用于蛋白质免疫印迹封闭的蛋白粉制备与封闭方法
专利汇可以提供用于蛋白质免疫印迹封闭的蛋白粉制备与封闭方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 是一种用于 蛋白质 免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，该方法用PBS缓冲液溶解海鱼鱼皮明胶制成鱼皮明胶溶液，用 牛 胰蛋白酶和凝血酶冻干粉混合酶溶液酶解， 超滤 ，富集，干燥得到鱼明胶蛋白。本发明还公开了蛋白质免疫印迹封闭方法。本发明有效解决了在蛋白质免疫印迹实验中转印膜的封闭效果不佳、曝光的背景高、非特异性条带检出等常见的问题。采用本发明中用于蛋白质免疫印迹实验的封闭剂， 抗体 孵育后经ECL底物检测可以得到特异性蛋白检出带且背景干净无杂带，同时也缩短孵育时间至15min，为获得准确、高效的实验结果提供技术 基础 。，下面是用于蛋白质免疫印迹封闭的蛋白粉制备与封闭方法专利的具体信息内容。
1.一种用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）用PBS缓冲液溶解海鱼鱼皮明胶，配制成质量浓度为10%-50%的鱼皮明胶溶液；
（2）将牛胰蛋白酶、凝血酶冻干粉，按重量比为1:10至10:1的配比，用灭菌纯化水配制成1mg/mL的混合酶溶液，备用；
（3）将配制好的鱼明胶溶液恒温至37℃，50-100rpm搅拌；
（4）缓慢加入适量配制好的混合酶溶液，37℃保温反应6h；
（5）升温至60℃，保温30min，使酶失活，结束酶解反应；
（6）用两级超滤膜系统处理反应液，一级膜使小分子蛋白透过，为水解的明胶与适活的酶富集后处理；蛋白经二级膜浓缩，富集至蛋白浓度为50%；
（7）喷雾干燥，得到鱼明胶蛋白。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤（1）中：鱼皮明胶溶液的质量浓度为15%-25%。
3.根据权利要求1所述的用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤（2）中：将牛胰蛋白酶、凝血酶冻干粉，按重量比为2-5:1的比例配成混合酶溶液。
4.一种蛋白质免疫印迹封闭方法，其特征在于，该方法使用权利要求1或2或3所制得的鱼明胶蛋白粉作封闭液原料，其具体步骤如下：
（1）蛋白样本的提取：取新鲜培养的A549细胞，去除培养液，用PBS洗涤细胞；按照6孔板每孔加入200μl RIPA细胞裂解液，含终浓度为1mM PMSF，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触并裂解细胞；裂解后的细胞样本置于14,000g下离心5min，取上清液分装到PCR管中，置于-80℃备用；
（2）蛋白定量和上样前处理：取步骤（1）制备的蛋白提取物采用BCA法测定蛋白浓度；向已测定的蛋白浓度的样本中加入质量体积比5倍的蛋白上样缓冲液，充分混匀置于95℃金属浴中变性10min，瞬离置于-80℃备用；
（3）凝胶制备：根据蛋白的分子量大小，配制10%的SDS-PAGE分离胶和5%的SDS-PAGE浓缩胶，在加入TEMED后立即灌胶；
（4）灌胶：将干净的玻璃板固定好，然后加入预先配制好的分离胶，并加无水乙醇封除去气泡；待胶凝固后，用滤纸吸干玻璃板中无水乙醇，然后加入浓缩胶并插入梳子，待胶再次凝固后轻轻拔出梳子；
（5）电泳：取步骤（4）制备的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，放置于电泳槽中，同时向电泳槽中加入TGS电泳缓冲液，取步骤（2）制备的浓度为2.4mg/mL的A549细胞裂解液上样10µL并开始电泳；浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为130 V，待条带到达玻璃板底部时结束电泳；
（6）转膜：将（5）完成电泳后的分离胶用于转膜；PVDF膜于甲醇中活化3min，将夹子的黑色面放入装有转移液的玻璃平皿中，从下到上依次放入一层海绵垫，三层滤纸，分离胶，PVDF膜，三层滤纸，最后盖上一层海绵垫，排掉气泡，夹紧夹子，加入预冷的转膜缓冲液，设定电流为200 mA，于冰浴中转膜100 min；
（7）封闭：将步骤（6）转好的PVDF膜裁膜处理成4张，按照以下封闭液和封闭条件进行封闭，10%鱼明胶蛋白粉封闭液，室温封闭15min；5%脱脂乳，室温封闭1h；
（8）一抗孵育：取步骤（7）封闭后的膜进行一抗孵育；一抗选择GAPDH特异性抗体，按照说明书推荐进行1:10000稀释，稀释使用一抗稀释液进行稀释，终浓度为0.1µg/mL，将封闭后的PVDF膜放入孵育盒中， 4°C孵育过夜后完成后续实验；用TBST洗5次，每次5 min；
（9）二抗孵育：取步骤（8）孵育一抗后的膜进行二抗孵育；二抗选择HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体，按照说明书推荐进行1:5000稀释，稀释使用对应的封闭缓冲液进行稀释；将膜在二抗中孵育1 h；用TBST洗5次，每次5 min；
（10）化学发光检测：将步骤（9）完成抗体孵育的膜中加入超敏ECL发光底液，待膜充分接触发光液后，将其放入凝胶成像系统中，设定不同曝光时间：1s、30s、120s，并检测。
5.根据权利要求4所述的一种蛋白质免疫印迹封闭方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的蛋白裂解液各成分终浓度如下：150 mmoL/L NaCl，1.0%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，50 mmoL/L Tris（pH8.0)，室温存贮，使用前60℃水浴溶解。
6.根据权利要求4所述的一种蛋白质免疫印迹封闭方法，其特征在于，所述的PMSF溶液的制备如下：将PMSF溶解于异丙醇中至终浓度达10mM，溶解后分装储存于-20℃中。
7. 根据权利要求4所述的一种蛋白质免疫印迹封闭方法，其特征在于，所述的蛋白上样缓冲液制备如下：50% 甘油，250mM Tris·Cl (pH6.8)，10% β-巯基乙醇，1‰溴酚蓝，10%的SDS。
8.根据权利要求4所述的蛋白质免疫印迹封闭方法，其特征在于，所述的5%的SDS-PAGE浓缩胶制备如下：配置9ml需要6mlH2O、1.5ml 30%丙烯酰胺（29：1）、1.5ml 1M TRIS－HCl (pH 6.8)、120μl 10%SDS、90μl 10%AP、12μl TEMED；
所述的10%SDS-PAGE分离胶制备如下：配置15ml需要5.9mlH2O、5ml 30%丙烯酰胺（29：
1）、3.8ml 1.5M TRIS－HCl (pH 8.8)、150μl 10%SDS、150μl 10%AP、7.5μl TEMED。
9.根据权利要求4所述的蛋白质免疫印迹封闭方法，其特征在于：所述的TGS电泳缓冲液制备如下：配置1L TGS蛋白电泳缓冲液需要Tris-base 3g, glycine 14.4g, 0.1% SDS（10ml 10% SDS）；
所述的转膜缓冲液制备如下：配置1L转膜缓冲液需要 Tris-base 3g, glycine
14.4g, 200ml 甲醇；
所述的TBST制备如下：25mM Tris、0.15mM NaCl、0.05% Tween-20, pH7.5；所述的5%脱脂乳制备如下：配置100mL 5%脱脂乳需要脱脂乳5g，溶解于TBST缓冲液中；
所述的一抗稀释液制备如下：配置100mL一抗稀释液需要BSA 1g，5%叠氮钠1mL，溶解于TBST缓冲液中。
10.根据权利要求4所述的蛋白质免疫印迹封闭方法，其特征在于，所述的10%鱼明胶蛋白液制备方法如下：每配置100mL 10%鱼明胶蛋白封闭液需要鱼明胶蛋白粉10g，溶解于TBST缓冲液中。
用于蛋白质免疫印迹封闭的蛋白粉制备与封闭方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）将牛胰蛋白酶、凝血酶冻干粉，按重量比为1:10至10:1的配比，用灭菌纯化水配制成1mg/mL的混合酶溶液，备用；
（3）将配制好的鱼明胶溶液恒温至37℃，50-100rpm搅拌；
（4）缓慢加入适量配制好的混合酶溶液，37℃保温反应6h；
（5）升温至60℃，保温30min，使酶失活，结束酶解反应；
（6）用两级超滤膜系统处理反应液，一级膜使小分子蛋白透过，为水解的明胶与适活的酶富集后处理；蛋白经二级膜浓缩，富集至蛋白浓度为50%；
（7）喷雾干燥，得到鱼明胶蛋白。
（2）蛋白定量和上样前处理：取步骤（1）制备的蛋白提取物采用BCA法测定蛋白浓度；向已测定的蛋白浓度的样本中加入质量体积比5倍的蛋白上样缓冲液，充分混匀置于95℃金属浴中变性10min，瞬离置于-80℃备用；
（3）凝胶制备：根据蛋白的分子量大小，配制10%的SDS-PAGE分离胶和5%的SDS-PAGE浓缩胶，在加入TEMED后立即灌胶；
（4）灌胶：将干净的玻璃板固定好，然后加入预先配制好的分离胶，并加无水乙醇封除去气泡；待胶凝固后，用滤纸吸干玻璃板中无水乙醇，然后加入浓缩胶并插入梳子，待胶再次凝固后轻轻拔出梳子；
（5）电泳：取步骤（4）制备的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，放置于电泳槽中，同时向电泳槽中加入TGS电泳缓冲液，取步骤（2）制备的浓度为2.4mg/mL的A549细胞裂解液上样10µL并开始电泳；浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为130 V，待条带到达玻璃板底部时结束电泳；
（6）转膜：将（5）完成电泳后的分离胶用于转膜；PVDF膜于甲醇中活化3min，将夹子的黑色面放入装有转移液的玻璃平皿中，从下到上依次放入一层海绵垫，三层滤纸，分离胶，PVDF膜，三层滤纸，最后盖上一层海绵垫，排掉气泡，夹紧夹子，加入预冷的转膜缓冲液，设定电流为200 mA，于冰浴中转膜100 min；
（7）封闭：将步骤（6）转好的PVDF膜裁膜处理成4张，按照以下封闭液和封闭条件进行封闭，10%鱼明胶蛋白粉封闭液，室温封闭15min；5%脱脂乳，室温封闭1h；
（8）一抗孵育：取步骤（7）封闭后的膜进行一抗孵育；一抗选择GAPDH特异性抗体，按照说明书推荐进行1:10000稀释，稀释使用一抗稀释液进行稀释，终浓度为0.1µg/mL，将封闭后的PVDF膜放入孵育盒中， 4°C孵育过夜后完成后续实验；用TBST洗5次，每次5 min；
（9）二抗孵育：取步骤（8）孵育一抗后的膜进行二抗孵育；二抗选择HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体，按照说明书推荐进行1:5000稀释，稀释使用对应的封闭缓冲液进行稀释；将膜在二抗中孵育1 h；用TBST洗5次，每次5 min；
（10）化学发光检测：将步骤（9）完成抗体孵育的膜中加入超敏ECL发光底液，待膜充分接触发光液后，将其放入凝胶成像系统中，设定不同曝光时间：1s、30s、120s，并检测。
所述的10%SDS-PAGE分离胶制备如下：配置15ml需要5.9mlH2O、5ml 30%丙烯酰胺（29：
1）、3.8ml 1.5M TRIS－HCl (pH 8.8)、150μl 10%SDS、150μl 10%AP、7.5μl TEMED。
所述的转膜缓冲液制备如下：配置1L转膜缓冲液需要 Tris-base 3g,glycine 14.4g,
200ml 甲醇；
所述的TBST制备如下：25mM Tris、0.15mM NaCl、0.05% Tween-20, pH7.5；所述的5%脱脂乳制备如下：配置100mL 5%脱脂乳需要脱脂乳5g，溶解于TBST缓冲液中；
所述的一抗稀释液制备如下：配置100mL一抗稀释液需要BSA 1g，5%叠氮钠1mL，溶解于TBST缓冲液中。
图3是商品化快速封闭试剂A室温封闭15min转印膜后经抗体孵育的不同曝光时间的检测结果图；
图4是商品化快速封闭试剂B室温封闭15min转印膜后经抗体孵育的不同曝光时间的检测结果图。
具体实施方式
（2）将牛胰蛋白酶、凝血酶冻干粉，按重量比为3:1的配比，用灭菌纯化水配制成1mg/mL的混合酶溶液，备用；
（3）将配制好的鱼明胶溶液恒温至37℃，80rpm搅拌；
（4）缓慢加入适量配制好的混合酶溶液，37℃保温反应6h；
（5）升温至60℃，保温30min，使酶失活，结束酶解反应；
（6）用两级超滤膜系统处理反应液，一级膜使小分子蛋白透过，为水解的明胶与适活的酶富集后处理；蛋白经二级膜浓缩，富集至蛋白浓度为50%；
（7）喷雾干燥，得到鱼明胶蛋白。
（2）将牛胰蛋白酶、凝血酶冻干粉，按重量比为2:1的配比，用灭菌纯化水配制成1mg/mL的混合酶溶液，备用；
（3）将配制好的鱼明胶溶液恒温至37℃，100rpm搅拌；
（4）缓慢加入适量配制好的混合酶溶液，37℃保温反应6h；
（5）升温至60℃，保温30min，使酶失活，结束酶解反应；
（6）用两级超滤膜系统处理反应液，一级膜使小分子蛋白透过，为水解的明胶与适活的酶富集后处理；蛋白经二级膜浓缩，富集至蛋白浓度为50%；
（7）喷雾干燥，得到鱼明胶蛋白。
（2）蛋白定量和上样前处理：取步骤（1）制备的蛋白提取物采用BCA法测定蛋白浓度；向已测定的蛋白浓度的样本中加入质量体积比5倍的蛋白上样缓冲液，充分混匀置于95℃金属浴中变性10min，瞬离置于-80℃备用；
（3）凝胶制备：根据蛋白的分子量大小，配制10%的SDS-PAGE分离胶和5%的SDS-PAGE浓缩胶，在加入TEMED后立即灌胶；
（4）灌胶：将干净的玻璃板固定好，然后加入预先配制好的分离胶，并加无水乙醇封除去气泡；待胶凝固后，用滤纸吸干玻璃板中无水乙醇，然后加入浓缩胶并插入梳子，待胶再次凝固后轻轻拔出梳子；
（5）电泳：取步骤（4）制备的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，放置于电泳槽中，同时向电泳槽中加入TGS电泳缓冲液，取步骤（2）制备的浓度为2.4mg/mL的A549细胞裂解液上样10µL并开始电泳；浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为130 V，待条带到达玻璃板底部时结束电泳；
（6）转膜：将（5）完成电泳后的分离胶用于转膜；PVDF膜于甲醇中活化3min，将夹子的黑色面放入装有转移液的玻璃平皿中，从下到上依次放入一层海绵垫，三层滤纸，分离胶，PVDF膜，三层滤纸，最后盖上一层海绵垫，排掉气泡，夹紧夹子，加入预冷的转膜缓冲液，设定电流为200 mA，于冰浴中转膜100 min；
（7）封闭：将步骤（6）转好的PVDF膜裁膜处理成4张，按照以下封闭液和封闭条件进行封闭，10%鱼明胶蛋白粉封闭液，室温封闭15min；5%脱脂乳，室温封闭1h；
（8）一抗孵育：取步骤（7）封闭后的膜进行一抗孵育；一抗选择GAPDH特异性抗体，按照说明书推荐进行1:10000稀释，稀释使用一抗稀释液进行稀释，终浓度为0.1µg/mL，将封闭后的PVDF膜放入孵育盒中， 4°C孵育过夜后完成后续实验；用TBST洗5次，每次5 min；
（9）二抗孵育：取步骤（8）孵育一抗后的膜进行二抗孵育；二抗选择HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体，按照说明书推荐进行1:5000稀释，稀释使用对应的封闭缓冲液进行稀释；将膜在二抗中孵育1 h；用TBST洗5次，每次5 min；
（10）化学发光检测：将步骤（9）完成抗体孵育的膜中加入超敏ECL发光底液，待膜充分接触发光液后，将其放入凝胶成像系统中，设定不同曝光时间：1s、30s、120s，并检测。
1）、3.8ml 1.5M TRIS－HCl (pH 8.8)、150μl 10%SDS、150μl 10%AP、7.5μl TEMED。
200ml 甲醇；
所述的TBST制备如下：25mM Tris、0.15mM NaCl、0.05% Tween-20, pH7.5；所述的5%脱脂乳制备如下：配置100mL 5%脱脂乳需要脱脂乳5g，溶解于TBST缓冲液中；
所述的一抗稀释液制备如下：配置100mL一抗稀释液需要BSA 1g，5%叠氮钠1mL，溶解于TBST缓冲液中。
（1）制备蛋白裂解液 蛋白裂解液各成分终浓度如下：150 mmoL/L NaCl，1.0%NP-40，
0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，50 mmoL/L Tris（pH8.0)，室温存贮，使用前60℃水浴溶解。
（2）蛋白定量和上样前处理：取（1）制备的蛋白提取物采用BCA法测定蛋白浓度。向已测定的蛋白浓度的样本中加入质量体积比5倍的蛋白上样缓冲液，充分混匀置于95℃金属浴中变性10min，瞬离置于-80℃备用；
（3）凝胶制备：根据蛋白的分子量大小，配制10%的SDS-PAGE分离胶和5%的SDS-PAGE浓缩胶，为防止胶凝固应在加入TEMED后立即灌胶；
（4）灌胶：将干净的玻璃板固定好，然后加入预先配制好的分离胶，并加无水乙醇封除去气泡。待胶凝固后，用滤纸吸干玻璃板中无水乙醇，然后加入浓缩胶并插入梳子，待胶再次凝固后轻轻拔出梳子；
（5）电泳：取（4）制备的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，放置于电泳槽中，同时向电泳槽中加入TGS电泳缓冲液，取（2）制备的浓度为2.4mg/mL的A549细胞裂解液上样10µL并开始电泳。浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为130 V，待条带到达玻璃板底部时结束电泳；
（6）转膜：将（5）完成电泳后的分离胶用于转膜。PVDF膜于甲醇中活化3min，将夹子的黑色面放入装有转移液的玻璃平皿中，从下到上依次放入一层海绵垫，三层滤纸，分离胶，PVDF膜，三层滤纸，最后盖上一层海绵垫，排掉气泡，夹紧夹子，加入预冷的转膜缓冲液，设定电流为200 mA，于冰浴中转膜100 min；
（7）封闭：将（6）转好的PVDF膜裁膜处理成4张，分别按照以下封闭液和封闭条件进行封闭，10%鱼明胶蛋白封闭液、商品化快速封闭试剂A、B，室温封闭15min；5%脱脂乳，室温封闭
1h；
（8）一抗孵育：取（7）封闭后的膜进行一抗孵育。一抗选择武汉三鹰鼠源的GAPDH特异性抗体，按照说明书推荐进行1:10000稀释，稀释使用一抗稀释液进行稀释，终浓度为0.1µg/mL，将封闭后的PVDF膜放入孵育盒中， 4°C孵育过夜后完成后续实验。用TBST洗5次，每次5 min；
（9）二抗孵育：取（8）孵育一抗后的膜进行二抗孵育。二抗选择武汉三鹰HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体，按照说明书推荐进行1:5000稀释，稀释使用对应的封闭缓冲液进行稀释。将膜在二抗中孵育1 h。用TBST洗5次，每次5 min；
（10）化学发光检测：将（9）完成抗体孵育的膜中加入超敏ECL发光底液，待膜充分接触发光液后，将其放入凝胶成像系统中，设定不同曝光时间：1s、30s、120s，并检测。
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