【技术领域】
[0001] 本
发明涉及香烟技术领域。更具体地，本发明涉及一种烟用生物香料，还涉及所述烟用生物香料的制备方法，还涉及所述烟用生物香料的用途。【背景技术】
[0002] 低次烟叶青杂气较重，香气和口感较差，同时烟叶本身存在
蛋白质含量较高的因素，对烟气影响较大，制约了其可利用性。用蛋白质酶处理可以起到明显作用，但是成本较高。而利用烟叶上的
微生物对蛋白质进行作用，对烟叶香气品质的改善，以及烟叶的陈化过程，有着双重优势。前人指出烟叶
发酵最初是微生物的活动引起的，在烟叶醇化过程中，烟叶中微生物主要以烟叶中有机成分作为主要营养物质，将
淀粉类，蛋白质类，木质素类各自分解为醇类、酯类及其他芳香物质，
氨基酸等，各种糖类以及低分子量物质。在此
基础上，再经过美拉德反应，使得烟叶香气品质得到改善。
[0003] 我国科技工作者利用微生物技术制备烟用香料进行了大量研究工作，取得良好效果。CN97101106公开了一种制取烟用香料的方法。该方法包括以
烟草物料为原料，原料
粉碎后，加
水或加水蒸煮灭菌，接入发酵菌种，在
温度20-70℃下发酵2小时-30天形成发酵醪，然后加入
溶剂萃取发酵醪，再经分离提纯得到产品。该产品较一般烟草浸膏、精油等香料醇和，修饰
卷烟香气作用明显，并具有独特的香气特征。CN200610011011公开了一种烟用香料及其制备方法。使用桔梗、贝母、沙参、甘草、茯苓、党参为原料，粉碎或直接加水灭菌，接入发酵菌种，形成发酵醪；用
水溶性溶剂萃取发酵醪，然后将萃取液浓缩即得膏状烟用香料成品。CN200810046834公开了一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法,该方法包括烟叶复合培养基的制备、产香微生物的筛选、用筛选的白肋烟叶表面优势菌对咖啡进行液体发酵或固体发酵，得到发酵咖啡烟用香料。CN201010143875公开一种发酵型烟用葡萄枸杞香料及其制备方法。它是将葡萄汁和枸杞提取物混合后加入
葡萄糖制得培养基，将酿酒
酵母HHL-1的培养物制得培养液，然后将培养基置入培养液中进行发酵制备而成。
[0004] 但是，这些技术还存在许多
缺陷，例如制得产品的香气
质量与烟气之间的补偿程度，另外烟草本身杂气可能依然存在。因此，本
发明人在总结
现有技术的基础上，经过大量试验研究完成了本发明。【发明内容】
[0005] [要解决的技术问题]
[0006] 本发明的目的是提供一种烟用生物香料。
[0007] 本发明的另一个目的是提供所述烟用生物香料的制备方法。
[0008] 本发明的另一个目的是提供所述烟用生物香料的用途。
[0009] [技术方案]
[0010] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0011] 本发明涉及一种烟用生物香料的制备方法。该方法烟用生物香料制备的步骤如下：
[0012] A、制备米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC40186菌种基本培养液：将1-3g胰蛋白胨、0.5-1.5g酵母提取物、1-3g
氯化钠和0.1-0.3g氯化
钙溶于160-240ml水中得到一种溶液，然后用1-3N氢
氧化钠水溶液将其溶液调节至pH7.0，得到米曲霉CICC40186菌种基本培养液。
[0013] 本发明使用的米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC40186菌种是中国微生物菌种总目录工业微生物菌种中收录的菌种。
[0014] 胰蛋白胨是一种优质蛋白胨，是以新鲜
牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而得到的浅黄色粉末。它含有丰富的氮源、氨基酸等，可用于配制各种微生物培养基。
[0015] 酵母提取物是酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的物质。其中氨基酸含量30%以上，总蛋白50%以上，核苷酸10%以上，主要应用于食品、
调味品、
化妆品等领域。
[0016] 胰蛋白胨、酵母提取物都是目前市场上销售的产品。
[0017] 然后，将米曲霉CICC40186菌种按照以其基本培养液体积计1-4%接种量接入在米曲霉CICC40186菌种基本培养液中，在恒温摇床、温度25-30℃、转速120-180rpm的条件下培养24～48h，得到米曲霉CICC40186
种子培养液。
[0018] 优选地，米曲霉CICC40186菌种的接种量是按照以其基本培养液体积计2-3%。
[0019] 米曲霉CICC40186菌种在米曲霉CICC40186菌种基本培养液中在温度26-28℃与转速140-160rpm的条件下培养30～40h。
[0020] B、将10-20g低次烟末、0.5-1.5g葡萄糖和0.01-0.04g
氯化钙溶于160-240ml水中，自然pH，得到一种烟末培养液；再按照以其烟末培养液体积计1-4%接种量接入米曲霉CICC40186种子培养液；在恒温摇床、温度25-30℃、转速120-180rpm的条件下培养24～48h；从其培养物中分离烟末，该烟末用去离子水洗涤，再在
微波功率900-1200w的条件下进行微波灭菌1-5min；同时，其培养物在4500-5500rpm的条件下离心分离其菌体，得到的澄清菌液再加到灭菌的烟末中，得到一种经米曲霉CICC40186菌种处理的无菌体培养液。
[0021] 优选地，米曲霉CICC40186菌种的接种量是按照以其烟末培养液体积计2-3%。
[0022] 米曲霉种子培养液在烟末培养液中在温度26-28℃与转速140-160rpm的条件下培养30～40h。
[0023] 所述烟末洗涤后再在微波功率1000w的条件下进行微波灭菌2-4min。
[0024] 所述培养物在4800-5200rpm的条件下离心分离2-4min。
[0025] 恒温摇床是一种有不锈
钢万用夹具、数显控温、无级调速和良好热循环功能的生化实验设备，是一种多用途的生化反应器，适用于生物、生化、细胞、菌种等各种液态、固态振荡培养。
[0026] 本发明使用的恒温摇床是目前市场上销售的产品，例如金坛市华城创威实验仪器厂、常州菲普实验仪器厂生产的产品。
[0027] 本发明使用的微波设备与离心设备都是目前市场上广泛销售的产品。
[0028] C、制备东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液：将浓度8-12%豆芽汁培养基和10g葡萄糖溶于160-240ml水中，自然pH，得到一种东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液。
[0029] 本发明使用的东方伊萨酵母菌CICC31431是中国微生物菌种总目录工业微生物菌种中收录的菌种。
[0030] 所述的豆芽汁培养基是使用黄豆芽、葡萄糖、琼脂制成的，将200g黄豆芽洗净放入1000mL水中煮沸20-30分钟，过滤得到豆芽汁，补充至1000mL，再取豆芽汁10mL、
磷酸氢二铵1g、KCl0.2g、MgSO4.7H2O0.2g和琼脂20g，将这些成分加入到蒸馏水中，加热使它们完全溶解，然后分装于三
角瓶中，用0.04%的溴甲酚紫酒精溶液作为指示剂，调节pH至6.2~6.4，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的豆芽汁培养基。它是人们普遍使用的酵母菌发酵培养基。
[0031] 然后，在东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液中按照以其基本培养液体积计1-4%接种量接入东方伊萨酵母菌CICC31431菌种，在恒温摇床、温度25-30℃、转速120-180rpm的条件下培养24～48h，得到东方伊萨酵母菌CICC31431种子培养液。
[0032] 优选地，东方伊萨酵母菌CICC31431菌种的接种量是以其基本培养液体积计2-3%。
[0033] 东方伊萨酵母菌CICC31431菌种在其基本培养基中在温度26-28℃与转速140-160rpm的条件下培养30～40h。
[0034] D、往160-240ml在步骤C得到的经米曲霉CICC40186菌种处理的无菌体培养液中添加0.5-1.5g葡萄糖，混匀后再按照以其培养液体积计1-4%接种量往其中接入东方伊萨酵母菌CICC31431种子培养液，在恒温摇床、温度25-30℃、转速120-180rpm的条件下培养144～168h，得到的培养发酵液在搅拌回流装置加热锅温度60-80℃与旋转速度150-200转/分的条件下进行
蒸发40-60min，然后在
旋转蒸发仪
流体加热锅温度60-80℃与旋转速度
80-100转/分的条件下进行蒸发30-40min，待最终蒸馏物体积达到10-15ml时即得到所述的烟用生物香料。
[0035] 优选地，在160-240ml经米曲霉CICC40186菌种处理的无菌体培养液中添加0.8-1.2g葡萄糖。
[0036] 优选地，东方伊萨酵母菌CICC31431种子培养液的接种量是以经米曲霉CICC40186菌种处理的无菌体培养液体积计2-3%。
[0037] 东方伊萨酵母菌CICC31431菌种在其基本培养基中在温度26-28℃与转速140-160rpm的条件下培养150～160h。
[0038] 本发明使用的搅拌回流装置是
本技术领域的技术人员熟知的设备。
[0039] 旋转蒸发仪的基本原理是减压蒸馏，蒸馏烧瓶是一个带有标准磨口
接口的梨形或圆底烧瓶，通过蛇形回流冷凝管与减压
泵相连，回流冷凝管另一开口与带有磨口的接收烧瓶相连，用于接收被蒸发的
有机溶剂。本发明使用的旋转蒸发仪是目前市场上销售的产品，例如西安安泰仪器科技有限公司、北京瑞成伟业仪器设备有限公司生产的产品。
[0040] 本发明还涉及采用上述方法得到的烟用生物香料在
烟草制品中的用途。
[0041] 在该烟草制品中该烟用生物香料的含量是以该烟草制品总重量计0.05-0.15％。
[0042] 根据中华人民共和国烟草专卖法的规定，所述的烟草制品是卷烟、
雪茄烟、烟丝或复烤烟叶。
[0043] 可以依照常规加香工艺程序喷洒在烟丝或涂布在烟草薄片上，然后在恒温恒湿箱中平衡48小时，再打烟或切丝打烟制成
烟支，最后进行感官评吸鉴定。
[0044] 所述的感官评吸鉴定方法是由本公司即华宝香精香料公司的五位烟用调香师组成评定小组，采用暗评方法，按照本公司建立的香气质、量、谐调、杂气、刺激、劲头和余味六项指标等级标准进行质量评定，以便比较现有香精与本发明烟用生物香料对烟草制品品质的影响。
[0045] [有益效果]
[0046] 采用本发明方法得到的烟用生物香料，按照以该烟草制品总重量计0.05-0.15％添加到烟草制品中，能使烟气细柔，香气质良好，香气细腻柔和，透发厚实，带有特殊的焦甜香和酒香，使卷烟杂气感明显减轻，因此，本发明的烟用生物香料具有明显的应用价值，可以明显降低烟叶蛋白质处理成本，提高烟草提取物和低次烟末的利用率和应用价值。【
附图说明】
[0047] 图1为本发明的方法流程示意图。【具体实施方式】
[0049] 该实施例烟用生物香料制备步骤如下：
[0050] A、制备米曲霉CICC40186菌种基本培养液：将2g胰蛋白胨、1.0g酵母提取物、2g氯化钠和0.2g氯化钙溶于200ml水中得到一种溶液，然后用2N氢氧化钠水溶液将其溶液调节至pH7.0，得到米曲霉CICC40186菌种基本培养液；然后
[0051] 将米曲霉CICC40186菌种按照以其基本培养液体积计2%接种量接入在米曲霉CICC40186菌种基本培养液中，在恒温摇床中在温度28℃与转速150rpm的条件下培养24h，得到米曲霉CICC40186种子培养液；
[0052] B、将15g低次烟末、1.0g葡萄糖和0.02g氯化钙溶于200ml水中，自然pH，得到一种烟末培养液；再按照以其烟末培养液体积计2%接种量接入4ml米曲霉CICC40186种子培养液；在恒温摇床中在温度28℃与转速150rpm的条件下培养24h；从其培养物中分离烟末，该烟末用去离子水洗涤，再在微波功率900w的条件下进行微波灭菌4min；同时，其培养物在5000rpm的条件下离心分离其菌体，得到的澄清菌液再加到灭菌的烟末中，得到一种经米曲霉CICC40186菌种处理的无菌体培养液；
[0053] C、制备东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液：将浓度10%豆芽汁培养基和10g葡萄糖溶于200ml水中，自然pH，得到一种东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液；
[0054] 然后，在东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液中按照以其基本培养液体积计2%接种量接入东方伊萨酵母菌CICC31431菌种，在恒温摇床中在温度28℃与转速150rpm的条件下培养24h，得到东方伊萨酵母菌CICC31431种子培养液；
[0055] D、往200ml在步骤C得到的经米曲霉CICC40186菌种处理的无菌体培养液中添加1.0g葡萄糖，混匀后再按照以其培养液体积计2%接种量往其中接入东方伊萨酵母菌CICC31431种子培养液，在恒温摇床中在温度28℃与转速150rpm的条件下培养144h，得到的培养发酵液在搅拌回流装置加热锅温度70℃与旋转速度160转/分的条件下进行蒸发60min，然后在旋转蒸发仪流体加热锅温度70℃与旋转速度90转/分的条件下进行蒸发
40min，待最终蒸馏物体积达到10ml时即得到所述的烟用生物香料。
[0056] 采用本
说明书描述的方法进行感官评吸鉴定，其结果列于表1。
[0057] 表1：使用本发明烟用生物香料的感官评吸效果
[0058]
[0059]
[0060] 实施例2：本发明烟用生物香料的制备
[0061] 该实施例烟用生物香料制备步骤如下：
[0062] A、制备米曲霉CICC40186菌种基本培养液：将2g胰蛋白胨、1.0g酵母提取物、2g氯化钠和0.2g氯化钙溶于200ml水中得到一种溶液，然后用2N氢氧化钠水溶液将其溶液调节至pH7.0，得到米曲霉CICC40186菌种基本培养液；然后
[0063] 将米曲霉CICC40186菌种按照以其基本培养液体积计2%接种量接入在米曲霉CICC40186菌种基本培养液中，在恒温摇床中在温度28℃与转速150rpm的条件下培养36h，得到米曲霉CICC40186种子培养液；
[0064] B、将10g低次烟末、1.0g葡萄糖和0.02g氯化钙溶于200ml水中，自然pH，得到一种烟末培养液；再按照以其烟末培养液体积计2%接种量接入4ml米曲霉CICC40186种子培养液；在恒温摇床中在温度28℃与转速150rpm的条件下培养48h；从其培养物中分离烟末，该烟末用去离子水洗涤，再在微波功率1100w的条件下进行微波灭菌3min；同时，其培养物在5000rpm的条件下离心分离其菌体，得到的澄清菌液再加到灭菌的烟末中，得到一种经米曲霉CICC40186菌种处理的无菌体培养液；
[0065] C、制备东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液：将浓度12%豆芽汁培养基和8g葡萄糖溶于200ml水中，自然pH，得到一种东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液；
[0066] 然后，在东方伊萨酵母菌CICC31431菌种基本培养液中按照以其基本培养液体积计3%接种量接入东方伊萨酵母菌CICC31431菌种，在恒温摇床中在温度28℃与转速150rpm的条件下培养36h，得到东方伊萨酵母菌CICC31431种子培养液；
[0067] D、往200ml在步骤C得到的经米曲霉CICC40186菌种处理的无菌体培养液中添加1.0g葡萄糖，混匀后再按照以其培养液体积计2%接种量往其中接入东方伊萨酵母菌CICC31431种子培养液，在恒温摇床中在温度28℃与转速150rpm的条件下培养168h，得到的培养发酵液在搅拌回流装置加热锅温度80℃与旋转速度180转/分的条件下进行蒸发40min，然后在旋转蒸发仪流体加热锅温度80℃与旋转速度100转/分的条件下进行蒸发
30min，待最终蒸馏物体积达到10ml时即得到所述的烟用生物香料。
[0068] 采用本说明书描述的方法进行感官评吸鉴定，其结果列于表2。
[0069] 表2：使用本发明烟用生物香料的感官评吸效果
[0070]
