技术领域
[0001] 本
发明属于
农作物间作轮作技术领域尤其涉及一种盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法，用于缓解连作障碍的
土壤微生态。
背景技术
[0003] 花生和棉花
耐盐性较强，适合盐碱地推广种植。然而由于数年连作，土壤生产
力持续下降、病虫害严重，制约花生和棉花生产。因此，推广花生/棉花间作轮作的
种植模式是实现用地养地相结合，减少
肥料、
农药投入，有效缓解粮、棉、油作物间争地矛盾，实现盐碱地可持续发展的重要途径。
[0004] 然而，目前关于花生/棉花间作轮作的分析仅局限在对产量、品质和经济效益的影响上，而对盐碱地花生/棉花间作轮作缓解连作障碍的分析则少见报道，是限制花生/棉花间作轮作种植模式在生产上尤其是在盐碱地区应用推广的主要原因。因此，阐明盐碱地花生/棉花间作轮作种植模式对连作障碍的缓解机制，可为进一步挖掘间作优势及该种植模式在盐碱地上进行大面积应用推广提供理论依据和技术
支撑。
[0005] 间作轮作种植模式是业内农业生产中广泛应用的多熟种植模式，是传统农业技术精华的重要组成部分。间作轮作利用不同作物的生态位差异，将作物合理配置在一起，形成充分利用各种自然资源的高效群落。不仅能够提高单位面积土地生产力，维持
土壤肥力，增强农田
生态系统的
稳定性，而且能最大限度地提高自然资源的利用效率，降低作物减产的
风险，保证粮棉油安全。因此，间作轮作种植模式在现代农业中仍然具有重要地位，是未来
可持续农业发展的重要方向之一。
[0006] 间作轮作种植模式对花生棉花生理、产量、品质和效益的影响：
[0007] 豆科与禾本科作物的间作和轮作种植模式是业内农业生产实践中常见的配置方式。间作扩大了根系的垂向分布，增加了养分
水分的吸收区域，为花生和棉花高产高效奠定了
基础。间作增产已被大量分析所验证，花生/棉花间作下棉花吐絮时间提前且集中，有利于棉花统一
收获，改善
纤维品质，提高衣分、霜前花率，增加总体经济效益。部分研究认为棉花是根深、养分需求量大的耗地作物，而花生是浅根、具有固氮功能的养地作物，二者的营养生态位可异质互补而不产生竞争。另外，在棉花与花生间作轮作种植系统中，棉花能充分利用花生所固定的氮，花生能利用棉花活化的土壤磷。因此，花生/棉花间作能够保证两种作物不减产，同时大幅增加全田经济效益。
[0008] 总之，花生/棉花间作轮作种植模式是一种集约利用农业资源、提高土壤肥力的优化种植模式，大幅提高了产量、经济、生态及社会效益。
[0009] 间作轮作种植模式对土壤微生态的影响：
[0010] 土壤
微生物活动直接影响土壤的理化性质，与土壤养分的固定与释放紧密相关，是评价土壤肥力的重要标志之一。间作条件下，两种作物根系互作引起根系分泌物发生变化，影响土壤微生物的活动，进而改变
根际土壤微
生物群落的多样性。此外，土壤中致病
真菌类微生物大量繁殖和微生物结构的变化，同样也是连作障碍的主要原因之一。间作轮作比单一栽培有利于增加土壤微生物数量，维持土壤微生物的多样性，最终减轻土传病害的发生危害而成为缓解连作障碍的有效方法。例如小麦蚕豆间作使根系有益分泌物增多，根际土壤中真菌群落的多样性和丰富度显著增加，真菌活性显著增强，真菌群落结构发生了明显变化，蚕豆枯萎病致病菌—尖孢镰刀菌的数量显著降低，最终减轻了蚕豆枯萎病的危害并提高了蚕豆产量。然而，关于盐碱地花生/棉花间作轮作对根际土壤微生物群落多样性的影响则尚未见报道。
[0011] 土壤酶活性:
[0012] 土壤酶是土壤
质量评价指标体系中的重要指标之一。随花生连作年限增加，过
氧化氢酶活性下降，土壤中氧化作用降低，使过氧化氢分解减慢，导致过氧化氢在土壤中大量积累，容易使根系的毒害作用加重而引起连作障碍。例如，玉米花生间作轮作和玉米大豆间作轮作显著提高了土壤中转化酶和
磷酸酶活性，显著增加土壤中细菌、真菌、放线菌、固氮菌的数量。因此，间作可以调控作物根际土壤微生物活性、多样性和群落结构，提高土壤酶活性，进而改善土壤理化性质，促进土壤养分释放，有利于作物的吸收利用，并减轻土传病的危害。然而，关于盐碱地花生/棉花间作轮作对土壤酶活性的影响则少见报道。
[0013] 土壤水盐运移:
[0014] 由于间作作物的生长发育、耗水特性不同，造成需水和水分转化在时间和空间上的分异，而具有稳产和提高水分利用效率的作用。当种间竞争小于种内竞争时，种间竞争有利于提高水分利用效率，形成间作优势、提高系统稳定性。
[0015] 而间作作物根系在时间和空间上的错位分布则是间作高产、高效的主要原因之一。然而，盐碱地花生/棉花间作轮作对土壤中水盐运移是否有影响？棉花根深、棵高，能否降低花生带的盐分而利于花生生长？这些问题目前尚未见报道。
[0016] 综上所述，现有技术存在的问题是：
[0017] (1)现有研究没有开展针对盐碱地条件下的花生/棉花间作研究。
[0018] (2)现有技术没有合理针对花生/棉花间作轮作技术调控土壤微
生物多样性和群落结构的研究；根系分泌物、土壤酶活性和土壤水盐运移等土壤微生态机制的研究。
[0019] (3)现有技术在间作的研究中没有将间作作物的生理机制、农田生态机制和土壤微生态机制相结合开展克服连作障碍方面进行研究。
[0020] 解决上述技术问题的难度：在于如何同时开展以上指标的测定，以及如何从筛选出的微生物中解析和挖掘优势功能微生物，并将该种类微生物应用于生产实践，切实解决盐碱地花生和棉花的连作障碍。
[0021] 解决上述技术问题的意义：本发明能够有助于解析根际土壤优势功能微生物在盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式缓解连作障碍中的关键作用；揭示植株生长、根系分泌物、土壤酶和土壤水盐运移的变化特征；进而阐明盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式缓解连作障碍的土壤微生态机制，为该模式在盐碱地大面积应用推广提供理论依据和技术支撑。
发明内容
[0022] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法。
[0023] 本发明是这样实现的，一种盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法，在筛选出的6行花生/4行棉花，等幅种植的基础上，采用大田根系分隔试验法，进行盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植模式缓解连作障碍的土壤微生态机制；具体包括：
[0024] 步骤一，分析花生/棉花间作轮作对2种作物生长、产量和经济效益的影响：
[0025] 步骤二，测定棉花、花生功能
叶片叶绿素及组分含量、光合速率和叶绿素
荧光特性，确定棉花、花生的生长特性；测定花生和棉花的农艺性状，产量及产量构成因素；计算花生/棉花间作轮作的经济效益和土地当量比；
[0026] 步骤三，花生/棉花间作轮作条件下2种作物根际土壤微生物群落多样性变化特征；收集不同处理花生和棉花的根际土壤，利用高通量测序分析花生和棉花根际土壤微生物群落多样性变化，利用生物信息学的分析方法鉴定和发掘根际土壤优势功能微生物；
[0027] 步骤四，花生/棉花间作轮作条件下2种作物根系分泌物、土壤酶活性和土壤水盐运移变化特征：对花生和棉花根系分泌物进行定性和定量分析，确定花生和棉花根系分泌物的组成；测定不同处理土壤中过氧化氢酶、脲酶、
蔗糖酶和磷酸酶的活性，分析花生和棉花土壤酶活性的变化特性；测定不同处理土壤水分含量和总盐分含量，确定花生和棉花土壤水盐运移的
时空变化特性。
[0028] 进一步，步骤一具体包括：
[0029] 第一步，试验采用品种
播种后按照750kg/hm2施用
复合肥作为基肥；
[0030] 第二步，设置7个处理如下：
[0031] 处理1：棉花单作，根系不分隔，大小行种植，小行距60cm，大行距80cm，株距25cm，3811株/亩；
[0032] 处理2：花生单作，根系不分隔，垄距90cm，垄上小行距30cm，大行距 60cm，一穴2粒，穴距17cm，8719穴/亩；
[0033] 处理3：花生/棉花间作，根系不分隔，棉花带宽270cm，种植4行棉花，小行距60cm，大行距80cm，边行离花生带35cm，株距25cm；花生带宽270cm，种植3垄花生，垄距90cm，垄上小行距30cm，大行距60cm，边行离棉花带30 cm，穴距17cm，一穴2粒；
[0034] 处理4：花生/棉花间作，在棉花带和花生带之间用300目尼龙网(根系不能通过，但水分、养分和盐分可以通过)进行根系分隔，深度100cm，其余同处理3；
[0035] 处理5：花生/棉花间作，在棉花带和花生带之间用塑料布进行根系分隔，深度100cm，其余同处理3；
[0036] 处理6：按花生/棉花间作设置，但花生带不种植任何
植物的对照处理；
[0037] 处理7：按花生/棉花间作设置，但棉花带不种植任何植物的对照处理；
[0038] 每个处理的小区面积均为81m2各处理重复4次，28个小区在试验田中按照随机区组排列；第3-5处理的花生和棉花第二、三年度交替轮作，三年内各小区的
位置保持不变。
[0039] 进一步，步骤二中，花生棉花生长指标、产量及产量构成因素包括：
[0040] 生长指标：花生的主茎高和节数、侧枝长度和节数、总分枝数、单株叶面积、根瘤数、根长、根表面积和根体积。棉花的株高、主茎节间长度、果枝始节、果枝数、单株叶面积、单株结铃数、脱落率、吐絮率；
[0041] 各处理花生第1行和棉花第1行的全展顶3叶(功能叶片)光合速率采用美国产Li-6800便携式光合测定仪测定采用便携式叶绿素荧光仪测定以上叶片的叶绿素荧光特性；同时收集以上叶片，采用
乙醇丙
酮提取法测定叶绿素及其组分含量；
[0042] 产量及产量构成因素：于花生成熟期测定百果重、百仁重、饱果率、单株果数、单株产量和理论产量等。于棉花成熟期测定单株铃数、单株铃重、衣分、子棉产量和皮棉产量。
[0043] 进一步，步骤三中，花生棉花根际土壤微生物群落多样性分析包括：
[0044] 样品采集：选取各处理第1行花生和第1行棉花植株去掉附着在根系0-5cm 的表土，用毛刷轻刷粘附在根系表面的土壤混合均匀后用无菌封口袋包扎密封，迅速置于装有
干冰的
泡沫盒中；
[0045] 根际土壤微生物基因组DNA的提取及检测：使用OMEGA E.Z.N.A DNA
试剂盒提取各样本的基因组DNA；
[0046] 目标区域16S rDNA的PCR扩增：16S rDNA为原核生物的核糖体特征编码序列，微生物多样性测序中利用高通量测序技术对PCR所扩增的16S等微生物物种特征序列进行检测，用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4 区；引物序列如下：
[0047] 341F:5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’；
[0048] 806R:5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’；
[0049] 扩增产物在2％琼脂糖凝胶进行
电泳，切取目的条带，回收后使用Tris-HCl 洗脱，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图进行初步定量；冰冻保存样品构建测序文库，并进行高通量测序。
[0050] 进一步，测序及分析流程包括：
[0051] (i)根据barcode将大量的测序结果回归样本；
[0052] (ii)通过严密准确的程序，统计测序结果中的最终优化序列；
[0054] (iv)样品OTU分布的比较：统计多个样品中所共有的OTU数目可以反映环境样品的相似性及重叠情况；
[0055] (v)菌群多样性指数分析通过单样本的多样性分析反映微生物群落的丰度和多样性；
[0056] (vi)稀释曲线检测样品的测序深度情况；
[0057] (vii)PCA主成分分析：反映不同样品中微生物群落组成的相似性以及影响微生物多样性的主要因素；
[0058] RDA冗余分析：进行与环境因子相关的微生物的筛选；
[0059] (viii)CCA典范对应分析：分析微生物群落与环境因子的相互关系。
[0060] 进一步，步骤四花生棉花根系分泌物分析的方法包括：
[0061] 收集：选取各处理1、2、3行花生和1、2行棉花植株先用清水冲洗3-5次，洗掉附着的泥土，之后用去离子水将根部清洗干净,并放到1000mL 0.5mmol·L-1氯化
钙溶液中；用黑纸包裹好烧杯，避光收集6h根系分泌物；
[0062] 提取：将收集好的根系分泌物经多用
真空泵抽取过滤，将得到的澄清溶液用乙酸-1乙酯按2：1的体积比例萃取3次，得到乙酸乙酯相为中性成分；将水相用1mol·L HCl调节pH至3，再用同体积乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为酸性组分；将水相再用11mol·L-1NaOH调节pH至8，用同体积乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯相为碱性组分，将酸性、碱性和中性乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干上机测定前进行柱前衍生化，在冻干的提取液加入0.5mL
硅烷化试剂加盖密封后于80℃水浴2h，冷却后用0.45μm
膜过滤，取1.0mL作GC-MS定性分析；
[0063] 定性分析：色谱(GC)条件：
石英毛细管株TR-5MS进样口
温度为250℃，进样量1.0μL；分流比20：1，载气为氦气(He)，流速1mL·min-1；
[0064] 质谱(MS)条件：
电子轰击源(EI)电子
能量70eV，扫描范围45-500amu，扫描速度0.2s，
接口温度250℃，离子源温度250℃，
溶剂延迟时间为4.0min；
[0065] 通过GC-MS分析后得到总离子流色谱图，采用标准质谱库定性，通过计算机在 NIST2011质谱
数据库查找核对并结合人工分析进行物质的鉴定；
[0066] 定量分析：吸取正十八烷0.05mL溶于1000mL CH2Cl2中，用CH2Cl2配置成含有正十八烷1、5、10、20、50、100mg·L-1 6个浓度梯度的标准溶液；吸取乙基苯0.01mL溶于1000mL CH2Cl2中，用CH2Cl2配置成含有乙基苯0.1、0.2、 0.5、1、2、5mg·L-1 6个浓度梯度的标准溶液；称取乙酸乙酯0.01g溶于CH2Cl2中，用CH2Cl2配置成含有乙酸乙酯1、2、5、10、20、40mg·L-1 6个浓度梯度的标准溶液；3种物质的6个浓度梯度的标准溶液进行GC-MS分析，并进行线性回归分析，根据各组分的保留时间确定3种物质的色谱峰，由标准曲线的回归方程计算得到各物质的浓度。
[0067] 进一步，提取步骤中，提取液过0.45μm膜后，用
旋转蒸发仪蒸至10mL，再用氮吹仪吹干，整个操作过程用乙酸乙酯润洗，将提取液
冷冻干燥。
[0068] 进一步，步骤四中，花生和棉花行间土壤酶活性测定方法包括：
[0069] 在各处理花生1-2行，2-3行中间位置，棉花1-2行中间位置，以及花生第1 行距棉花带10cm位置和棉花第1行距花生带10cm位置，采用电动土钻挖取 0-20cm，20-40cm以及40-60cm三个深度土壤样品用封口袋包扎密封，迅速置于装有干冰的泡沫盒中，进行土壤相关酶活性测定。
[0070] 进一步，土壤相关酶活性测定方法包括：
[0071] 过氧化氢酶活性的测定，采用容量法，用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸
钾量(毫升数)为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢
混合液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为A；(A-B)×T为过氧化氢酶活性。
[0072] 脲酶活性的测定，采用
苯酚钠比色法进行测定，酶活性以提取液恒温培养 24h后1g土壤中NH3-N的质量(mg)表示。
[0073] 磷酸酶活性的测定，采用磷酸苯二钠比色法进行测定，酶活性以1g鲜土壤在单位时间内
水解对硝基苯磷酸三钠生成的对硝基酚含量表示，单位为μmol g-1 h-1。
[0074] 进一步，步骤四中，花生和棉花行间土壤水盐运移变化中，进行：
[0075] 土壤水分含量，采用烘干称量法测定；
[0076] 土壤盐分含量，在自然风干、
研磨并过20目筛后，称取20g土样，加入100 mL去离子水，按照水土比5：1制取土壤浸提液后，用电导率仪测定土壤浸提液电导率并计算土壤盐分含量。
[0077] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：
[0078] 本发明在盐碱地实施花生棉花间作轮作种植模式对合理开发利用盐碱地，实现可持续发展意义重大。在前期筛选花生棉花间作适宜模式的基础上，本发明以滨
海盐碱地花生棉花间作最优模式为分析对象，年际间交替轮作，采用传统的
土壤学和土壤微生物学方法，结合现代分子生物学技术，利用土壤微生物高通量分析技术分析根际土壤微生物群落多样性的变化，发掘根际土壤优势功能微生物，解析根际土壤优势功能微生物在盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式缓解连作障碍中的关键作用；揭示植株生长、根系分泌物、土壤酶和土壤水盐运移的变化特征；进而阐明盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式缓解连作障碍的土壤微生态机制，为该模式在盐碱地大面积应用推广提供理论依据和技术支撑。
[0079] 表1不同形式花生/棉花间作处理对花生的产量及产量构成因素的影响[0080]
[0081] 注：hd：花生单作；hn1-3：间作+尼龙网根系分隔的花生第1-3行；hs1-3：间作+塑料布根系分隔的花生第1-3 行；hw1-3：间作+无根系分隔的花生第1-3行；H1-3：花生与空白土地单作的第1-3行。
[0082] 表2不同形式花生/棉花间作处理对棉花的产量及产量构成因素的影响[0083]
[0084]
[0085] 注：md：花生单作；mn1-2：间作+尼龙网根系分隔的棉花第1-2行；ms1-2：间作+塑料布根系分隔的棉花第1-2行；mw1-2：间作+无根系分隔的棉花第1-2行；M1-2：棉花与空白土地单作。
[0086] 本发明采用花生/棉花“等幅间作”种植模式(6行花生/4行棉花，花生棉花等幅种植)，实施了与本发明一致的分析方法和试验处理设计，即利用大田根系分隔法，在青岛农业大学平度试验基地进行了先期试验(图7)。本试验主要对花生棉花的产量及产量构成因素等指标开展了先期分析。表1和表2的2018年产量数据表明，花生/棉花间作(无根系分隔处理)条件下，花生和棉花的产量及主要产量构成因素均显著高于塑料布根系分隔和尼龙网根系分隔处理，但均小于各自“单作+空白土地”处理，表明地下根系分隔处理通过某种途径降低了花生和棉花的产量。就花生产量来说，间作各处理的1-3行单株产量呈递增趋势，而“花生单作+空白土地”处理的1-3行单株产量呈递减趋势(表1)，这一发现进一步暗示了花生棉花间作系统的时空复杂性。
附图说明
[0087] 图1是本发明
实施例提供的盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法
流程图。
[0088] 图2是本发明实施例提供的盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法采取的技术路线图。
[0089] 图3是本发明实施例提供的棉花单作(左)和花生单作(右)种植示意图；
[0090] 图中：md：棉花单作的第1-2行；hd：花生单作的第1-3行。
[0091] 图4是本发明实施例提供的花生/棉花间作无隔根(a)、尼龙网隔根(b)和塑料布隔根(c)示意图；
[0092] 图中：mw1-2：间作+无隔根的棉花第1-2行，hw1-3:间作+无隔根的花生第1-3 行；mn1-2：间作+尼龙网隔根的棉花第1-2行，hn1-3：间作+尼龙网隔根的花生第1-3行；ms1-2：
间作+塑料布隔根的棉花第1-2行，hs1-3：间作+塑料布隔根的花生第1-3行。
[0093] 图5是本发明实施例提供的棉花带(a)和花生带(b)种植示意图；
[0094] 图中：m1-2：棉花与空白土地单作的第1-2行；h1-3：花生与空白土地单作的第1-3行。
[0095] 图6是本发明实施例提供的试验各小区大田布局示意图；
[0096] 图中：每个小方框代表每个小区，1-7表示处理1-7，每个处理4个重复，随机区组排列。
[0097] 图7是本发明实施例提供的2018年花生/棉花“等幅间作”试验部分时期大田生长情况效果图。
具体实施方式
[0098] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0099] 现有技术没有合理开展花生/棉花间作轮作能够调控土壤微生物多样性和群落结构，改变根系分泌物，提高土壤酶活性，影响土壤水盐运移，造成不能缓解土壤微生态连作障碍。
[0100] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0101] 如图1所示本发明实施例提供的盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法，在筛选出的6行花生/4行棉花，等幅种植的基础上，采用大田根系分隔试验法，进行盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植模式缓解连作障碍的土壤微生态机制；具体包括：
[0102] S101，分析花生/棉花间作轮作对2种作物生长、产量和经济效益的影响。
[0103] S102，测定棉花、花生功能叶片叶绿素及组分含量、光合速率和叶绿素荧光特性，确定棉花、花生的生长特性；测定花生和棉花的农艺性状，产量及产量构成因素；计算花生/棉花间作轮作的经济效益和土地当量比。
[0104] S103，花生/棉花间作轮作条件下2种作物根际土壤微生物群落多样性变化特征；收集不同处理花生和棉花的根际土壤，利用高通量测序分析花生和棉花根际土壤微生物群落多样性变化，利用生物信息学的分析方法鉴定和发掘根际土壤优势功能微生物。
[0105] S104，花生/棉花间作轮作条件下2种作物根系分泌物、土壤酶活性和土壤水盐运移变化特征：对花生和棉花根系分泌物进行定性和定量分析，确定花生和棉花根系分泌物的组成；测定不同处理土壤中过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶和磷酸酶的活性，分析花生和棉花土壤酶活性的变化特性；测定不同处理土壤水分含量和总盐分含量，确定花生和棉花土壤水盐运移的时空变化特性。
[0106] 在本发明实施例中，本发明盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式下根际土壤微生物群落多样性的变化，发掘根际土壤优势功能微生物。同时结合植株生长、根系分泌物、行间土壤酶和土壤水盐运移的变化特征确定这些指标间的相互关系，进而揭示盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式缓解连作障碍的土壤微生态机制，为该种植模式在盐碱地大面积应用推广提供理论依据和技术支撑。
[0107] 本发明明确盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式下根际土壤微生物群落多样性的变化，发掘根际土壤优势功能微生物；阐明盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式下植株生长、根系分泌物、行间土壤酶活性和土壤水盐运移的变化特征；综合以上因素，揭示花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式缓解盐碱地花生棉花连作障碍的土壤微生态机制。
[0108] 下面结合效果对本发明作进一步描述。
[0109] 本发明合理开展花生/棉花间作轮作能够调控土壤微生物多样性和群落结构，改变根系分泌物，提高土壤酶活性，影响土壤水盐运移，进而可能有助于缓解连作障碍。基于此，本发明以滨海盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式为切入点，结合大田根系分隔法，阐明间作轮作条件下花生棉花根际土壤微生物群落多样性的变化，发掘根际土壤优势功能微生物。同时结合植株生长、根系分泌物、行间土壤酶和土壤水盐运移的变化特征，揭示盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式缓解连作障碍的土壤微生态机制。
[0110] 下面结合具体试验对本发明作进一步描述。
[0111] 试验设计：
[0112] (1)试验在青岛农业大学“黄河三
角洲盐碱地综合利用及生态农业分析中心”(E 118°29’15”，N 37°49’24”)进行，该试验基地位于山东省东营市利津县汀罗镇毛坨村，属于滨海盐碱地。该地区属暖温带半湿润季风
气候，四季分明，雨热同季，光照充足，气候温和。
年平均气温为13.3℃，年平均降雨量为526.2mm，年平均蒸发量为1724.3mm，年平均日照时数为2834.7h。
[0113] 选择地力均匀平整的
地块进行大田试验，前期测得平均土壤含盐量0.51％ (0-20cm表层土，属于重度盐碱地。试验地前茬连续种植耐盐碱蔬菜十年以上。大田试验开展中，试验采用品种为较耐盐花生品种“花育25”以及较耐盐棉花品种“鲁棉研37”。播种后按照750kg/hm2施用复合肥(氮磷钾含量：(N+P2O5+K2O) ＝6％)作为基肥。
[0114] (2)试验设置7个处理如下：
[0115] 处理1：棉花单作，根系不分隔，大小行种植，小行距60cm，大行距80cm，株距25cm，3811株/亩(图3左)。
[0116] 处理2：花生单作，根系不分隔，垄距90cm，垄上小行距30cm，大行距 60cm，一穴2粒，穴距17cm，8719穴/亩(图3右)。
[0117] 处理3：花生/棉花间作，根系不分隔，棉花带宽270cm，种植4行棉花，小行距60cm，大行距80cm，边行离花生带35cm，株距25cm；花生带宽270cm，种植3垄花生，垄距90cm，垄上小行距30cm，大行距60cm，边行离棉花带30cm，穴距17cm，一穴2粒(图4a)。
[0118] 处理4：花生/棉花间作，在棉花带和花生带之间用300目尼龙网(根系不能通过，但水分、养分和盐分可以通过)进行根系分隔，深度100cm，其余同处理3 (图4b)。
[0119] 处理5：花生/棉花间作，在棉花带和花生带之间用塑料布(根系、水分、养分和盐分均不能通过)进行根系分隔，深度100cm，其余同处理3，(如图4c)。
[0120] 处理6：按花生/棉花间作设置，但花生带不种植任何植物的对照处理(图5a)。处理7：按花生/棉花间作设置，但棉花带不种植任何植物的对照处理(如图5b)。
[0121] 每个处理的小区面积均为81m2(带宽5.4m，带长15m)，各处理重复4次， 28个小区在试验田中按照随机区组排列。第3-5处理的花生和棉花第二、三年度交替轮作，三年内各小区的位置保持不变。试验各小区大田布局(如图6)。
[0122] (3)测定项目与方法
[0123] 本试验的三次取样测定时期为花生的以下关键生育时期：
[0124] 开花下针期，50％植株开花后第15天取样。
[0125] 结荚期，50％植株出现鸡头状幼果后第15天取样。
[0126] 饱果成期，50％植株出现饱果后第15天取样。
[0127] (4)花生棉花生长指标、产量及产量构成因素
[0128] 生长指标：花生的主茎高和节数、侧枝长度和节数、总分枝数、单株叶面积、根瘤数、根长、根表面积和根体积。棉花的株高、主茎节间长度、果枝始节、果枝数、单株叶面积、单株结铃数、脱落率、吐絮率。
[0129] 各处理花生第1行和棉花第1行的全展顶3叶(功能叶片)光合速率采用美国产Li-6800便携式光合测定仪测定(测定时间为晴朗天气的上午9：00-11：00)；采用便携式叶绿素荧光仪(Pam 210)测定以上叶片的叶绿素荧光特性。同时收集以上叶片，采用乙醇丙酮提取法测定叶绿素及其组分含量。
[0130] 产量及产量构成因素：于花生成熟期测定百果重、百仁重、饱果率、单株果数、单株产量和理论产量等。于棉花成熟期测定单株铃数、单株铃重、衣分、子棉产量和皮棉产量等。
[0131] (4)花生棉花根际土壤微生物群落多样性分析
[0132] 样品采集：选取各处理第1行花生和第1行棉花植株(3个重复)，去掉附着在根系0-5cm的表土，用毛刷轻刷粘附在根系表面的土壤(每取一个样品均更换一个新毛刷，避免样品交叉污染)，混合均匀后用无菌封口袋包扎密封，迅速置于装有干冰的泡沫盒中，带回实验室进行下一步处理。
[0133] 根际土壤微生物基因组DNA的提取及检测：使用OMEGA E.Z.N.A DNA试剂盒提取各样本的基因组DNA。
[0134] 目标区域16S rDNA的PCR扩增：16S rDNA为原核生物的核糖体特征编码序列，常用于细菌以及古细菌的物种分类以及进化关系分析。微生物多样性测序是一种利用高通量测序技术对PCR所扩增的16S等微生物物种特征序列进行检测的分析方法。用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区。引物序列如下：
[0135] 341F:5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’SEQ ID NO：1。
[0136] 806R:5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’SEQ ID NO：2。
[0137] PCR反应体系参照广州基迪奥生物科技有限公司提供的体系进行。扩增产物在 2％琼脂糖凝胶进行电泳，切取目的条带，回收后使用Tris-HCl洗脱，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图进行初步定量。冰冻保存样品并送广州基迪奥生物科技有限公司构建测序文库，Hiseq2500 PE250上机高通量测序。
[0138] (5)测序及分析流程：
[0139] (i)根据barcode将大量的测序结果回归样本。
[0140] (ii)通过严密准确的程序，统计测序结果中的最终优化序列。
[0141] (iii)OTU(Operational Taxonomic Units)聚类分析。
[0142] (iv)样品OTU分布的比较：统计多个样品中所共有的OTU数目可以反映环境样品的相似性及重叠情况。
[0143] (v)菌群多样性指数分析(Alpha-diversity)：通过单样本的多样性分析 (Alpha多样性)，可以反映微生物群落的丰度和多样性。
[0144] (vi)稀释曲线(Rarefaction curve)：检测样品的测序深度情况。
[0145] (vii)PCA(Principal Component Analysis)主成分分析：反映不同样品中微生物群落组成的相似性以及影响微生物多样性的主要因素。
[0146] RDA(Redundancy Analysis)冗余分析：进行与环境因子相关的微生物的筛选；
[0147] (viii)CCA(Canonical Correspondence Analysis)典范对应分析：分析微生物群落与环境因子的相互关系。
[0148] 通过以上测序和分析，揭示不同处理之间花生棉花根际土壤微生物群落结构及其多样性的差异，发掘根际土壤优势功能微生物，并进一步阐明这些微生物群落在花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植系统中发挥的关键作用，从根际土壤优势功能微生物的角度揭示该种植模式缓解连作障碍的生物学机制。
[0149] (6)花生棉花根系分泌物分析：
[0150] 收集：选取各处理1、2、3行花生和1、2行棉花植株(3个重复)，先用清水冲洗3-5次，洗掉附着的泥土，之后用去离子水将根部清洗干净,并放到1000mL 0.5mmol·L-1
氯化钙溶液中。用黑纸包裹好烧杯，避光收集6h根系分泌物。
[0151] 提取：将收集好的根系分泌物经多用
真空泵抽取过滤，将得到的澄清溶液用乙酸乙酯按2：1的体积比例萃取3次，得到乙酸乙酯相为中性成分；将水相用1mol·L-1 HCl调节pH至3，再用同体积乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为酸性组分；将水相再用11mol·L-1 NaOH调节pH至8，用同体积乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯相为碱性组分，将酸性、碱性和中性(原液)乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干(提取液过0.45μm膜后，用
旋转蒸发仪蒸至10mL，再用氮吹仪吹干，整个操作过程用乙酸乙酯润洗，将提取液冷冻干燥)。上机测定前进行柱前衍生化，在冻干的提取液加入0.5mL硅烷化试剂(Regisil试剂)，加盖密封后于80℃水浴 2h，冷却后用0.45μm膜过滤，取1.0mL作GC-MS定性分析。
[0152] 定性分析：采用美国Thermo公司Trace-ISQ型气相色谱-质谱联用仪。色谱(GC)条件：石英毛细管株TR-5MS(30mm×0.25mm×0.25μm)，进样口温度为250℃，进样量1.0μL；分流(分流比20：1)：载气为氦气(He)，流速1 mL·min-1。质谱(MS)条件：电子轰击源(EI)电子能量70eV，扫描范围45-500 amu，扫描速度0.2s，接口温度250℃，离子源温度250℃，溶剂延迟时间为4.0 min。通过GC-MS分析后得到总离子流色谱图，采用标准质谱库定性，通过计算机在NIST2011质谱数据库查找核对并结合人工分析进行物质的鉴定。
[0153] 定量分析：吸取正十八烷0.05mL溶于1000mL CH2Cl2中，用CH2Cl2配置成含有正十八烷1、5、10、20、50、100mg·L-1 6个浓度梯度的标准溶液；吸取乙基苯0.01mL溶于1000mL CH2Cl2中，用CH2Cl2配置成含有乙基苯0.1、0.2、 0.5、1、2、5mg·L-1 6个浓度梯度的标准溶液；称取乙酸乙酯0.01g溶于CH2Cl2中，用CH2Cl2配置成含有乙酸乙酯1、2、5、10、20、40mg·L-1 6个浓度梯度的标准溶液。3种物质的6个浓度梯度的标准溶液进行GC-MS分析，并进行线性回归分析，根据各组分的保留时间确定3种物质的色谱峰，由标准曲线的回归方程计算得到各物质的浓度。
[0154] (7)花生和棉花行间土壤酶活性测定
[0155] 在各处理花生1-2行，2-3行中间位置，棉花1-2行中间位置，以及花生第1 行距棉花带10cm位置和棉花第1行距花生带10cm位置，采用电动土钻挖取 0-20cm，20-40cm以及40-60cm三个深度土壤样品(3个重复)，用封口袋包扎密封，迅速置于装有干冰的泡沫盒中，带回实验室进行土壤相关酶活性测定。
[0156] 过氧化氢酶活性的测定采用容量法，用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量 (毫升数)为A。(A-B)×T即为过氧化氢酶活性。
[0157] 脲酶活性的测定采用苯酚钠比色法进行测定，酶活性以提取液恒温培养24h 后1g土壤中NH3-N的质量(mg)表示。
[0158] 磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法进行测定，酶活性以1g鲜土壤在单位时间内水解对硝基苯磷酸三钠生成的对硝基酚含量表示(μmol g-1h-1)。
[0159] (8)花生和棉花行间土壤水盐运移变化
[0160] 取样方式同行间土壤酶活性测定。
[0161] 土壤水分含量，采用烘干称量法测定；
[0162] 土壤盐分含量，在自然风干、研磨并过20目筛后，称取20g土样，加入100 mL去离子水，按照水土比5：1制取土壤浸提液后，用电导率仪测定土壤浸提液电导率并计算土壤盐分含量。在本发明中，根际土壤微生物的提取，群落结构和多样性的高通量测序分析，以及根际土壤优势功能微生物的鉴定和功能分析是本发明的关键技术。
[0163] 在本发明中，针对克服盐碱地花生棉花连作障碍的土壤微生态机制进行分析。业内对花生/棉花间作的植物生理机制方面分析较为广泛，但对土壤微生态方面的分析不足。本分析从土壤微生态的角度揭示了盐碱地花生/棉花间作轮作缓解连作障碍的机制，为该种植系统在盐碱地推广应用提供理论支撑。
[0164] 本发明在方法上，使用了大田根系分隔试验方法，并结合分子生物学和高通量测序技术分析土壤微生物功能多样性，阐明根际土壤优势功能微生物对花生/棉花间作轮作种植系统的贡献，丰富了间作轮作系统的分析方法。
[0165] 本发明着眼于挖掘和拓展花生/棉花间作轮作种植模式，对支撑滨海盐碱地开发与利用的相关理论与技术有直接参考价值。
[0166] 本发明探明盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式下根际土壤微生物群落多样性变化，发掘并解析根际土壤优势功能微生物在缓解连作障碍中的关键作用。
[0167] 本发明揭示盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式下植株生长、根系分泌物、行间土壤酶和土壤水盐运移的变化特征。
[0168] 综合分析以上结果，本发明阐明盐碱地花生/棉花“等幅间作交替轮作”种植模式缓解连作障碍的土壤微生态机制。
[0169] 下面结合具体大田实施工作对本发明作进一步描述。
[0170] 本发明采用花生/棉花“等幅间作”种植模式(6行花生/4行棉花，花生棉花等幅种植)，实施了与本发明一致的分析方法和试验处理设计，即利用大田根系分隔法，在青岛农业大学平度试验基地进行了先期试验(图7)。本试验主要对花生棉花的产量及产量构成因素等指标开展了先期分析。表1和表2的2018年产量数据表明，花生/棉花间作(无根系分隔处理)条件下，花生和棉花的产量及主要产量构成因素均显著高于塑料布根系分隔和尼龙网根系分隔处理，但均小于各自“单作+空白土地”处理，表明地下根系分隔处理通过某种途径降低了花生和棉花的产量。就花生产量来说，间作各处理的1-3行单株产量呈递增趋势，而“花生单作+ 空白土地”处理的1-3行单株产量呈递减趋势(表1)，这一发现进一步暗示了花生棉花间作系统的时空复杂性。
[0171] 先期分析结果初步指向了地下部分，如根际土壤微生物、根系分泌物、土壤酶活性以及土壤水盐运移等指标对花生棉花的影响，即土壤微生态系统在花生/棉花间作轮作种植系统缓解连作障碍中扮演重要角色。
[0172] 本发明应用的全部仪器设备有：LI-6800型便携式光合仪、根系扫描分析系统、电导率测定仪、Pam210便携式叶绿素荧光仪、Trace-ISQ型气相色谱-质谱联用仪、旋转蒸发仪、
原子吸收分光光度计、紫外可见分光光度计、Bio-Rad牌PCR 仪、恒温冷柜以及Thermo牌超低温
冰箱等先进仪器设备，能够较好地进行花生棉花光合生理、水分生理、土壤酶学实验以及微生物学实验等方面的分析。
[0173] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0174]
