技术领域
[0001] 本
发明涉及一种定量测定土壤颗粒态有机质空间结构的方法，属于土壤研究技术领域。
背景技术
[0002] 土壤颗粒态有机质具有复杂的物理结构特征，国内外目前尚无统一有效的方法直观定量测定土壤颗粒态有机质的空间结构。国内外学者利用非破坏性的微观分析技术，比如
电子显微镜、扫描电镜-能谱分析技术(SEM-EDX)等手段研究土壤颗粒态有机质的表面形态结构与化学组成。通过这些方法可以发现不同来源、腐殖化程度的土壤颗粒态有机质在电子显微镜下呈现出明显的结构差异，如絮状结构、层状结构及层、絮状相间结构。但是利用电子显微镜、扫描电镜等手段只能从视觉上定性分辨土壤有机质结构的差异性，而有机质空间结构的定量分析、形态结构参数的确定等方面的研究无法实现。
[0003] 因此，引入一种新的技术手段实现土壤颗粒态有机质结构定量测定是非常有必要的。基于同步
辐射的显微计算机
断层扫描成像(macro-CT)技术可以通过光、电
信号转换的方式捕获土壤结构的细节特征并进行定量测定，该方法具有快速、成像
对比度强、
分辨率高的优点。目前，国内外学者多用此技术进行土壤孔隙结构、分布及其优先流关系以及土壤团聚体的分形特征等方面的研究。随着该方法在应用过程中不断被优化、升级，逐渐被应用于土壤团聚体的微结构特征分析，比如分析土壤团聚体内部孔隙分形结构的变化等。Flavel R J等运用显微CT技术和标准方法研究对比了不同磷肥处理的土壤剖面中的谷类根系的分布情况，结果显示用显微CT技术在孔隙结构研究方面具有更快速、准确的优点(Flavel R J,Guppy C N,Tighe M,et al.Non-destructive quantification of cereal roots in soil using high-resolution X-ray tomography[J].Journal of Experimental Botany:2012:421)。
[0004] 但是土壤颗粒态有机质在土壤中分布随机，结构复杂，定量测定相对困难，需要对土壤颗粒态有机质进行一系列的预处理和实验方法的优化、改进，因此，目前尚没有人把该方法应用在土壤颗粒态有机质空间形态结构的测定上，基于前人研究的
基础，
发明人首次采用提出采用显微CT技术对土壤颗粒态有机质的空间结构特征进行定量测定。
发明内容
[0005] 针对上述问题，本发明提供了一种定量测定土壤颗粒态有机质空间结构的方法。该方法首先通过湿筛分级和
密度提取的方法提取土壤中的颗粒态有机质，然后显微CT技术对颗粒态有机质进行图像扫描，扫描后的图像经过去除伪影—计算
阈值—
图像分割—三维重构等过程分析，对土壤有机制形态特征、有机质数量、体积比及体积分布、孔隙大小分布等参数进行定量。
[0006] 本发明的技术方案是：一种定量测定土壤颗粒态有机质空间结构的方法，其特征是，包括以下步骤：
[0007] 1)通过湿筛分级得到大团聚体(250-2000μm)和微团聚体(53-250μm)，然后通过密度提取的方法，分别得到大团聚体的游离颗粒态有机质、微团聚体的游离颗粒态有机质、大团聚体内部结合的颗粒态有机质和微团聚体内部结合的颗粒态有机质；
[0008] 2)任选一组上面的颗粒态有机质，采用显微CT对其从0到180°匀速旋转进行图像扫描，共采集960幅以上扫描投影图像，并记录各
角度的扫描投影图像；
[0009] 3)对扫描投影图像经去除伪影、计算阈值和图像分割处理，将图像分为孔隙、有机质和土壤矿物质三部分，然后进行三维重构，恢复土壤颗粒态有机质原貌；
[0010] 4)定量计算土壤颗粒态有机质空间结构特征，包括形态特征、有机质数量、体积比及体积分布、孔隙大小分布等参数中的一种或者一种以上。
[0011] 所述步骤1)的湿筛分级为：将土壤加入离心管内缓慢加
水浸润，避免快速加水压
力剧增造成土壤结构的破坏；然后将离心管倒置在2mm筛(2mm筛下层依次放置配套的250μm和53μm筛)内的水面以下，直至土样完全沉入到筛中；上下移动筛子，通过湿筛分级得到粒径为250-2000μm大团聚体和53-250μm的微团聚体；
[0012] 所述步骤1)的密度提取为：
[0013] 将密度为1.85g/cm3的NaI溶液和大团聚体(或者微团聚体)加入离心管中，上下颠倒，静置，过滤分离上层轻组有机质，下层样品重复上述步骤，直至完全分离轻组有机质，得到大团聚体(微团聚体)的游离颗粒态有机质；
[0014] 下层重组有机质用5g/L的六偏
磷酸钠分散后湿筛，得到大团聚体(微团聚体)内部结合的颗粒态有机质；
[0015] 分级提取得到的这些组分均用超纯水反复洗去盐分离子，50℃烘干。
[0016] 所述步骤3)的去除伪影、计算阈值和图像分割为：预处理将图片去伪影后进行切片分割，输出为二进制图像，将二进制图片转化为八进制图片后进行阈值分割；阈值的选择采用全局阈值方法，采用观察灰度值直方图来选择，孔隙对
X射线没有吸收，灰度值最小，土壤矿物质吸收最大，灰度值较大，有机质介于二者之间，根据各组分灰度值不同建立直方图，直方图会有2个波峰，选择2个波峰的中间波谷的灰度值即可作为阈值，将图像分为孔隙、有机质和土壤矿物质三部分。
[0017] 进一步的，对图像进行分割后还可以对有机质组分和土壤矿物质进行
染色处理，以增强二者的视觉对比。
[0018] 进一步的，所述步骤4)定量计算有机质空间结构特征采用image J
软件完成，有机质孔隙大小采用等效直径的方式来表示。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 1、本发明首先通过湿筛分级和密度提取的方法提取土壤中的颗粒态有机质并进行分组，从而解决了“土壤颗粒态有机质在土壤中分布随机，结构复杂，定量测定相对困难”的问题，为土壤颗粒态有机质的定量测定提供了可能；
[0021] 2、本发明首次采用显微CT技术对土壤颗粒态有机质的空间结构特征进行定量(形态特征、有机质数量、体积比及体积分布、孔隙大小分布等参数)测定，这为
土壤学尤其是土壤有机质的深入研究奠定了基础。
附图说明
[0022] 图1是土壤颗粒态有机质显微CT扫描图片；
[0023] 图2是土壤颗粒态有机质显微CT扫描图片重构后的切片转化为八进制图片；
[0024] 图3是区分有机质和土壤矿物质的阈值分析示例图；
[0025] 图4是分割染色后的土壤有机质颗粒分布图，其中灰色为有机质组分，绿色为附着的矿物组分；
[0026] 图5是选取体积
像素为500×500×500的土壤颗粒态有机质的3D重构图。
具体实施方式
[0027] 本技术发明方案不局限于以下所列举的具体实施方式，具体实施方式鉴定方法按照以下步骤进行。
[0029] 1、湿筛分级提取土壤中的团聚体
[0030] 采集黄河三角洲滨海湿地芦苇生长区的土壤样品，准确称取20g土样于100mL离心管中，缓慢加水浸润，水土比约为2:1，此过程防止
风干土中快速加水造成团聚体孔隙内气压不稳，团聚体崩裂，破坏其
稳定性。然后将离心管倒置在2mm筛(2mm筛下层依次放置配套的250μm和53μm筛)内的水面以下，直至土样完全沉入到筛中。上下移动筛子，3cm/次，25次/分钟。通过湿筛分级得到粒径为250-2 000μm大团聚体和53-250μm的微团聚体样品，再进一步分离颗粒态有机质；
[0031] 2、密度提取的方法提取颗粒态有机质
[0032] 用密度为1.85g/cm3的NaI溶液对大团聚体和微团聚体进行密度分级，即取5g团聚体样品于100mL离心管中，固液比为1:7，上下颠倒1min，静置30min后，过滤分离上层轻组有机质，下层样品重复上述步骤，直至完全分离轻组有机质，得到大团聚体(250-2 000μm)和微团聚体(53-250μm)的游离颗粒态有机质(fPOM)。
[0033] 下层重组有机质用5g/L的六偏磷酸钠分散16h后湿筛，得到团聚体内部结合的颗粒态有机质(iPOM)，各组分样品标记为：fPOM(250-2 000μm)、iPOM(250-2 000μm)、fPOM(53-250μm)、iPOM(53-250μm)。分离得到的这些组分均用超纯水反复洗去盐分离子，50℃烘干。
[0034] 3、用显微CT技术对颗粒态有机质进行图像扫描
[0035] 任选一组上面的颗粒态有机质，本研究以fPOM(250-2000μm)组分的颗粒态有机质为例；进行显微CT实验分析，土壤颗粒态有机质的显微CT扫描成像实验在上海
光源BL13WX射线成像光束线站完成。
[0036] 将样品放置在0.6mL的塑料离心管中，固定在样品台上。样品台距离探测器约为15cm。样品扫描参数设置为：
光子能量为18keV，分辨率3.25μm，样品台水平方向从0到180°匀速旋转，曝光时间1.2s，共采集1080幅投影图像，CCD探测器记录各角度的扫描投影图(如图1所示的图是其中一幅)。然后将每个样品的1080个投影用于CT图像的重构，得到1508张切片，每个投影图的分辨率为2048像素×2048像素。样品内部结构的重建采用
滤波反投影算法。
[0037] 4、对扫描图像进行分析
[0038] 显微CT扫描过程中可能会存在环状伪影，伪影在切片分割前需要去除，去除伪影和切片分割采用免费软件PITRE完成(http://webint.ts.infn.it/en/research/exp/beats2/pitre.html)。图像分割和三维重构
渲染采用免费软件image J 1.50(the National Institute of Health，USA；http://rsb.info.nih.gov/ij/)以及
插件BoneJ和3D模
块完成。图像分割时首先通过灰度值直方图中的双峰，以双峰的中间的谷点作为分割阈值，确定分割阈值后，将图像分为孔隙、有机质和土壤矿物质三部分。定量分析主要选取大小为500×500×500像素的典型区域进行。定量分析参数：有机质大小、体积、数量以及孔隙大小等分析采用image J软件完成。有机质孔隙大小采用等效直径的方式来表示。
[0039] 具体操作过程为：预处理将图片去伪影后进行切片分割，输出为二进制图像(全黑)，将二进制图片转化为八进制图片(如图2)后进行阈值分割，灰度值范围为0～255，其中，0表示黑色，
亮度最低，255表示亮度最高的纯白色。阈值的选择采用全局阈值方法，对需处理的图像进行实验分析，采用观察直方图来选择，孔隙对X射线没有吸收，灰度值最小，土壤矿物质吸收最大，灰度值较大，有机质介于二者之间，根据各组分灰度值不同建立直方图，直方图会有2个波峰，选择2个波峰的中间波谷的灰度值可作为阈值，其中区分有机质和矿物质的分割阈值分析示例如图3所示。转换前可适当进行平滑处理让边界轮廓清晰提高
信噪比。对图像进行分割后还可以对有机质组分和土壤矿物质进行染色处理，以增强二者的视觉对比(图4)。最后选用3D分析工具将1508张切片重构，恢复土壤颗粒态有机质原貌，鉴于数据庞大，处理过程中可以选则提取500×500×500像素的体积(图5)进行分析，并对颗粒态有机质的体积比、单位体积的数量进行定量分析，结果如表1所示。其中，体积比是有机质与取样体积(500×500×500)的比值。
[0040] 表1土壤颗粒态有机质体积比、数量和形态特征
[0041]
[0042] 5、土壤颗粒态有机质定量分析
[0043] 显微CT技术研究土壤颗粒态有机质的方法可以借鉴土壤孔隙形貌的描述方式，将颗粒态有机质形貌因子(或孔隙)表示如下：
[0044] F＝As/A
[0045] 其中As是与颗粒态有机质体积相等的球体的表面积；A是颗粒态有机质的实际表面积。当F＝1时，表示颗粒态有机质是完美的球体，当F值减小，颗粒态有机质则呈现拉长型或无规则型。
[0046] 颗粒态有机质的形态特征分析结果如表1所示。
[0047] 进一步对颗粒态有机质的体积分布进行统计，结果如表2所示。
[0048] 表2土壤颗粒态有机质体积分布特征
[0049]
[0050] 土壤颗粒态有机质孔隙大小均使用等效直径来表示。根据等效直径的大小，将颗粒态有机质孔隙分成四部分，分别为超微孔隙(<5μm)、微孔隙(5-30μm)、中孔隙(30-80μm)和大孔隙(>80μm)。考虑到本研究扫描图片的分辨率为3.25μm，故将颗粒态有机质中超微孔隙和微孔隙划分为一个区间，即3.25-30μm。颗粒态有机质的孔隙度分布特征如表3所示。其中孔隙度是孔隙体积与取样体积(500×500×500)的比值。
[0051] 表3土壤颗粒态有机质孔隙大小分布
[0052]
[0053] 采用上述方法可以继续定量测定iPOM(250-2 000μm)、fPOM(53-250μm)、iPOM(53-250μm)的空间结构。
[0054] 本发明为土壤颗粒态有机质的空间结构(形态特征、有机质数量、体积比及体积分布、孔隙大小分布等参数)的定量测定提供了有效的方法，这为土壤学尤其是土壤有机质的深入研究奠定了基础方法。
