汀肝素钠的制备方法
阅读：827发布：2020-05-08
专利汇可以提供汀肝素钠的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，特别涉及汀肝素钠的制备方法。本发明采用重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I降解肝素，重组肝素酶I是通过肝素酶基因重组表达于大肠杆菌，经 发酵 诱导、均质 破碎 制得肝素酶I，其生产成本极低，生产1ml肝素酶I仅需4.3元，而降解1Kg肝素仅需130ml肝素酶I，具有巨大的工业价值；使用 乙醇 分级沉淀的方式去除降解产生的杂质小分子及游离 硫酸 根离子，与使用 超滤 膜相比，大幅度降低生产成本；另一方面使用未经纯化的肝素酶I直接降解肝素，通过后续煮沸、过滤的方法制备汀肝素钠，极大的降低了生产成本。，下面是汀肝素钠的制备方法专利的具体信息内容。
1.汀肝素钠的制备方法，其特征在于，以肝素为底物，在溶剂中经肝素酶I酶解，制得汀肝素钠；
所述肝素与所述肝素酶I的重量比为1:(0.1～1.0)；所述肝素酶I的酶活不低于60IU/mg；
所述肝素酶I的制备方法为：将肝素酶基因重组表达于大肠杆菌，经发酵诱导、均质破碎、复性制得肝素酶I；不包括纯化的步骤。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝素酶基因来源于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum，ATCC 13125)；
所述发酵诱导包括如下步骤：
步骤1、取所述肝素黄杆菌划线于LB固体培养基，倒放置于37℃恒温箱培养15～17小时；挑取单个单克隆菌体，接种于含卡那霉素Kana(终浓度50ug/ml)的液体LB培养基中，37℃摇床，220rpm，培养15～17小时；
步骤2、取步骤1获得的种子液接种于含Kana浓度为50ug/ml的发酵培养基，于37℃，
220rpm，培养2～5小时，当检测培养基A600值为1.0～2.0时，加入浓度为0.1mol/L的IPTG溶液，使得IPTG溶液终浓度为0.1×10-4mol/L，37℃，220rpm培养20～24小时；
步骤3、取步骤2的培养液离心，收集菌泥，洗涤，经缓冲液复溶，在0℃，频率50Hz，工作压力为800Bar的条件下均质破碎，经复性液复性。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述复性液包括：盐酸胍、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠的混合溶液，比例为1～100:1～50：1:1～50。
4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为含0.1mol/L氯化钠和0.002mol/L氯化钙的水溶液。
5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述肝素的初始浓度为1～
100g/L。
6.如权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的温度为4～20℃，pH值为7.0～9.0，所述酶解的时间为10～30小时。
7.如权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的终止为：调节pH值至中性，将酶解液煮沸至少5分钟。
8.如权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶解后还包括纯化的步骤；所述纯化包括取酶解液过滤，收集滤液与氯化钠混合，于温度为5～35℃，再取料液与乙醇混合，于0～30℃静置3～10小时，收集沉淀，制得汀肝素钠。
9.如权利要求1至8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述肝素的初始浓度为50g/L；和/或
所述肝素与所述肝素酶I的重量比为1:(0.2～0.5)；和/或
所述酶解的温度为6～12℃，所述酶解的时间为10～20小时；
和/或
所述酶解的终止为：调节pH值至6.5，将酶解液煮沸15分钟。
10.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，氯化钠与所述滤液的质量体积比为(0.5～4.5):100；
所述料液与乙醇的体积比为1:(0.5～3.0)。
汀肝素钠的制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 汀肝素钠(亭扎肝素钠)英文名：Tinzaparin sodium，是又一新低分子量肝素，由LEO Pharma(利奥制药公司)开发，并已于1996年6月上市，注射剂商品名Innohep。主要用于预防外科手术后深部静脉血栓形成，预防血液透析和体外循环时静脉血栓的形成，治疗伴有或没有肺栓塞症状的深度静脉血栓。
[0003] 汀肝素钠(为非无菌原料药)，是一种低分子肝素钠，是从猪肠黏膜中提取的肝素经黄杆菌属肝素酶解聚而得。肝素酶专属切断肝素糖链上D-葡萄糖胺和O-硫酸艾杜糖醛酸之间的1,4-糖苷键，通过β-消除反应得到非还原端2-O-硫酸基-4-烯吡喃糖醛酸结构、还原端2-N,6-O-硫酸基-D-葡萄糖胺的结构。重均分子量为5500～7500D，具有分子量为6500D的性质。
[0004] 与化学降解法相比，酶降解法制备LMWH具有反应条件温和、酶切位点清楚、不改变肝素结构以及不引入异物等特点。因此，提供酶降解法制备汀肝素钠具有重要的现实意义。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明提供一种汀肝素钠的制备方法。该方法使用重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I降解肝素，操作简单，节约成本。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了汀肝素钠的制备方法，以肝素为底物，在溶剂中经肝素酶I酶解，制得汀肝素钠；
[0008] 所述肝素与所述肝素酶I的重量比为1:(0.1～1.0)；所述肝素酶I的酶活不低于60IU/mg；
[0010] 在本发明的一些具体实施方案中，所述肝素酶基因来源于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum，ATCC 13125)；
[0011] 所述发酵诱导包括如下步骤：
[0012] 步骤1、取所述肝素黄杆菌划线于LB固体培养基，倒放置于37℃恒温箱培养15～17小时；挑取单个单克隆菌体，接种于含卡那霉素Kana(终浓度50ug/ml)的液体LB培养基中，37℃摇床，220rpm，培养15～17小时；
[0013] 步骤2、取步骤1获得的种子液接种于含Kana浓度为50ug/ml的发酵培养基，于37℃，220rpm，培养2～5小时，当检测培养基A600值为1.0～2.0时，加入浓度为0.1mol/L的-4IPTG溶液，使得IPTG溶液终浓度为0.1×10 mol/L，37℃，220rpm培养20～24小时；
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，所述肝素的初始浓度为1～100g/L。
[0018] 在本发明的一些具体实施方案中，所述酶解的温度为4～20℃，pH值为7.0～9.0，所述酶解的时间为10～30小时。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，所述酶解的终止为：调节pH值至6.5，将酶解液煮沸至少5分钟。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述酶解后还包括纯化的步骤；所述纯化包括取酶解液过滤，收集滤液与氯化钠混合，于温度为5～35℃，再取料液与乙醇混合，于0～30℃静置3～10小时，收集沉淀，制得汀肝素钠。
[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，所述肝素的初始浓度为50g/L；和/或[0022] 所述肝素与所述肝素酶I的重量比为1:(0.2～0.5)；和/或
[0023] 所述酶解的温度为6～12℃，所述酶解的时间为10～20小时；
[0024] 和/或
[0025] 所述酶解的终止为：调节pH值至6.5，将酶解液煮沸15分钟。
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，氯化钠与所述滤液的质量体积比为(0.5～4.5):100；所述料液与乙醇的体积比为1:(0.5～3.0)。
[0027] 本发明采用重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I降解肝素，重组肝素酶I是通过肝素酶基因重组表达于大肠杆菌，经发酵诱导、均质破碎制得肝素酶I，其生产成本极低，生产1ml肝素酶I仅需4.3元，而降解1Kg肝素仅需130ml肝素酶I，具有巨大的工业价值；使用乙醇分级沉淀的方式去除降解产生的杂质小分子及游离硫酸根离子，与使用超滤膜相比，大幅度降低生产成本；另一方面使用未经纯化的肝素酶I直接降解肝素，通过后续煮沸、过滤的方法制备汀肝素钠，极大的降低了生产成本。附图说明
[0029] 图1示重组肝素酶I生产流程图；
[0030] 图2示汀肝素钠生产工艺流程图；
[0031] 图3示汀肝素钠原研药13C-NMR谱图；
[0032] 图4示本发明实施例2记载的方法制备的汀肝素钠13C-NMR谱图；
[0033] 图5示汀肝素钠原研药CTA-SAX谱图；
[0034] 图6示本发明实施例2记载的方法制备的汀肝素钠CTA-SAX谱图。
具体实施方式
[0035] 本发明公开了一种汀肝素钠的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0036] 本发明所提供的汀肝素钠制备工艺，是以肝素为底物，以重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I降解肝素钠，得到汀肝素钠。
[0037] 所述方法中，所述重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I是将来源自肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum，ATCC 13125)的肝素酶基因重组表达于大肠杆菌，通过发酵诱导、均质破碎最终生产出肝素酶I。
[0038] 所述方法中，所述重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I是经复性液进行复性形成的活性蛋白。所述复性液的组分包括：盐酸胍、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷和氯化钠的混合溶液。
[0039] 所述方法中，所述重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I降解肝素钠的反应是在可溶解肝素的溶剂中进行；所述可溶解肝素的溶剂为含0.1mol/L氯化钠和0.002mol/L氯化钙的水溶液。
[0040] 所述方法中，所述的肝素钠溶液的初始浓度为1～100g/L，在一些实施例中，所述的肝素钠溶液的初始浓度为50g/L；所述肝素酶I的用量为肝素重量的0.1倍～1.0倍，在一些实施例中，所述肝素酶I的用量为肝素重量的0.2～0.5倍。
[0041] 所述方法中，反应温度为4～20℃，优选6～12℃；所述肝素酶I降解肝素钠的反应pH为7.0～9.0。
[0042] 所述方法中，还包括控制肝素酶I降解肝素钠过程中的反应时间为10～30小时。在一些实施例中，肝素酶I降解肝素钠过程中的反应时间为10～20小时。
[0043] 所述方法中，所述终止反应的方法为调节料液pH为中性，将降解液煮沸，沸腾至少5分钟，在一些实施例中，15分钟。
[0044] 所述方法中，还包括将肝素酶I降解肝素钠的产物进行纯化；所述纯化步骤是将终止反应后的反应液过滤除去蛋白，然后加入料液体积0.5％～4.5％的氯化钠，控制料液温度5～35℃，加入料液体积0.5～3.0倍量的乙醇，缓慢搅拌30分钟，放置不高于30℃的环境中静置3～10小时，收集沉淀物即得汀肝素钠。
[0045] 本发明采用重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I降解肝素，重组肝素酶I是通过肝素酶基因重组表达于大肠杆菌，经发酵诱导、均质破碎制得肝素酶I，其生产成本极低，生产1ml肝素酶I仅需4.3元，而降解1Kg肝素仅需130ml肝素酶I，具有巨大的工业价值；另一方面使用未经纯化的肝素酶I直接降解肝素，通过后续煮沸、过滤的方法制备汀肝素钠，极大的降低了生产成本。
[0046] 本发明使用重组肝素黄杆菌株生产的重组肝素酶I降解肝素，降解过程中通过控制反应时间终止反应，无需进行检测，操作简单，节约成本；另一方面使用乙醇分级沉淀的方式去除降解产生的杂质小分子及游离硫酸根离子，与使用超滤膜相比，大幅度降低生产成本。
[0047] 本发明提供的汀肝素钠的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0048] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0049] 实施例1重组肝素酶I的制备
[0050] (1)发酵种子制备
[0051] 将保存于-80℃的重组肝素黄杆菌株(Flavobacterium heparinum，ATCC 13125)划线于LB固体培养基上，将划线后的固体培养基平板盖好，倒放置于37℃恒温箱培养15小时，待固体培养基上均匀长出多个单个菌斑，菌斑直径在1mm左右时，将培养皿取出，挑取单个单克隆菌体，接种于含卡那霉素Kana(终浓度50ug/ml)的液体LB培养基中，37℃摇床，220rpm，培养17小时。
[0052] (2)大肠杆菌发酵培养
[0053] 将过夜培养完毕的种子液以1/50体积加入发酵培养基(含Kana浓度50ug/ml)，加入完毕在37℃摇床，220rpm，继续培养2.5小时，当检测培养基A600值为1.5时，取出摇瓶加入IPTG溶液(0.1mol/L)，使IPTG溶液终浓度为0.1×10-4mol/L。继续37℃摇床，220rpm培养24小时。
[0054] (3)大肠杆菌体离心收集
[0055] 培养液在温度4℃、转速8000rpm离心。离心完毕，取出菌泥，缓冲液将菌泥复溶，4000rpm离心10min，重复此操作2次。离心洗涤完毕，称量菌体净湿重并记录。
[0056] (4)大肠杆菌均质破碎
[0057] 将收集的湿菌体用4℃缓冲液(Tris与NaCl比例为1:3)混悬复溶至40％体积浓度，在高压均质机中进行连续破碎两遍(温度0℃，频率50Hz，工作压力800Bar)。
[0058] (5)肝素酶I复性
[0059] 将破碎后的肝素酶I溶液使用复性液(比例为50:25:1:25)进行复性。
[0060] (6)肝素酶I活力
[0061] 检测肝素酶I含量8μg/μl，活力80IU/mg。
[0062] 实施例2汀肝素钠的制备
[0063] (1)以东营天东制药有限公司生产的肝素钠为原料，将肝素钠加入到0.1mol/L氯化钠和0.002mol/L氯化钙的水溶液中使其浓度为50g/L，调节溶液的pH为8.0。
[0064] (2)控制肝素钠溶液温度6℃；加入肝素钠重量0.30倍(W/V)的实施例1制得的肝素酶I。
[0065] (3)反应15小时，调pH为中性，加热煮沸15分钟，过滤。
[0066] (4)加入料液体积2％的氯化钠，控制料液温度20℃，加入料液体积2倍量的乙醇，缓慢搅拌30分钟，放置20℃的环境中静置6小时，收集沉淀物即得汀肝素钠。
[0067] 实施例3汀肝素钠的制备
[0068] 1、重组肝素酶I的制备
[0069] (1)发酵种子制备
[0070] 将保存于-80℃的重组肝素黄杆菌株(Flavobacteriumheparinum，ATCC13125)划线于LB固体培养基上，将划线后的固体培养基平板盖好，倒放置于37℃恒温箱培养15小时，待固体培养基上均匀长出多个单个菌斑，菌斑直径在1mm左右时，将培养皿取出，挑取单个单克隆菌体，接种于含卡那霉素Kana(终浓度50ug/ml)的液体LB培养基中，37℃摇床，220rpm，培养15小时。
[0071] (2)大肠杆菌发酵培养
[0072] 将过夜培养完毕的种子液以1/50体积加入发酵培养基(含Kana浓度50ug/ml)，加入完毕在37℃摇床，220rpm，继续培养2小时，当检测培养基A600值为1.0时，取出摇瓶加入IPTG溶液(0.1mol/L)，使IPTG溶液终浓度为0.1×10-4mol/L。继续37℃摇床，220rpm培养20小时。
[0073] (3)大肠杆菌体离心收集
[0074] 培养液在温度4℃、转速8000rpm离心。离心完毕，取出菌泥，缓冲液将菌泥复溶，4000rpm离心10min，重复此操作2次。离心洗涤完毕，称量菌体净湿重并记录。
[0075] (4)大肠杆菌均质破碎
[0076] 将收集的湿菌体用4℃缓冲液(Tris与NaCl比例为1:3)混悬复溶至40％体积浓度，在高压均质机中进行连续破碎两遍(温度0℃，频率50Hz，工作压力800Bar)。
[0077] (5)肝素酶I复性
[0078] 将破碎后的肝素酶I溶液使用复性液(比例为50:25:1:25)进行复性。
[0079] (6)肝素酶I活力
[0080] 检测肝素酶I含量为6μg/μl，活力为70IU/mg。
[0081] 2、汀肝素钠的制备
[0082] (1)以东营天东制药有限公司生产的肝素钠为原料，将肝素钠加入到0.1mol/L氯化钠和0.002mol/L氯化钙的水溶液中使其浓度为1g/L，调节溶液的pH为7.0。
[0083] (2)控制肝素钠溶液温度4℃；加入肝素钠重量0.1倍(W/V)的肝素酶I。
[0084] (3)反应30小时，调pH为中性，加热煮沸5分钟，过滤。
[0085] (4)加入料液体积0.5％的氯化钠，控制料液温度35℃，加入料液体积3.0倍量的乙醇，缓慢搅拌30分钟，放置15℃的环境中静置3小时，收集沉淀物即得汀肝素钠。
[0086] 实施例4汀肝素钠的制备
[0087] 1、重组肝素酶I的制备
[0088] (1)发酵种子制备
[0089] 将保存于-80℃的重组肝素黄杆菌株(Flavobacterium heparinum，ATCC 13125)划线于LB固体培养基上，将划线后的固体培养基平板盖好，倒放置于37℃恒温箱培养17小时，待固体培养基上均匀长出多个单个菌斑，菌斑直径在1mm左右时，将培养皿取出，挑取单个单克隆菌体，接种于含卡那霉素Kana(终浓度50ug/ml)的液体LB培养基中，37℃摇床，220rpm，培养17小时。
[0090] (2)大肠杆菌发酵培养
[0091] 将过夜培养完毕的种子液以1/50体积加入发酵培养基(含Kana浓度50ug/ml)，加入完毕在37℃摇床，220rpm，继续培养5小时，当检测培养基A600值为2.0时，取出摇瓶加入-4IPTG溶液(0.1mol/L)，使IPTG溶液终浓度为0.1×10 mol/L。继续37℃摇床，220rpm培养24小时。
[0092] (3)大肠杆菌体离心收集
[0093] 培养液在温度4℃、转速8000rpm离心。离心完毕，取出菌泥，缓冲液将菌泥复溶，4000rpm离心10min，重复此操作2次。离心洗涤完毕，称量菌体净湿重并记录。
[0094] (4)大肠杆菌均质破碎
[0095] 将收集的湿菌体用4℃缓冲液(Tris与NaCl比例为1:3)混悬复溶至40％体积浓度，在高压均质机中进行连续破碎两遍(温度0℃，频率50Hz，工作压力800Bar)。
[0096] (5)肝素酶I复性
[0097] 将破碎后的肝素酶I溶液使用复性液(比例为50:25:1:25)进行复性。
[0098] (6)肝素酶I活力
[0099] 检测肝素酶I含量为9μg/μl，活力为96IU/mg。
[0100] 2、汀肝素钠的制备
[0101] (1)以东营天东制药有限公司生产的肝素钠为原料，将肝素钠加入到0.1mol/L氯化钠和0.002mol/L氯化钙的水溶液中使其浓度为100g/L，调节溶液的pH为9.0。
[0102] (2)控制肝素钠溶液温度20℃；加入肝素钠重量1.0倍(W/V)的肝素酶I。
[0103] (3)反应10小时，调pH为中性，加热煮沸10分钟，过滤。
[0104] (4)加入料液体积4.5％的氯化钠，控制料液温度5℃，加入料液体积0.5倍量的乙醇，缓慢搅拌30分钟，放置0℃的环境中静置10小时，收集沉淀物即得汀肝素钠。
[0105] 实施例5汀肝素钠的制备
[0106] 1、重组肝素酶I的制备
[0107] (1)发酵种子制备
[0108] 将保存于-80℃的重组肝素黄杆菌株(Flavobacterium heparinum，ATCC 13125)划线于LB固体培养基上，将划线后的固体培养基平板盖好，倒放置于37℃恒温箱培养16小时，待固体培养基上均匀长出多个单个菌斑，菌斑直径在1mm左右时，将培养皿取出，挑取单个单克隆菌体，接种于含卡那霉素Kana(终浓度50ug/ml)的液体LB培养基中，37℃摇床，220rpm，培养16小时。
[0109] (2)大肠杆菌发酵培养
[0110] 将过夜培养完毕的种子液以1/50体积加入发酵培养基(含Kana浓度50ug/ml)，加入完毕在37℃摇床，220rpm，继续培养3小时，当检测培养基A600值为1.5时，取出摇瓶加入IPTG溶液(0.1mol/L)，使IPTG溶液终浓度为0.1×10-4mol/L。继续37℃摇床，220rpm培养22小时。
[0111] (3)大肠杆菌体离心收集
[0112] 培养液在温度4℃、转速8000rpm离心。离心完毕，取出菌泥，缓冲液将菌泥复溶，4000rpm离心10min，重复此操作2次。离心洗涤完毕，称量菌体净湿重并记录。
[0113] (4)大肠杆菌均质破碎
[0114] 将收集的湿菌体用4℃缓冲液(Tris与NaCl比例为1:3)混悬复溶至40％体积浓度，在高压均质机中进行连续破碎两遍(温度0℃，频率50Hz，工作压力800Bar)。
[0115] (5)肝素酶I复性
[0116] 将破碎后的肝素酶I溶液使用复性液(比例为50:25:1:25)进行复性。
[0117] (6)肝素酶I活力
[0118] 检测肝素酶I含量为8μg/μl，活力为89IU/mg。
[0119] 2、汀肝素钠的制备
[0120] (1)以东营天东制药有限公司生产的肝素钠为原料，将肝素钠加入到0.1mol/L氯化钠和0.002mol/L氯化钙的水溶液中使其浓度为20g/L，调节溶液的pH为8.0。
[0121] (2)控制肝素钠溶液温度6℃；加入肝素钠重量0.2倍(W/V)的肝素酶I。
[0122] (3)反应20小时，调pH为中性，加热煮沸25分钟，过滤。
[0123] (4)加入料液体积1.0％的氯化钠，控制料液温度10℃，加入料液体积1.0倍量的乙醇，缓慢搅拌30分钟，放置20℃的环境中静置5小时，收集沉淀物即得汀肝素钠。
[0124] 实施例6汀肝素钠的制备
[0125] 1、重组肝素酶I的制备
[0126] (1)发酵种子制备
[0127] 将保存于-80℃的重组肝素黄杆菌株(Flavobacterium heparinum，ATCC 13125)划线于LB固体培养基上，将划线后的固体培养基平板盖好，倒放置于37℃恒温箱培养16小时，待固体培养基上均匀长出多个单个菌斑，菌斑直径在1mm左右时，将培养皿取出，挑取单个单克隆菌体，接种于含卡那霉素Kana(终浓度50ug/ml)的液体LB培养基中，37℃摇床，220rpm，培养16小时。
[0128] (2)大肠杆菌发酵培养
[0129] 将过夜培养完毕的种子液以1/50体积加入发酵培养基(含Kana浓度50ug/ml)，加入完毕在37℃摇床，220rpm，继续培养4小时，当检测培养基A600值为1.8时，取出摇瓶加入IPTG溶液(0.1mol/L)，使IPTG溶液终浓度为0.1×10-4mol/L。继续37℃摇床，220rpm培养21小时。
[0130] (3)大肠杆菌体离心收集
[0131] 培养液在温度4℃、转速8000rpm离心。离心完毕，取出菌泥，缓冲液将菌泥复溶，4000rpm离心10min，重复此操作2次。离心洗涤完毕，称量菌体净湿重并记录。
[0132] (4)大肠杆菌均质破碎
[0133] 将收集的湿菌体用4℃缓冲液(Tris与NaCl比例为1:3)混悬复溶至40％体积浓度，在高压均质机中进行连续破碎两遍(温度0℃，频率50Hz，工作压力800Bar)。
[0134] (5)肝素酶I复性
[0135] 将破碎后的肝素酶I溶液使用复性液(比例为50:25:1:25)进行复性。
[0136] (6)肝素酶I活力
[0137] 检测肝素酶I含量为9μg/μl，活力为92IU/mg。
[0138] 2、汀肝素钠的制备
[0139] (1)以东营天东制药有限公司生产的肝素钠为原料，将肝素钠加入到0.1mol/L氯化钠和0.002mol/L氯化钙的水溶液中使其浓度为50g/L，调节溶液的pH为8.5。
[0140] (2)控制肝素钠溶液温度12℃；加入肝素钠重量0.5倍(W/V)的肝素酶I。
[0141] (3)反应15小时，调pH为中性，加热煮沸15分钟，过滤。
[0142] (4)加入料液体积3.0％的氯化钠，控制料液温度25℃，加入料液体积2.5倍量的乙醇，缓慢搅拌30分钟，放置10℃的环境中静置8小时，收集沉淀物即得汀肝素钠。
[0143] 效果例1
[0144] 实施例2～6制得的汀肝素钠符合欧洲药典质量要求的汀肝素钠(检测结果见表1)，且与汀肝素钠原研药具有一致性，见图3～图6。
[0145] 表1汀肝素钠质量信息
[0146]
[0147]
[0148]
[0149] 对比例1汀肝素钠的制备
[0150] 使用商业化的肝素酶I(10IU/ml)按照实例5汀肝素钠的制备工艺参数进行汀肝素钠的制备。
[0151] 效果例2
[0152] 将实施例2～6制备汀肝素钠与对比例1制得的汀肝素钠进行比较，结果见表2。
[0153] 表2
[0154]
[0155]
[0156] 实施例2～6制备汀肝素钠与对比例1制得的汀肝素钠所用肝素酶I信息比较可明显看出，本发明所用的肝素酶I降解1kg肝素钠的成本远低于其他肝素酶I的成本，具有更高的应用价值。
[0157] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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