另一个实施方案中，所述A2β-酪蛋白的特征多肽峰质谱峰值为单电荷5320m/z(5‰)或双电荷2660m/z(5‰)，当出现该单电荷或双电荷的质谱多肽峰值时，表示待检样品为A2型乳，或A1/A2杂合型乳。

[0023] 本发明第三个目的是提供制备所述的质谱模型的构建方法，包括：

[0024] 1)收集多例普通纯牛奶(含A1型或A1/A2杂合型)和A2型牛奶作为两组标本备用；

[0025] 2)对牛奶蛋白进行质谱前预处理；

[0026] 3)对预处理过的两组牛奶蛋白进行质谱检测读取，获得两组牛奶多肽的指纹图谱；

[0027] 4)对所有的普通纯牛奶(含A1型或A1/A2杂合型)和A2型牛奶的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

[0028] 5)对所得数据进行质控处理，筛选出具有下列质荷比峰的两个特征多肽：单电荷5360m/z(5‰)或双电荷2680m/z(5‰)、单电荷5320m/z(5‰)或双电荷2660m/z(5‰)，对所述特征多肽进行序列测定，并根据这两个质荷比峰建立检测乳品定性及半定量的质谱模型。

[0029] 在一个实施方案中，其中步骤2)预处理的方法包括使用胰蛋白酶酶解，得到乳品中的特异多肽片段。

[0030] 在一个实施方案中，其中所述步骤3)采用试剂盒对两组乳品样本进行还原、烷基化及酶解处理，并对乳品酶解后的多肽片段进行读取，获得两组乳品多肽的指纹图谱。

[0031] 在一个实施方案中，其中所述步骤5)所述的质控处理，保留信噪比大于3的质谱图谱数据，并采用组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选，所述变异系数为15％。

[0032] 本发明的第四个发明目的是提供一种用于检测乳制品中A1β-酪蛋白及A2β酪蛋白的的检测产品，其包含上述的特征多肽组，或包含上述的质谱模型，所述乳制品包括牛乳、羊乳。

[0033] 在一个实施方案中，该检测产品包括检测试剂盒、芯片、检测试剂等。在一个优选实施方案中，该试剂盒由还原剂、烷基化试剂、胰蛋白酶、反应终止试剂、反应缓冲液和质谱基质组成，其中各组分可以使用市售试剂盒或相关试剂。

[0034] 在另一实施方案中，该试剂盒还包括含有上述特征多肽的标准质谱样品管，该样品管既可以是含有单一特征多肽的样品管，也可以是含有2种特征多肽的一种样品管，所述标准样品管中的样品用于与待测样品进行质谱时进行平行质谱测试，以判断待测样品中是否含有所述特征多肽。

[0035] 在另一个实施方案中，该试剂盒可含有上述特征多肽的标准数据库(即A1/A2β酪蛋白的特征多肽数据库)的软件或芯片，可用于待测样品进行质谱时提供标准数据或曲线的比对，以判断待测样品中是否含有所述A1/A2β酪蛋白的特征多肽。

[0036] 本发明涉及的试剂盒，包括乳品前处理试剂、质谱基质和飞行时间质谱A2β-酪蛋白检测软件。

[0037] 试剂盒中的乳品前处理试剂包含如下组分：碳酸氢钠缓冲溶液，其主要组成成分为碳酸钠和碳酸氢钠；还原剂，其主要组成成分为二硫苏糖醇；烷基化试剂，其主要组成成分为碘代乙酰胺；酶，其主要组成成分为胰蛋白酶；终止试剂，其主要组成成分为甲酸。

[0038] 试剂盒中的质谱基质包含如下组分：基质粉末，其主要组成成分为芥子酸；基质溶液，其主要组成成分为乙腈、三氟乙酸和水。

[0039] 上述试剂盒可以在A1β-酪蛋白和A2β酪蛋白定性及相对定量检测中应用。

[0040] 本发明第五个发明目的是提供了一种MALDI-TOF-MS用检测A1β-酪蛋白及A2β酪蛋白的方法：

[0041] (1)待检测的样品在缓冲液中依次经还原反应、烷基化反应、胰蛋白酶酶解处理后终止反应，得到乳品前处理液；

[0042] (2)将乳品处理液与质谱基质涂加在质谱专用靶板上；

[0043] (3)采用MALDI-TOF-MS对所述样品进行检测；

[0044] (4)根据检测结果，利用飞行时间质谱A2β-酪蛋白检测软件计算A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的相对含量。

[0045] 在一个实施方案中，所述步骤(1)的还原反应是在碳酸氢钠缓冲体系中加入还原剂，使其终浓度不低于0.1mol/L，50-70℃恒温反应10～60min，该步骤可水解二硫键破坏蛋白的空间结构，其中还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。

[0046] 在另一个实施方案中，所述步骤(1)的烷基化反应是在上述产物中加入烷基化试剂，使其终浓度不低于0.1mol/L，20～30℃避光恒温反应10～60min，该步骤可使蛋白完全变性，其中烷基化试剂为碘代乙酰胺(IAA)。

[0047] 在另一个实施方案中，所述步骤(1)的胰蛋白酶酶解处理是在上述产物中加入胰蛋白酶溶液，使其终浓度不低于0.1g/L，并在37℃恒温反应至少30min，该步骤应用胰蛋白酶只作用于精氨酸(R)和赖氨酸(K)的专一性的特点，把β-酪蛋白酶切成分子量小于10000Da的小分子肽段，完全酶解后加入终止试剂甲酸溶液使胰蛋白酶变性，反应终止。

[0048] 在一个实施方案中，步骤(2)中，使用SA基质，其成分为每毫升基质溶液含芥子酸25mg，乙腈500μl，三氟乙酸1μl，纯水500μl。

[0049] 在一个实施方案中，步骤(3)中，MALDI-TOF-MS的检测条件为：调制方式：线性；数据收集范围：m/z1000～20000；谱图采集数量：每个样品点收集50张谱图，每张谱图用激光轰击10次；激光频率：30Hz；最佳脉冲提取：5340Da。

[0050] 在一个实施方案中，步骤(4)中，所述软件的功能包括：去背景、降噪、出峰位置校正、出峰强度规划及A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的相对含量计算。

[0051] 在上述任一实施方案中，所述样品为生鲜牛乳及其它动物乳液或乳制品(如羊乳)。在优选的实施方案中，所述乳制品为婴幼儿配方粉、脱脂乳粉、全脂乳粉、高温杀菌奶、巴氏杀菌奶、发酵型酸奶等动物乳制品。

[0052] 本发明第六个目的是提供了一种鉴定和育种A2型产奶牲畜的方法，步骤包括：

[0053] (1)根据前述质谱特征多肽组、质谱模型或检测产品或鉴定方法，确定产奶牲畜的β-酪蛋白A2/A1基因分型；

[0054] (2)选择只具有编码β-酪蛋白A2的基因的产奶牲畜；

[0055] (3)对选择的产奶牲畜进行繁育直至生产或/及形成所需要的生产种群。

[0056] 在一个实施方案中，步骤(1)是针对牛乳样品进行质谱检测。

[0057] 在上述所有实施方案中，所述产奶牲畜为中国荷斯坦奶牛、牦牛、绵羊、山羊。

[0058] 本发明第七个目的是提供了一种生产β-酪蛋白A2乳制品的方法，步骤包括：

[0059] (1)根据前述质谱特征多肽组、质谱模型或检测产品或鉴定方法，确定产奶牲畜的β-酪蛋白A2/A1基因分型；

[0060] (2)选择只具有编码β-酪蛋白A2的基因的产奶牲畜；

[0061] (3)对选择的产奶牲畜进行繁育直至生产或/及形成所需要的生产种群；

[0062] (4)对筛选的产奶牲畜进行挤奶。

[0063] 在一个实施方案中，步骤(1)是针对乳样品进行质谱检测。

[0064] 在另一实施方案中，包括步骤(4)的对奶进行加工制成奶制品。

[0065] 在上述所有实施方案中，所述产奶牲畜为中国荷斯坦奶牛、牦牛、绵羊、山羊。

[0066] 技术效果

[0067] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0068] 1、本发明采用MALDI-TOF-MS方法，首次提出通过识别β-酪蛋白的特征质谱峰实现了乳品中A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的相对定量。

[0069] 2、通过本发明的方法，不但可以准确地鉴定出市售乳品是否为A2奶，而且可以同时检测A1、A2两种待测样本，解决现有检测技术中只能单次检测A1奶或A2奶的技术缺陷。

[0070] 3、通过本发明的相对定量检测方法，还能迅速得知乳品中A1蛋白的残留程度，从而为A2奶的产品质量控制提供准确科学的量化监控手段。

[0071] 4、本发明可检测A2型的牛奶、羊奶，因此能完成对产A2型奶牛、山羊、绵羊的鉴定和育种。

[0072] 5、该方法无需额外添加内标，具有操作简单、快速，成本低、高通量等优势。附图说明

[0073] 图1为实施例1中同一样本多次重复实验对比谱图；其中m/z5360附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z5320附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。

[0074] 图2为实施例2中不同比例样本混合后的对比谱图；其中m/z5360附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z5320附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。随着A2蛋白含量的增加，A2峰/A1峰的相对峰强度(或峰面积)逐渐增加，其比例存在相关性。

[0075] 图3为实施例3中普通纯牛奶(A1/A2型)的MALDI-TOF-MS谱图。

[0076] 图4为实施例3中普通纯牛奶(A1/A2型)的MALDI-TOF-MS谱图的单电荷部分局部放大图；其中m/z5360附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z5320附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。

[0077] 图5为实施例3中普通纯牛奶(A1/A2型)的MALDI-TOF-MS谱图的双电荷部分局部放大图；其中m/z2680附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z2660附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。

[0078] 图6为实施例4中A2奶粉的MALDI-TOF-MS谱图。

[0079] 图7为实施例4中A2奶粉的MALDI-TOF-MS谱图的单电荷部分局部放大图；其中m/z5360附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z5320附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。

[0080] 图8为实施例4中A2奶粉的MALDI-TOF-MS谱图的双电荷部分局部放大图；其中m/z2680附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z2660附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。

[0081] 图9为实施例5中牦牛奶和山羊奶样本中A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的MALDI-TOF-MS谱图的局部放大图；其中m/z5360附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z5320附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。

具体实施方式

[0082] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是实例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0083] 本发明采用的质谱仪为：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(Clin-TOF-II，北京毅新博创生物科技有限公司)。

[0084] 下列实施例采用的质谱条件如下：

[0085] 调制方式：线性；数据收集范围：m/z1000～20000；谱图采集数量：每个样品点收集50张谱图，每张谱图用激光轰击10次；激光频率：30Hz；最佳脉冲提取：5340Da。

[0086] 表1.飞行时间质谱主要特征峰列表

[0087] 名称单电荷/双电荷 m/z 允许偏移范围A1β-酪蛋白单电荷 5360 ±5‰以内
A2β-酪蛋白单电荷 5320 ±5‰以内
A1β-酪蛋白双电荷 2680 ±5‰以内
A2β-酪蛋白双电荷 2660 ±5‰以内

[0088] 实施例1.检测结果重现性验证

[0089] 1.样本前处理

[0090] a)取市售普通牛奶(商品名称：三元纯牛奶；生产商：北京三元食品股份有限公司；产地：中国)与市售A2牛奶(商品名称：极致A2-β酪蛋白鲜牛奶；生产商：北京三元食品股份有限公司；产地：中国)，按体积比1:1将两种牛奶混合均匀。

[0091] b)准确吸取18份相同的混合牛奶样品，每份10μl，每份牛奶样本加入920μl碳酸氢钠缓冲液，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0092] c)加入10μl二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min。

[0093] d)冷却至室温后加入30μl碘代乙酰胺溶液，室温避光静置30min。

[0094] e)加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2小时以上。

[0095] f)加入20μl纯甲酸终止反应。得到样本处理液。

[0096] g)吸取20μl样本处理液与20μlSA基质混合，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0097] h)吸取1μl样本基质混合液均匀涂点在质谱专用靶板上。

[0098] 2.MALDI-TOF-MS质谱检测

[0099] a)将质谱仪参数设置为：调制方式：线性；数据收集范围：m/z1000～20000；谱图采集数量：每个样品点收集50张谱图，每张谱图用激光轰击10次；激光频率：30Hz；最佳脉冲提取：5340Da。

[0100] b)用已知外标蛋白校正质谱质量轴，校正后的平均分子偏差应小于500ppm。

[0101] c)用相同的质谱参数进行样本点的检测。结果如图1所示。

[0102] 3.软件分析

[0103] a)将质谱仪自动生成的ascii文件导入飞行时间质谱A2β-酪蛋白检测软件。计算A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白特征峰的峰强度比值。

[0104] b)表2.检测结果重现性

[0105]样本类型峰强比均值峰强比SD 峰强比CV
牛奶 0.430 0.015 3.48％

[0106] c)峰强比CV值小于5％，说明重现性良好。

[0107] 实施例2 A2-β酪蛋白半定量检测

[0108] 1.样本前处理

[0109] a)选取三元纯牛奶样品(商品名称：三元纯牛奶；生产商：北京三元食品股份有限公司；产地：中国)为本实施例中的A1/A2杂合型牛奶；

[0110] b)选取A2全脂奶粉样品(商品名称：A2全脂成人奶粉；生产商：A2有限公司；产地：新西兰；进口商：中国农垦控股上海公司)为本实施例中的A2纯合型牛奶样品；

[0111] c)准确称取A2全脂奶粉样品1.00g，加入纯化水，涡旋混合仪上3000rpm涡旋2min使乳粉完全溶解；

[0112] d)将A1/A2杂合型牛奶和A2纯合型牛奶分别按下表体积混合均匀；

[0113] e)表3.乳品混合体积表

[0114]

[0115]

[0116] f)精确吸取各组混合好的牛奶样本各10μl加入920μl碳酸氢钠缓冲液(pH9.5,0.1M)，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0117] g)加入10μl二硫苏糖醇溶液(1M)，50℃恒温反应30min。

[0118] h)冷却至室温后加入30μl碘代乙酰胺溶液，室温避光静置30min。

[0119] i)加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2小时以上。

[0120] j)加入20μl纯甲酸终止反应。得到样本处理液。

[0121] k)吸取20μl样本处理液与20μlSA基质混合，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0122] l)吸取1μl样本基质混合液均匀涂点在质谱专用靶板上。

[0123] 2.MALDI-TOF-MS质谱检测

[0124] a)将质谱仪参数设置为：调制方式：线性；数据收集范围：m/z1000～20000；谱图采集数量：每个样品点收集50张谱图，每张谱图用激光轰击10次；激光频率：30Hz；最佳脉冲提取：5340Da。

[0125] b)用已知外标蛋白校正质谱质量轴，校正后的平均分子偏差应小于500ppm。

[0126] c)用相同的质谱参数进行样本点的检测。

[0127] 3.软件分析

[0128] a)将质谱仪自动生成的ascii文件导入飞行时间质谱A2β-酪蛋白检测软件，得到定性及相对定量结果。

[0129] 4.结果分析：

[0130] 如图2所示，m/z5360附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z5320附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。随着待检样品相对含量的变化，在m/z5360和m/z5320处出现质谱峰的峰强度(或峰面积)比例发生变化。该变化趋势与上表内容一致，充分证明可以通过峰强度(或峰面积)变化程度与两种样品的相对含量存在相关性。

[0131] 实施例3市售纯牛奶检测

[0132] 1.样本前处理

[0133] a)准确吸取10μl纯牛奶样品(商品名称：三元纯牛奶；生产商：北京三元食品股份有限公司；产地：中国)，加入920μl碳酸氢钠缓冲液，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0134] b)加入10μl二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min。

[0135] c)冷却至室温后加入30μl碘代乙酰胺溶液，室温避光静置30min。

[0136] d)加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2小时以上。

[0137] e)加入20μl纯甲酸终止反应。得到样本处理液。

[0138] f)吸取20μl样本处理液与20μlSA基质混合，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0139] g)吸取1μl样本基质混合液均匀涂点在质谱专用靶板上。

[0140] 2.MALDI-TOF-MS质谱检测

[0141] a)将质谱仪参数设置为：调制方式：线性；数据收集范围：m/z1000～20000；谱图采集数量：每个样品点收集50张谱图，每张谱图用激光轰击10次；激光频率：30Hz；最佳脉冲提取：5340Da。

[0142] b)用已知外标蛋白校正质谱质量轴，校正后的平均分子偏差应小于500ppm。

[0143] c)用相同的质谱参数进行样本点的检测。

[0144] 3.软件分析

[0145] a)将质谱仪自动生成的ascii文件导入飞行时间质谱A2β-酪蛋白检测软件，得到定性及相对定量结果。

[0146] 4.结果分析：

[0147] 如图3和图4所示，m/z5360附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z5320附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。由于待检样品在m/z5360和m/z5320处同时出现质谱峰，说明被测牛奶为A1/A2杂合型牛奶。A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白的特征峰峰强度(或峰面积)比例与两种蛋白的含量存在相关性。

[0148] 如图5所示，m/z2680附近的谱峰为A1β-酪蛋白双电荷峰；m/z2660附近的谱峰为A2β-酪蛋白双电荷峰。同时出现两种蛋白的双电荷峰同样代表两种蛋白同时存在，即被测样本为A1/A2杂合型牛奶。

[0149] 实施例4市售A2奶粉检测

[0150] 1.样本前处理

[0151] a)准确称取牛乳粉1.00g(商品名称：A2全脂成人奶粉；生产商：A2有限公司；产地：新西兰；进口商：中国农垦控股上海公司)，加入纯化水，涡旋混合仪上3000rpm涡旋2min使乳粉完全溶解。

[0152] b)准确吸取10μl牛乳粉溶解液样品，加入920μl碳酸氢钠缓冲液，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0153] c)加入10μl二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min。

[0154] d)冷却至室温后加入30μl碘代乙酰胺溶液，室温避光静置30min。

[0155] e)加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2小时以上。

[0156] f)加入20μl纯甲酸终止反应。得到样本处理液。

[0157] g)吸取20μl样本处理液与20μlSA基质混合，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0158] h)吸取1μl样本基质混合液均匀涂点在质谱专用靶板上。

[0159] 2.MALDI-TOF-MS质谱检测

[0160] a)将质谱仪参数设置为：调制方式：线性；数据收集范围：m/z1000～20000；谱图采集数量：每个样品点收集50张谱图，每张谱图用激光轰击10次；激光频率：30Hz；最佳脉冲提取：5340Da。

[0161] b)用已知外标蛋白校正质谱质量轴，校正后的平均分子偏差应小于500ppm。

[0162] c)用相同的质谱参数进行样本点的检测。

[0163] 3.软件分析

[0164] 将质谱仪自动生成的ascii文件导入飞行时间质谱A2β-酪蛋白检测软件，得到定性及相对定量结果。

[0165] 4.结果分析

[0166] 结果如图6和图7所示，其中m/z5360附近的谱峰为A1β-酪蛋白特征峰；m/z5320附近的谱峰为A2β-酪蛋白特征峰。由于质谱谱图7只在m/z5320处出现质谱峰。说明被测牛乳粉为A2型牛乳粉，与商售情况一致。

[0167] 如图8所示，m/z2680附近的谱峰为A1β-酪蛋白双电荷峰；m/z2660附近的谱峰为A2β-酪蛋白双电荷峰。质谱谱图8只在m/z2660处出现质谱峰，同样代表被测样本不含A1β-酪蛋白，即被测样本为A2纯合型牛奶。

[0168] 实施例5牦牛奶和山羊奶样本检测

[0169] 1.样本前处理

[0170] a)随机挑选牦牛奶和山羊奶各1ml样品，并从中准确吸取10μl，加入920μl碳酸氢钠缓冲液，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0171] b)加入10μl二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min。

[0172] c)冷却至室温后加入30μl碘代乙酰胺溶液，室温避光静置30min。

[0173] d)加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2小时以上。

[0174] e)加入20μl纯甲酸终止反应。得到样本处理液。

[0175] f)吸取20μl样本处理液与20μlSA基质混合，涡旋混合仪上1200rpm涡旋30s。

[0176] g)吸取1μl样本基质混合液均匀涂点在质谱专用靶板上。

[0177] 2.MALDI-TOF-MS质谱检测

[0178] a)将质谱仪参数设置为：调制方式：线性；数据收集范围：m/z1000～20000；谱图采集数量：每个样品点收集50张谱图，每张谱图用激光轰击10次；激光频率：30Hz；最佳脉冲提取：5340Da。

[0179] b)用已知外标蛋白校正质谱质量轴，校正后的平均分子偏差应小于500ppm。

[0180] c)用相同的质谱参数进行样本点的检测。

[0181] 3.软件分析

[0182] 将质谱仪自动生成的ascii文件导入飞行时间质谱A2β-酪蛋白检测软件，得到定性及相对定量结果。

[0183] 4.结果分析

[0184] 结果如图9所示，质谱谱图同时在m/z5360和m/z5320处出现质谱峰。说明两种被测奶(牦牛奶和山羊奶)均为A1/A2型奶。

[0185] 从两个特征峰峰强度(或峰面积)的相对比例来看，牦牛奶的A1峰/A2峰的比值更低，说明牦牛奶中含有更多的A2β-酪蛋白。

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