技术领域
[0001] 本
发明涉及农业、食品、医药卫生及
环境工程行业中利用宿主细胞生产各类酶制品制剂的技术领域，具体涉及一种提高宿主细胞产酶活性的方法。
背景技术
[0002] 酶作为
生物催化剂，已广泛地应用于农业、食品、医药卫生产业的各个生产领域。随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、
能源开发及环境工程等方面得到越来越广泛的应用。如
食品加工工业中常用到的
淀粉酶、乳糖酶、
纤维素酶、蛋白酶等 ；医药卫生领域用到的白介素、各类表皮生长因子、胰酶、
胶原蛋白酶 ；
饲料工业中用到的
植酸酶、环境工程中用到的等。
[0003] 直流
电场的作用主要有电荷作用、极化作用、热学效应、化学效应和生物效应等。直流电场作用下可增加细胞膜透性，促进分泌细胞向外分泌酶类。此外，已有研究表明直流电场具有众多的细胞效应。如促进
伤口愈合修复、改变高尔基体排列方式、促进
植物根尖组织生长等一系列的特殊生物学效应。
[0004] 对于生物大分子
蛋白质，直流电场施加于溶液时产生电荷效应（改变蛋白质表面电荷分布），温升效应（
电能转换为
热能），自由基效应，微流效应等，可以有效地改变蛋白质的二级、三级和更高级的构象。直流电场作用于酶分子时，释放的
能量可导致酶分子的构象和结构发生变化， 从而影响到催化活性的变化。
[0005] 综上所述，直流电场具有促进细胞分泌、改变蛋白质三级结构的作用，同时电场具有高效、廉价、无污染、易施加等特点，因此，直流电场的作用在酶工程上的应用将为食品、医药卫生等领域带来广阔应用前景。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于针对
现有技术的
缺陷和不足，提供一种结构简单，设计合理、使用方便的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它在
发酵工程细胞的产酶的过程中，对发酵产生的细胞及酶液混合物应用直流电场刺激，从而实现促进细胞产酶活性的提高。
[0007] 本发明所述的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它采用如下的技术方案：
[0008] 步骤一：摇瓶培养，采用如下的方法步骤：
[0009] （1）250 mL 的锥形瓶中装摇瓶培养基 50 mL，从斜面上接种一环
种子，放置于旋转式摇床上在 26℃下培养 120 h，摇床转速 220 r ／ min，得发酵培养基；
[0010] （2）将发酵培养基 ( 按 18 L 装液量 ) 配好并装入
发酵罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 1 个茄型瓶种子 ( 用无菌
水将菌种刮下 )，搅拌转速 500 r ／ min，通
风量 1VVM；
[0011] （3）1 m³ 发酵罐培养：将放大发酵培养基 ( 按 60％装液量 ) 配好并装入罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 3 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 200r ／ min，
通风量 1 VVM；
[0012] 步骤二 ：直流
电刺激，采用如下方法步骤：
[0013] （1）发酵培养周期结束后，对发酵菌及酶液施加直流
电压 0.1-5V/cm，直流
电流 1-120分钟；
[0014] （2）其产酶水平能从未施加电场时的 5000 IU ／ mL 达到 6000 IU/mL；
[0015] 步骤三 ：脂肪酶酶活的测定，采用如下方法步骤 ：
[0016] （1）采用
橄榄油乳化液测定法，配制 2％ ( W ／ V) 的聚乙烯醇 (PVA 1750) 溶液，与橄榄油按体积比 3 ：1 混合后高速搅拌 3 min 制得橄榄油乳化液，取 5 mL 乳化液与 4 mL
磷酸缓冲液 (0．1mol ／ L，pH 8．0) 混合，在 40° C 水浴中预热 5 min，加入样液反应 10 rnin后加入 15 mL 无水
乙醇终止反应，以酚酞作指示剂，用 0．05 tool ／ L 的 NaOH 溶液滴至液体呈粉红色；
[0017] （2）与空白样对比计算其酶活。在测定条件下，每分钟释放出 1μmol
脂肪酸的酶量定义为 1 个酶活单位 (IU)。
[0018] 进一步地，所述步骤二中，其发酵菌细胞为真核生物细胞或原核生物细胞。
[0019] 进一步地，所述提高宿主细胞产酶活性的方法，其发酵过程中或发酵结束对粗发酵液施加直流电场。
[0020] 进一步地，所述粗发酵液为细胞悬液、细胞及酶液混合物或发酵产生的粗酶液。
[0021] 采用上述结构后，本发明有益效果为 ：本发明所述的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它在发酵工程细胞的产酶的过程中，对发酵产生的细胞及酶液混合物应用直流电场刺激，从而实现促进细胞产酶活性的提高。
[0023] 此处所说明的附图是用来提供对本发明的进一步理解，构成本
申请的一部分，但并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
[0025] 【具体实施方式】
[0026] 下面将结合附图以及具体
实施例来详细说明本发明，其中的示意性实施例以及说明仅用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
[0027] 如图 1 所示，本具体实施方式所述的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它采用如下的技术方案：
[0028] 步骤一 ：摇瓶培养，采用如下的方法步骤：
[0029] （1）250 mL 的锥形瓶中装摇瓶培养基 50 mL，从斜面上接种一环种子，放置于旋转式摇床上在 26℃下培养 120 h，摇床转速 220 r ／ min，得发酵培养基；
[0030] （2）将发酵培养基 ( 按 18 L 装液量 ) 配好并装入发酵罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 1 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 500 r ／ min，通风量 1VVM；
[0031] （3）1 m³ 发酵罐培养：将放大发酵培养基 ( 按 60％装液量 ) 配好并装入罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 3 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 200r ／ min，通风量 1 VVM；
[0032] 步骤二：直流电刺激，采用如下方法步骤：
[0033] （1）发酵培养周期结束后，对发酵菌及酶液施加直流电压 0.1-5V/cm，直流电流 1-120分钟；
[0034] （2）其产酶水平能从未施加电场时的 5000 IU ／ mL 达到 6000 IU/mL；
[0035] 步骤三 ：脂肪酶酶活的测定，采用如下方法步骤：
[0036] （1）采用橄榄油乳化液测定法，配制 2％ ( W ／ V) 的聚乙烯醇 (PVA 1750) 溶液，与橄榄油按体积比 3 ：1 混合后高速搅拌 3 min 制得橄榄油乳化液，取 5 mL 乳化液与 4 mL 磷酸缓冲液 (0．1mol ／ L，pH 8．0) 混合，在 40° C 水浴中预热 5 min，加入样液反应 10 rnin后加入 15 mL 无水乙醇终止反应，以酚酞作指示剂，用 0．05 tool ／ L 的 NaOH 溶液滴至液体呈粉红色；
[0037] （2）与空白样对比计算其酶活。在测定条件下，每分钟释放出 1μmol 脂肪酸的酶量定义为 1 个酶活单位 (IU)。
[0038] 所述步骤二中，其发酵菌细胞为真核生物细胞或原核生物细胞。
[0039] 所述提高宿主细胞产酶活性的方法，其发酵过程中或发酵结束对粗发酵液施加直流电场。
[0040] 所述粗发酵液为细胞悬液、细胞及酶液混合物或发酵产生的粗酶液。
[0041] 本发明的具体实施例如下 :
[0042] 实施例 1 直流电刺激提高假丝
酵母发酵产脂肪酶酶活水平
[0043] 1）发酵培养
[0044] 250 mL的锥形瓶中装摇瓶培养基50 mL，从斜面上接种一环种子，放置于旋转式摇床上在 26℃下培养 120 h，摇床转速 220 r ／ min。将发酵培养基 ( 按 18 L 装液量 ) 配好并装入发酵罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 1 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下)，搅拌转速500 r／min，通风量1 VVM。1 m³ 发酵罐培养 ：将放大发酵培养基(按60％装液量 ) 配好并装入罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 3 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 200 r ／ min，通风量 1 VVM。
[0045] 2）直流电刺激工艺
[0046] 发酵培养周期结束后采用直流电刺激，对发酵菌及酶液施加 0.2V/cm 直流电 30 分钟。
[0047] 检测酶活结果显示，其产酶水平能从未施加电场时的5000 IU／mL达到6000 IU/mL 的水平。发酵酶活比未施加直流电处理提高约 20%。
[0048] 实施例 2 直流电刺激提高 SOD 产量水平
[0049] 1) 菌种的活化：将耐
辐射球菌划线接种于 TGY 固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/L，酵母提取物 3g/L，
葡萄糖 1g/L，30-32℃培养 45-48h，挑取单菌落接种于三
角瓶中摇瓶培养至对数生长期；
[0050] 2) 发酵培养条件：将上述种子液按 3-5％体积的接种量接入发酵液体培养基中，30-32℃培养 38-42h；
[0051] 3)SOD 的直流电刺激 ：菌体生长到 38-42h，即稳定早期，菌浓度＞ 108/ml，菌体形态多数呈二联体，此时是进行直流电刺激的最佳时期 ；将菌体培养物置于直流电刺激平台，施加0.5V/cm 直流电压，菌体所接受直流电处理的总时间为 20 min；
[0052] 4) 菌体直流电刺激后培养的条件：经辐射诱导后的菌体，需要在 30-32℃条件下培养30-60min，目的是使菌体在接受外界刺激后，大量合成 SOD 酶； 5) 粗酶液的提取：①菌液离心 5000-10000rpm，0-4℃，10-15min，收集菌
体细胞沉淀。用 50-60mM，pH7.0 的
磷酸盐缓冲液洗涤三次，离心收集菌体细胞。 ②按每克菌体加入三倍缓冲液制成菌悬液，600-700w功率下
超声波处理菌细胞 8-10min，每处理 2-3 秒间隔 4-6 秒，菌体
破碎率可达 85％以上。③ 10000-12000rpm，0-4℃条件下离心 10-20min，收集上清液，即为 SOD 粗酶液。
[0053] 实施例 3 直流电刺激提高利福霉素 SV 发酵产量水平：
[0054] 1）发酵培养
[0055] 按种子和发酵培养基配方配置培养液，湿热灭菌后降温至 28℃，按 3%-5% 的接种量将地中海拟无枝酸菌的合瓶种子液接入一级种子罐。一级种子罐温控制在 28℃，无菌空气流量按 0.8 vvm 控制，搅拌转速为 160 r/min，罐压控制在 0.03-0.04 MPa，培养 48h 后无菌操作补入二级种子罐；二级种子罐温控制在 28℃，无菌空气流量按 0.8 vvm 控制，搅拌转速为 160 r/min，罐压控制在 0.03-0.04 MPa，培养 48h 后无菌操作补入三级发酵罐；三级发酵罐温按 28℃控制，转速为 160 r/min，无菌空气流量控制在 0.5-0.8 vvm，罐压控制在0.03-0.05 MPa，培养周期为 136 h；
[0056] 2）直流电刺激工艺：
[0057] 发酵培养周期结束后，对发酵菌及酶液施加 0.5 V/cm 直流电 30 分钟。
[0058] 本发明产生的优点如下：
[0059] 通过该方法可明显提高细胞产酶活
力 20% ～ 30%，且操作工艺简单，可控性强，适宜于大批量发酵生产，可有效降低应用细胞工程生产饲料、食品、医药卫生等工业用酶的生产成本，节约能源和资源，社会经济效益显著，符合国家关于发酵工业节能降耗的绿色发展趋势。
[0060] 本发明所述的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它在发酵工程细胞的产酶的过程中，对发酵产生的细胞及酶液混合物应用直流电场刺激，从而实现促进细胞产酶活性的提高。
[0061] 以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明
专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。
