식품가공 부산물인 간장박을 이용한 고분자 중합체 풀루란의 제조방법{Process for Preparing of Pullulan Employing By-product from Soybean Source Fermentation}

본 발명은 발효 간장의 대량생산 과정에서 발생하는 부산물인 간장박을 풀루란 생산 배지의 질소원으로 이용한 고분자 중합체 풀루란의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 질소원으로서 식품가공 부산물인 간장박을 첨가한 배지에 풀루란을 생산하는 미생물을 배양하고 상기 배양액으로부터 고분자 중합체 풀루란을 분리 추출하는 제조방법에 관한 것이다.

대부분의 미생물들은 전분 또는 포도당과 같은 탄소원과 효모 추출액, 염화암모늄, 폐당밀 등의 질소원을 포함하는 영양원과 적당한 환경에서 생육을 시작하며, 그 중에는 우리 생활에 필요한 고분자 중합체를 생산하는 미생물들도 있다. 미생물이 생산하는 고분자 중합체로는 풀루란(pullulan), 잔탄(xanthan), 커드란(curdlan), 젤란(gellan) 등의 교질화제, 유화제, 안정제 및 젤이 이에 속하며, 식품산업 및 화공산업에 널리 사용되고 있다. 이와 같은 고분자 중합체는 국내에서 생산되지 않고, 전량을 외국에서 수입하고 있는데, 1997년의 수입액은 약 800억원 정도이었으며, 식품의 질을 향상시키기 위하여 필수 불가결한 물질이므로 수입량은 계속 증가할 것이다.

특히, 식품 및 화학공업에 필요한 풀루란은 일본에서 전량 수입하여 사용하고 있는데, 이는 풀루란의 생산비용이 외국에서 수입하는 비용 보다 비싸기 때문이다. 따라서, 풀루란을 생산하는 기술을 획기적으로 개발하여 생산단가를 보다 더 낮추거나, 보다 저렴한 배지를 사용하여 직접 생산비를 낮추어야 할 것이나, 이에 대한 국내의 기술은 미미한 실정이다.

한편, 필요한 산물을 생산하는 과정에서 필수 불가결하게 부가적으로 생산되는 환경 오염성 폐기물 및 부산물의 이용에 대한 연구는 환경 및 자원의 재활용적 측면에서 많은 연구자들에 의하여 진행되어 왔다. 상기 식품가공 부산물 중, 발효법에 의한 간장의 대량 생산 과정에서 발생되는 간장박 이에 속한다. 즉, 발효가 끝난 후에 배양액을 착즙하여 간장을 분리하고 난 찌꺼기인 간장박은 생산규모에따라 매 회 10 내지 20톤 이상 발생되며 수분함량이 비교적 낮고 전체 탄수화물의 농도가 약 20%, 조단백의 함량이 약 30% 이상 되기 때문에, 일반적인 정화시설 및 방법으로는 정화가 불가능하여 특수 정화업체에 의뢰하고 있는 실정이다. 따라서, 식품가공산업의 폐기물 및 부산물을 미생물의 영양원으로 개발하여 고분자 중합체를 생산할 수 있다면, 이는 환경오염의 원천적인 방지와 이를 이용한 고부가가치의 산물을 생산한다는 측면에서 매우 중요한 의미를 지닌다고 할 것이다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 풀루란을 생산하는 미생물을 식품가공 부산물인 간장박을 포함하는 배지에 접종하여 배양한 종균 배양액을 3 내지 5%(v/v)로 상기 배지에 재접종하고 상기 배지에서 3 내지 7일 동안 배양한 다음 원심분리하여 얻어진 상등액에 유기용매를 가하여 추출 및 원심분리하고 상기 얻어진 침전물을 증류수에 용해시킨 후, 투석하고 진공 동결건조함으로써 물성이 향상된 우수한 품질의 풀루란을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 식품가공 부산물인 간장박을 이용한 고분자 중합체 풀루란의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조한 물성이 향상된 우수한 품질의 풀루란을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 발효간장의 대량생산 과정에서 발생하는 부산물인 간장박을 식품분석법으로 성분분석하고 상기 간장박을 배지에 질소원으로 함유시켜풀루란을 생산하는 미생물을 접종하여 배양하고, 상기 배양액으로부터 풀루란을 추출 및 정제하여 풀루란을 제조하고, 상기 제조한 풀루란을 박막 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피로 분석하고 생산성을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 본 발명 풀루란의 바람직한 제조방법을 도식적으로 나타낸 공정도이다.

도 2는 질소원에 따른 본 발명의 풀루란의 생산 수율을 나타낸 그래프이다.

도 3은 간장박의 농도에 따른 본 발명의 풀루란의 생산 수율과 분자량을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박을 식품분석법으로 성분분석 하는 단계; 질소원으로서 간장박을 포함하는 배지에 풀루란을 생산하는 미생물을 접종하여, 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 24 내지 48시간 동안 배양한 종균 배양액을 상기 배지에 3 내지 5%(v/v)로 접종하고, 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 3 내지 7일 동안 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 상기 수득된 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액에 유기용매를 가하여 추출하고, 상기 추출액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계; 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후, 투석하여 투석 내부분획을 수득하고, 상기 투석 내부분획을 진공 동결건조하여 고분자 중합체 풀루란을 제조하는 단계; 상기 제조한 풀루란을 박막 크로마토그래피와 가스 크로마토그래피를 사용하여 분석하는 단계; 본 발명 제조방법으로 제조한 풀루란과 기존의 제조방법인 효모 추출물을 이용하여 제조한 풀루란의 생산성을 비교하는 구성된다.

이하, 본 발명의 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박을 이용한 고분자 중합체 풀루란의 제조방법을 공정별로 나누어 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 배양액의 수득

풀루란을 생산하는 미생물을 질소원으로서 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박이 함유된 배지에 접종하여, 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 24 내지 48시간 동안 배양한 종균 배양액을 상기 배지에 3 내지 5%(v/v)로 접종하고, 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 3 내지 7일 동안 배양하여 배양액을 수득한다: 상기 풀루란을 생산하는 미생물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 균주를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아우레오바시디움 풀루란스( Aureobasidium pullulans )을 사용한다. 또한, 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박을 전체 배지성분에 대하여 0.1 내지 1.5%(w/v)로 하여 사용하며, 배지는 3 내지 5g/L의 K ₂ HPO ₄ , 0.01 내지 1g/L의 MgSO ₄ ·7H ₂ O, 0.3 내지 1.5g/L의 (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.5 내지 3.0g/L의 NaCl 및 20.0 내지 100.0g/L의 포도당이 포함된 것을 사용한다.

제 2공정: 배양액 추출

제 1공정에서 수득된 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액에 유기용매를 가하여 추출하고, 상기 추출액을 원심분리하여 침전물을 수득한다: 상기, 원심분리는 5000 내지 9000×g의 범위에서 10 내지 30분 동안 실시하고, 유기용매는 이소프로판올 또는 에탄올을 사용한다.

제 3공정: 풀루란의 제조

제 2공정에서 획득한 침전물을 증류수에 용해시킨 후, 투석하여 투석 내부분획을 수득하고, 상기 투석 내부분획을 진공 동결건조한다: 상기, 투석은 배제 분자량이 10,000 내지 15,000인 것을 사용하여 1 내지 5일 동안 증류수를 3 내지 7회 교체함으로써 수행한다.

본 발명에서 아우레오바시디움 풀루란스( Aureobasidium pullulans )은 미국종균협회 (American Type Culture Collection)에서 구입하였으며 미국종균협회의 등록번호는 ATCC 42023이다.

본 발명 고분자 중합체 풀루란의 제조방법은 풀루란의 분리 및 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 획득할 수 있다.

이하, 실시예를 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

실시 예 1: 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박의 성분분석

발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박의 성분을 검정된 식품분석법(식품분석, 김경삼외, 효일문화사, 1999)에 의하여 분석하였다. 일정 시간 발효된 배양액을 착즙하여 간장을 수거한 찌꺼기인 간장박의 수분함량은 11%(v/v)이었으며, 각각의 구성성분은 표 1에 나타내었다.

실시예 2 : 질소원으로서 간장박을 이용한 풀루란의 제조

풀루란을 생산하기 위한 배지의 조성은 5g/L의 K ₂ HPO ₄ , 0.2g/L의 MgSO ₄ ·7H ₂ O, 0.6g/L (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 1.0g/L의 NaCl 및 0.5 내지 5.0g/L 간장박으로 구성되었고, 탄소원으로 포도당을 멸균한 후 멸균된 배지에 무균적으로 2%(w/v)으로 혼합하여 사용하였다. 전배양은 고체 배지에서 일정시간 배양한 아우레오바시디움 풀루란스( Aureobasidium pullulans , ATCC 42023)을 한 백금니 취하여 250㎖ 용량의 플라스크에 멸균하여 준비된 50㎖의 배지에 접종한 후, 30℃에서 180rpm의 진탕 속도로 48시간 진탕 배양하였다. 본배양은 전배양한 배양액을 500㎖ 용량의 플라스크에 멸균되어 준비된 150㎖의 동일 배지에 5%(v/v)를 접종하여 전배양과 동일한 방법으로 5일간 배양하였다. 상기 배양액을 8000×g의 범위에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거한 상등액을 회수하였다. 상기 회수한 상등액에 2배 용량의 95% 에탄올을 첨가하고, 잘 혼합하여 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 이 용액을 8000×g의 범위에서 20분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후, 침전물을 95% 에탄올로 2∼3회 세척하였다. 세척한 침전물을 적당한 양의 증류수에 용해시킨 다음, 2∼3일 동안에 4∼5회 증류수를 바꾸어 주면서 투석하여 염성분을 포함한 저분자 물질을 제거하였다. 사용된 투석막은 배제 분자량 12,000∼14,000인 것을 사용하였으며, 투석 후 풀루란을 진공 동결건조하여 건조물을 회수하였다.

비교 실시예 1: 질소원으로서 효소 추출물을 이용한 풀루란의 제조

상기 간장박을 이용하여 제조한 풀루란을 효소 추출물을 질소원으로 사용하여 제조한 풀루란과 비교하기 위하여 효소 추출물을 배지에 첨가하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다.

실시예 3: 본 발명 제조방법으로 제조된 풀루란의 분석

상기 실시예 2 및 비교 실시예 1에서 제조된 풀루란을 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)와 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)를 사용하여 분석하였다. 상기 실시예 및 비교실시예에서 제조한 풀루란을 1N HCl을 사용하여 100℃에서 2시간 가수분해시킨 후, 박막 크로마토그래피를 실시하였으며, 시판되는 풀루란(Sigma Co., USA)을 대조구로 사용하였다. 박막 크로마토그래피의 전개용매는 부탄올, 피리딘 및 증류수를 6:4:3의 비율(v/v/v)로 혼합한 용액을 사용하였으며, 아닐린(aniline)과 디페닐아민(diphenylamine)을 각각 1%(v/v)의 농도로 아세톤에 만든 용액(5㎖)과 85% 인산용액(1㎖)을 혼합하여 만든 용액을 발색시약으로 사용하여 전개된 풀루란을 확인하였다.

한편, 가스 크로마토그래피(GC Model 5890, Hewlett-Packard, USA)는 헬륨을 이동상으로 사용하고, 주입속도는 1.2㎖/분, 압력은 16.5기압으로 진행하였다. 분석은 시료 주입시 200℃로 3분 동안 유지시키고, 1분당 8℃씩 증가하여 280℃에서 실시하였으며, 시판되고 있는 풀루란(Sigma Co., USA)을 대조구로 사용하여 확인하였다.

실시예 4: 풀루란의 생산성 비교

실시예 2 및 비교 실시예 1에서 제조된 풀루란의 생산성 결과를 표 2와 도 2에 나타내었다. 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, 간장박은 종래의 풀루란 생산 배지의 질소원인 효모 추출물의 경우보다 높은 생산성을 나타내었다. 이는 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박이 풀루란 생합성의 최적 질소원으로 사용할 수 있다는 것이며, 이와 같은 결과는 풀루란을 생산하기 위한 직접 생산비를 50% 이상 절감할 수 있음을 의미한다. 또한 도 3에 나타난 바와 같이 간장박을 사용하여 제조한 풀루란의 분자량이 기존 배지의 질소원인 효모 추출액을 사용하여 제조한 풀루란에 비하여 3 내지 6배가 크므로 물성이 향상된 우수한 품질의 풀루란을 제조할 수 있음을 확인하였다. 풀루란의 생산성 증가에 따른 생산 설비와 간접 생산비의 절약 및 환경 오염물질의 정화에 소요되는 비용의 감소까지를 고려한다면, 대체할 수 있는 효모 추출물의 원가 이상의 생산비를 절감하는 결과이다.

이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 질소원으로서 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박을 배지에 첨가함으로써 고분자 중합체 풀루란을 경제적으로 제조하고, 풀루란의 제조시 질소원으로서 사용되는 효모 추출물을 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박으로 대체하여 사용하기 때문에 직접생산비의 약 60%를 절감할 수 있으며, 특히, 풀루란의 생산성을 약 65% 향상시키는 효과가 있을 뿐만 아니라 발효식품 제조 공정의 부산물인 간장박을 질소원으로 사용하기 때문에, 환경오염원의 정화를 위한 처리비용을 절감시킬 수 있는 효과가 있고, 또한 간장박을 사용하여 제조한 풀루란의 분자량이 기존 배지의 질소원인 효모 추출액을 사용하여 제조한 풀루란에 비하여 3내지 6배가 크므로 물성이 향상된 우수한 품질의 풀� �란을 제조하는 효과가 있으므로 식품제조산업상 및 화공산업상 매우 유용한 발명인 것이다.