포도부채잎바이러스 피시알 검사 시스템{PCR detection system for Grapevine fanleaf virusspot virus}

본 발병은 포도 등에 발생하고 있는 포도부채잎바이러스( Grapevine fanleaf virus , 이하, 'GFLV'이라 한다)를 진단하기 위한 피시알(PCR) 검사시스템에 관한 것이다.

피시알 검사시스템은 GFLV 진단용 최적 프라이머 조합 및 이에 부합하는 검정용 프라이머 조합(nested primer)과 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 조합 및 양성대조구를 포함하고 있다.

바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 효소면역 진단법(Enzyme-linked immunosorbent assay; 이하 'ELISA'이라 한다)은 가장 일반적으로 사용하여온 진단방법이나 PCR 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.

GFLV는 자연상태에서 주로 포도 등에 발생하고 있으며, 전염수단은 즙액, 접 목, 종자, 선충 등 이다. GFLV는 검역대상 병원체로서 수입되는 포도, 콩 등으로부터 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 지금까지 GFLV를 진단하기 위하여 주로 ELISA 방법을 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있다. 또한 검사할 종자에서 GFLV의 감염율이 낮을 경우 ELISA 진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다. 그리하여 이런 종자에서 바이러스를 검출하기 위해서는 일반적으로 ELISA 진단법보다 검출감도가 1000배 정도 높은 피시알 진단법이 필요하다. 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 됨으로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요된다. 그래서 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. 피시알 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비하여 병원체별 진단용 프라이머 은행의 구축과 피시알 양성 및 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 필요로 한다. 한편, 분리주 특이적 프라이머를 진단에 사용할 경우 검사에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.

현재 RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법을 가장 일반적으로 사용되고 있다. 병원체의 피시알 진단을 위해서는 종 특이 프라이머의 개발이 가장 중요하다. GFLV를 진단하기 위한 특이 프라이머는 특허 출원된 바 없다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로, 검출한계가 높고 현재까지 알려진 모든 GFLV 계통과 반응할 수 있으며, 양성 및 음성 반응을 모두 검정할 수 있는 포도부채잎바이러스(GFLV)의 PCR 검사 시스템을 제공한다.

본 발명은 서열번호 8과 19로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 9과 18로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 11과 16으로 표시되는 프라이머 조합; 및 서열번호 12와 15로 표시되는 프라이머 조합;으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 포도부채잎바이러스 진단용 프라이머를 제공한다.

바람직하게, 서열번호 9과 18로 표시되는 프라이머 조합 및 서열번호 11과 16으로 표시되는 프라이머 조합으로 이루어진 포도부채잎바이러스 진단용 프라이머를 제공한다.

더욱 바람직하게, 상기 서열번호 9과 18로 표시되는 프라이머 조합의 RT-PCR 산물을 서열번호 10과 19로 표시되는 프라이머 조합 및 서열번호 11과 19로 표시되는 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 검정하는 포도부채잎바이러스 진단용 프라이머를 제공한다.

또한, 더욱 바람직하게, 상기 서열번호 11과 16으로 표시되는 프라이머 조합의 RT-PCR 산물을 서열번호 12와 17로 표시되는 프라이머 조합 및 서열번호 13과 17로 표시되는 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 검정하는 포도부 채잎바이러스 진단용 프라이머를 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 바이러스 샘플의 게놈 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 포도부채잎바이러스 진단방법을 제공한다.

바람직하게, 바이러스 샘플의 게놈 RNA을 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 RNA을 주형으로 하고, 제1항의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 상기 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 포도부채잎바이러스 진단방법을 제공한다.

또한, 바람직하게 상기 PT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계 후에 청구항 제3항 또는 제4항의 검정용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 더 포함하는 포도부채잎바이러스 진단방법을 제공한다.

더 바람직하게, 상기 PCR을 수행하는 단계에서 양성대조구로서 서열번호 28로 표시되는 염기서열을 이용하는 포도부채잎바이러스 진단방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 청구항 제1항의 프라이머를 포함하는 포도부채잎바이러스 진단 키트를 제공한다.

바람직하게, 상기 포도부채잎바이러스 진단 키트는 서열번호 28로 표시되는 양성 대조구를 더 포함한다.

GFLV 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통(strain) 또는 분리주(isolate)들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있다. 다시 말해서 바이러스 진단용 프라이머는 바이러스 각각에 대하여 종 특이적으로 작동하여야 한다. 이에 따라, 본 발명에서의 프라이머는 종 특이적으로 작동하도록 설계하였다. 본 발명에서 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단대상이 되는 바이러스 전체의 유전체 서열로부터 특이적인 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 바이러스의 종 내의 모든 계통에 대하여 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종 또는 식물체 유래의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다.

즉, 종 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통염기서열을 탐색하였다. 그리고 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외함으로써 종 특이적 서열을 선발하였다. 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하였다. 설계한 프라이머들은 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수한 조합을 최종적으로 선발하였다.

또한, 최종 선발된 프라이머 조합에 대하여 검정용 프라이머(nested primer)를 함께 개발하였다.

또한 GFLV에 대한 다양한 진단용 프라이머 조합을 확보하여 PCR 양성반응 및 음성반응을 검정할 수 있는 프라이머 조합을 구축하였다. 그리고 GFLV의 프라이머 설계 영역을 클로닝한 플라스미드를 제조하여 양성대조구를 확보하였으며, 염기서열을 결정하여 양성반응을 확인할 수 있게 하였다. 아울러 PCR 반응조건을 모든 바이러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 개발하여 검역현장에서 검사효율을 높일 수 있게 하였다.

포도부채잎바이러스(GFLV) PCR 검사 시스템은 식물체 종자와 조직 등으로부터 GFLV를 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 진단할 수 있다. PCR 검사 시스템에 포함된 GFLV 진단용 프라이머는 지금까지 알려진 GFLV 모든 계통들과 반응할 수 있게 개발되었으며, 또한 양성 및 음성 반응의 검증을 위한 도구를 포함하고 있다. 본 발명의 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장에서 식물체 종자로부터GFLV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.

본 발명의 진단법을 실시할 경우 포도, 콩 등의 식물체 및 종자로부터 GFLV 감염여부를 정밀하게 진단할 수 있다. 또한 식물 바이러스에 대한 RT-PCR 진단키트의 산업화가 가능하다. 본 발명을 실시함으로써 국내에서 GFLV의 피해를 최소화할 수 있을 것이며, 국경 검역현장에서 손쉽게 활용할 수 있어 외국으로부터 GFLV에 감염된 식물체 및 종자의 유입을 효과적으로 차단할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예로서 더 상세히 설명한다.

[실시예 1] GFLV 진단용 프라이머의 설계 및 조합

GFLV는 한가닥 RNA로 구성된 직경 약 30nm의 구형 바이러스이다. GFLV의 게놈은 두 가지로 구성되는데 전체 약 11.1kb이며, RNA 1은 약 7.3kb, RNA 2는 약 3.7kb 이다. 분류학적으로 코모비리데(Comoviridae) 네포바이러스(Nepovirus) 속(genus)에 속한다. GFLV는 주로 즙액, 접목, 종자, 선충 등에 의해 전염된다. 자연상태에서 대부분의 기주는 포도속 식물과 관련이 있으나, 실험적으로는 콩과, 가지과 등 다양한 기주를 가진다. 진단용 프라이머의 설계는 외피단백질이 코드된 RNA 2를 대상으로 이루어졌다.

GFLV 공통염기서열 탐색은 지금까지 알려진 31가지 GFLV 분리주의 염기서열(표 1)을 다중 비교하여 이루어졌다. 이렇게 선발된 공통염기서열은 GFLV와 분류학적으로 유사한 코모비리데(Comoviridae) 3종의 바이러스 염기서열(표 2)과 비교하여 종 특이적인 서열을 탐색하였다. 이러한 종 특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 진단용 프라이머 27가지를 설계하였다(표 3).

[표 1] 공통염기서열 분석에 사용한 GFLV 분리주 염기서열

[표 2] 종 특이적 염기서열 분석에 이용한 코모비리데 염기서열

[표 3] GFLV 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머

위치 ^* : Genbank ac. no. NC_003623을 기준으로 작성.

설계한 프라이머의 위치는 도 1과 같다. 이들 프라이머를 이용하여 90가지의 프라이머 조합을 만들었으며, RT-PCR 예상산물은 표 4과 같다.

[표 4] GFLV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물

* 프라이머의 위치는 Genbank ac. no. NC_003623을 기준으로 작성.

[실시예 2] GFLV 진단용 프라이머 조합 구축 및 최적 프라이머 조합의 선발

표 4과 같이 설계한 GFLV 프라이머들은 90가지로 조합하여, GFLV 및 여러 가지 관련 바이러스와의 RT-PCR 검정을 통하여 진단에 가장 효과적인 프라이머 조합을 선발하였다. 최적 진단용 프라이머 조합의 선발은 3가지 단계로 이루어졌다. 첫 번째는 GFLV 감염식물체와의 RT-PCR을 통한 선발이며, 두 번째는 분류학적 유사성이 있는 코모비리데 바이러스와의 비특이적 반응 분석이며, 세 번째는 GFLV의 자연기주인 박과 식물에 감염되는 바이러스와의 RT-PCR 분석을 통한 선발이다.

본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.

(1) 전체 RNA 분리 : 상업적으로 시판되는 total RNA 분리 키트(페놀을 이용한 방법(Promega), TRIzol(Invitrogen Co.), easy-spin TM Total RNA Kit(iNtRON Co.))를 이용하여 분리하였다.

(2) RT-PCR : 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5㎕, 12.5pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250mM Tris-HCl, 150mM KCl, 40mM MgCl ₂ , 5mM DTT, pH 8.5) 1㎕, 10mM dNTP 0.5㎕, 10U RNase inhibitor, 그리고 2U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5㎕를 42℃에서 1시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사 반응액 5㎕에 12.5pmole 업스트림프라이 머(upstream primer), 1.25U Taq DNA polymerase, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl ₂ , pH 8.3) 2㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 55℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5× TBE 완충액과 1.5% 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.

도 2는 표 4의 90가지 프라이머 조합의 GFLV와의 특이성을 검정한 것이다. 도 2의 상단의 숫자는 조합의 번호를 의미한다. RT-PCR 주형으로 GFLV에 감염된 포도 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였다.

도 2에서 보는 바와 같이, GFLV 감염식물체와의 RT-PCR 검정에서 90가지 프라이머 조합 중에서 반응강도가 뛰어나고 진단에 장해가 되는 비특이적 반응을 보이지 않는 20가지(조합 8, 9, 15, 17, 25, 26, 39, 40, 41, 42, 49, 50, 51, 58, 65, 72, 82, 83, 85, 88) 프라이머 조합을 선발하였다.

도 3은 선발된 GFLV 진단용 프라이머 조합과 코모비리데 바이러스의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기에서 선발된 20가지 프라이머 조합은 분류학적으로 유사한 바이러스인 코모비리데 10가지 바이러스와의 비특이적 반응 분석을 통하여 4가지(조합 17, 25, 42, 51) 프라이머 조합을 선발하였다(도 3). 비특이적 반응 분석에는 Comoviridae에 속하는 Cowpea mosaic virus (CPMV), Squash mosaic virus (SqMV), Broad bean wilt virus (BBWV), Broad bean wilt virus 2 (BBWV2), Tobacco ringspot virus (TRSV), Tomato ringspot virus (ToRSV), Tomato black ring virus (TBSV), Arabis mosaic virus (ArMV), Cherry leaf roll virus (CLRV), Raspberry ringspot virus (RpRSV)를 이용하였다.

도 4는 선발된 GFLV 진단용 프라이머 조합(25, 42)과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR의 분석결과를 나타낸 것이다. 분류학적 유사바이러스와의 분석에서 선발된 조합 중에서 조합 25와 42는 GFLV 기주와 관련된 22가지 바이러스와의 RT-PCR 분석 결과 2가지(조합 25, 42) 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다.

[표 5] 기주 관련 바이러스와의 비특이적 반응 분석에 이용된 바이러스

상기 결과들을 바탕으로 하여 종자 또는 식물체로부터 GFLV를 진단할 경우, 우선적으로 최적 진단용 프라이머로 선발된 프라이머 조합 25, 42을 이용하여 RT-PCR를 수행한다. 이 진단 결과가 미흡할 경우 GFLV 진단용 프라이머 조합의 다른 프라이머의 조합을 이용하여 검증이 가능할 것이다.

[실시예 3] GFLV의 진단 및 검증의 예

검사현장에서 GFLV 진단용 최적 프라이머로 조합 25 및 조합 42을 이용하여 1차적인 진단한다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 GFLV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 한다. 여기서, 조합 25에 대한 검정용 프라이머 조합은 조합 35(GFLV R40/F130) 및 조합 36(GFLV R40/F140)이며, 조합 42에 대한 검정용 프라이머 조합은 조합 53(GFLV R60/F110) 및 조합 54(GFLV R60/F120)이다.

도 5는 GFLV 진단용 최적 프라이머 조합 및 검정용 프라이머 조합의 RT-PCR 분석결과를 나타낸 것이다. 도 5에서, M은 size marker를 나타낸다. 1 레인은 최적 진단용 프라이머 조합 25의 RT-PCR 결과(699bp), 2 레인은 조합 25에 대한 검정용 프라이머 조합으로서 조합 35의 RT-PCR 결과(430bp), 3 레인은 조합 25에 대한 검정용 프라이머 조합으로서 조합 36의 RT-PCR 결과(280bp)를 나타낸다. 또한, 4 레인은 최적 진단용 프라이머 조합 42의 RT-PCR 결과(582bp), 5 레인은 조합 42에 대한 검정용 프라이머 조합으로서 조합 53의 RT-PCR 결과(289bp), 6레인은 조합 42에 대한 검정용 프라이머 조합으로서 조합 54의 RT-PCR 결과(164bp)를 나타낸다.

이때 RT-PCR 반응 결과가 GFLV 유래에서 비롯되었다면 도 6에서와 같이, 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낸다.

부가적으로 이러한 본 발명의 GFLV 프라이머 조합으로부터 유래된 PCR 산물을 쉽게 확인할 수 있도록 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 양성 대조구로서 도 7의 염기서열(서열번호 28)을 제조하였다. 이 양성 대조구는 PCR 검사시 양성대조구로 이용가능하며, 또한 확인인 필요한 PCR 산물의 염기서열을 쉽게 비교할 수 있도록 양성대조구 플라스미드의 삽입된 영역의 염기서열을 결정하여 제공하였다.

도 6는 GFLV 양성대조구로부터의 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물을 나타낸다. 도 6에서, M은 size marker를 나타낸다. 1 레인은 양성 대조군에 삽입된 GFLV DNA 단편으로서 조합 1의 PCR 결과(서열번호 28; 1,656bp), 2 레인은 진단용 프라이머 조합 25의 PCR 결과(699bp), 3 레인은 진단용 프라이머 조합 42의 PCR 결과(582bp)를 나타낸다.

도 1은 포도부채잎바이러스(GFLV)에 대한 프라이머의 위치를 도시한 것이다. 여기서 프라이머의 위치는 Genbank ac. no. NC_003623을 기준으로 작성한 것이다.

도 2는 포도부채잎바이러스(GFLV)에 대한 90가지 프라이머 조합의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 선발된 프라이머 조합과 코모비리데바이러스의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 선발된 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 포도부채잎바이러스(GFLV) 진단용 프라이머 조합(조합 25 및 42) 및 검정용 프라이머 조합의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 포도부채잎바이러스(GFLV) 양성대조구로부터 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물을 나타낸 것이다.

도 7은 양성대조구에 삽입된 포도부채잎바이러스(GFLV)의 염기서열이다(GFLV-R10/F60)(1,656bp).

<110> the Republic of Korea <120> PCR detection system for Grapevine fanleaf virus <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 1 gaaattcgcc atgctcaarc a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 2 ctaccgctgc ttccccctct rc 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 3 ctgtgtcgga ggaagagatg ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 4 gatctgcttc cacattctta gg 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 5 tgggacctct acagtgggaa agtg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 6 agaggattag ctggtagagg agta 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 7 cttcaagggt gtccagtatg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 8 tgcctttact ggattgacrt 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 9 rtctccaagg ttgcatttca cr 22 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 10 tacttgccct cccatattct ttga 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 11 gttgtgtttt gggtatggga ggta 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 12 cccggggtgt atgtggaaga ggay 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 13 ggtgagactg cgcaacttcc tatt 24 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 14 cctagactgg gaaactggt 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 15 agtgtttggr tttgctcctg 20 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 16 ctgcaaaatt cccaaccaac aact 24 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 17 attcggtgtt cagactccay t 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 18 tcacccgaag gagcgatagg 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 19 acttccgtcc tcttccacat acac 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 20 acctcccata cccaaaacac aact 24 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 21 gcttgccagt ctgccgctar c 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 22 acatgaaaac gtgcccaact ta 22 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 23 ttcagggtgc ccaagtatct rttt 24 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 24 ggttcctcca cactttccca ttg 23 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 25 ccctaagaat gtggaagcag aw 22 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 26 cttccatctc ttcctccgac acrg 24 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 27 ctgcgcagag ggggaagc 18 <210> 28 <211> 1656 <212> DNA <213> Grapevine fanleaf virus <400> 28 tgggacctct acagtgggaa agtgtagagg aaccagggca aaccttctct attagaagtc 60 gctcacggtc tgtgaggatt gacagaaatg ttgatcttcc tcaacttgag gctgagccca 120 gattgagctc aaccgtgaga ggattagctg gtagaggagt catttacatc cctaaggatt 180 gccaggcaaa caggtatctg ggcaccctga acatacgtga tatgatttca gattttaagg 240 gtgttcagta cgaaaaatgg ataactgcag ggttagtcat gccaactttc aagatagtta 300 ttaggctgcc tgcaaatgct tttaccggat tgacatgggt gatgagcttt gatgcttata 360 atcggataac tagtagaatc actactagtg cagatcctgt atataccctg tccgttccgc 420 actggcttat ccatcataag ttgggcacgt tttcatgtga gatagattat ggagaattgt 480 gtggtcatgc catgtggttt aagtccacaa catttgagtc tccaaggcta catttcacat 540 gtttaacggg caacaacaaa gagctggcgg cagactggca agctgtcgtc gaattgtatg 600 ctgaattgga agaggcctcc tcttttcttg ggaaaccaac tttggttttt gacccaggag 660 tttttaatgg taaattccaa tttcttactt gccctcccat attctttgat ttaacggccg 720 tcacggctct taaaagtgct gggctgacat tgggacaagt cccaatggtt ggcactacta 780 aggtatataa cctaaacagc gctcttgcga gttgtgtttt gggtatggga ggtactatta 840 ggggaagggt gcacatttgt gcgccaatct tttatagtat tgttctgtgg gtcgttagtg 900 agtggaacgg gaccaccatg gattggaatg aactttttaa atatcccggg gtgtatgtgg 960 aagaggacgg aagctttgaa gtcaaaattc gctctccata tcaccggaca cctgctagat 1020 tgcttgctgg tcaaagtcag agggacatga gctctctaaa tttctatgca atagcaggac 1080 ctattgctcc gtcgggtgag accgcgcgac ttcctatcgt tgtacaaatt gatgaaatcg 1140 tgcgcccaga ccttgctcta ccgagttttg aagacgacta ttttgtatgg gtggattttt 1200 ctgagttcac ccttgacaaa gaagaaatag agattggttc tcgtttcttt gattttactt 1260 caaatacttg tagagtgatt atgggggaaa acccatttgc tgcaatgatc gcttgccatg 1320 gattacatag tggtgtatta gacctcaaac ttcaatggag tctgaacacc gattttggca 1380 aaagtagcgg gagcgttaca gtcacgaagc tggtgggcga caaagctaca ggtctggatg 1440 ggccttctca ggtttttgct attcaaaaat tagagggaac tacagaattg ttgattggga 1500 attttgcagg agcaaaccca aacactcatt tctccctata tagtcgatgg atggcaatca 1560 aattagaccg agcaatgagt attaaagtac tccgagtctt gtgcaagcct cgtccaggtt 1620 tcaactttta tggaaggacc agtttcccag tctagg 1656