고농도 당성분을 포함하는 식품가공 부산물을 이용한 다당류 고분자 중합체 피에스-7의 제조방법{Process for Preparing PS-7 (heteropoly- saccharide-7) Employing Waste Materials Containing High Concentration of Sugars from Food-processing Industry}

본 발명은 고농도 당성분을 포함하는 식품가공 부산물을 이용한 다당류 고분자 중합체 피에스-7의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 탄소원으로서 고농도 당성분을 포함하는 식품가공 부산물인 밥당화폐액, 엿기름 당화폐액 또는 사과박을 첨가한 배지에 피에스-7을 생산하는 미생물을 배양하고 상기 배양액으로부터 다당류 고분자 중합체 피에스-7을 분리 추출하는 제조방법에 관한 것이다.

대부분의 미생물들은 전분 또는 포도당과 같은 탄소원과 효모 추출액, 염화암모늄, 폐당밀 등의 질소원을 포함하는 영양원과 적당한 환경에서 생육을 시작하며, 그 중에는 우리 생활에 필요한 고분자 중합체를 생산하는 미생물들도 있다. 미생물이 생산하는 고분자 중합체로는 젤란(gellan), 잔탄(xanthan), 커드란(curdlan), 풀루란(pullulan) 등의 교질화제, 유화제, 안정제 및 젤이 이에 속하며, 상기 고분자 중합체들은 식품산업 및 화공산업에 널리 사용되고 있다. 이와 같은 고분자 중합체는 국내에서 생산되지 않고, 전량을 외국에서 수입하고 있는데, 1997년의 수입액은 약 800억원 정도이었으며, 식품의 질을 향상시키기 위하여 필수 불가결한 물질이므로 수입량은 계속 증가할 것이다. 피에스-7은 현재 미국에서 독점 생산하여 수입하고 있는 젤란의 기능성을 향상시킨 다당류 고분자 중합체로 수년 내에 젤란 시장을 대처할 차세대 기능성 고분자 물질이다. 국내의 수요는 물론 국제시장에서 피에스-7의 가격 경쟁적인 면에서 우위를 갖추기 위하여 생산 기술을 획기적으로 개발하거나, 보다 저렴한 배지를 사용하여 직접 생산비를 낮추어야 할 것이나, 이에 대한 국내의 기술은 전무한 실정이다.

한편, 필요한 산물의 생산에 부가적으로 생산되는 환경 오염성 폐기물 및 부산물의 이용에 대한 연구는 환경 및 자원의 재활용적 측면에서 많은 연구자들에 의하여 진행되어 왔다. 상기 식품가공 부산물 중, 고농도 당성분을 포함하는 식품가공 부산물에는 전통음료 중의 하나인 식혜의 대량 생산과정에서 필수 불가결하게발생하는 고농도 당성분을 포함하는 부산물 즉, 밥당화폐액 및 엿기름 당화폐액과 사과를 착즙하여 사과쥬스를 생산하는 공정에서 필수 불가결하게 발생되는 부산물인 사과박이 이에 속한다. 식혜 및 사과쥬스의 대량생산 공정에서 생산규모에 따라 1일에 10 내지 20톤 이상 발생되는 상기 고농도 당성분을 포함하는 부산물의 전체 당 농도는 약 20%가 되기 때문에, 일반적인 정화시설 및 방법으로는 정화가 불가능하여 특수 정화업체에 의뢰하고 있는 실정이다. 따라서, 식품가공산업의 폐기물 및 부산물을 미생물의 영양원으로 개발하여 산업적으로 필요한 고분자 중합체를 생산할 수 있다면, 이는 환경오염의 원천적인 방지와 이를 이용한 고부가가치의 산물을 생산한다는 측면에서 매우 중요한 의미를 지닌다고 할 것이다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 피에스-7을 생산하는 미생물을 고농도 당성분을 포함하는 밥당화폐액, 엿기름 당화폐액 또는 사과박 같은 식품가공 부산물이 함유된 배지에 접종하여 배양한 종균배양액을 3 내지 5%(v/v)로 상기 배지에 재접종하고 2 내지 5일 동안 배양한 다음 원심분리하여 얻어진 상등액에 유기용매를 가하여 추출 및 원심분리하고 상기 얻어진 침전물을 증류수에 용해시킨 후, 투석하고 진공 동결건조하여 다당류 고분자 중합체 피에스-7을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고농도 당성분을 포함하는 식품가공 부산물을 이용한 다당류 고분자 중합체 피에스-7의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 식품가공 부산물로서 전통식품 중의 하나인 식혜의 대량생산과정과 사과를 착즙하여 사과쥬스를 생산하는 공정에서 필수 불가결하게 발생하는 고농도 당성분을 포함하는 부산물 즉, 밥당화폐액, 엿기름 당화폐액 또는 사과박을 액체 크로마토그래피 또는 식품분석법으로 성분분석하고, 이들 각각을 배지에 탄소원으로서 함유시켜 피에스-7을 생산하는 미생물을 접종 배양하고, 상기 배양액으로부터 피에스-7을 추출 및 정제하여 피에스-7을 제조하고, 상기 제조된 피에스-7을 박막 크로마토그래피와 가스 크로마토그래피를 사용하여 분석하고 생산성을 비교함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 본 발명 피에스-7의 바람직한 제조방법을 도식적으로 나타낸 공정도이다.

도 2는 탄소원에 따른 본 발명의 피에스-7의 생산 수율을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 고농도 당성분을 포함하는 식품가공 부산물인 밥당화폐액과 엿기름 당화폐액 및 사과박의 성분을 액체크로마토그래피와 식품분석법으로 성분분석하는 단계; 탄소원으로 밥당화폐액, 엿기름 당화폐액, 사과박을 포함하는 배지에 피에스-7을 생산하는 미생물을 배지에 접종하여, 25 내지 35℃에서 150 내지 250rpm으로 24 내지 72시간 동안 배양한 종균 배양액을 상기 배지에 3 내지 5%(v/v)로 접종하고, 25 내지 35℃에서 150 내지 250rpm으로 2 내지 5일 동안 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 상기 수득된 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액에 유기용매를 가하여 추출하고, 상기 추출액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계; 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후, 투석하여 투석 내부분획을 수득하고, 상기 투석 내부분획을 진공 동결건조하여 다당류 고분자 중합체 피에스-7을 제조하는 단계; 상기 제조된 피에스-7을 박막 크로마토그래피와 가스 크로마토그래피를 사용하여 분석하는 단계; 본 발명 제조방법을 이용하여 제조한 피에스 7과 기존의 제조방법인 포도당을 이용하여 제조한 피에스-7의 생산성을 비교하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 식품가공 부산물을 이용한 다당류 고분자 중합체 피에스-7의 제조방법을 공정별로 나누어 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 배양액의 수득

피에스-7을 생산하는 미생물을 탄소원으로서 고농도 당성분을 포함하는 식품가공 부산물이 함유된 배지에 접종하여, 25 내지 35℃에서 150 내지 250rpm으로 24 내지 72시간 동안 배양한 종균 배양액을 상기 배지에 3 내지 5%(v/v)로 접종하고, 25 내지 35℃에서 150 내지 250rpm으로 2 내지 5일 동안 배양하여 배양액을 수득한다; 상기 피에스-7을 생산하는 미생물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 균주를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아조토박터 인디카( Azotobacter indica ) 를 사용한다. 또한, 상기 식품가공 부산물로서는 밥당화폐액, 엿기름 당화폐액 또는 사과박을 전체 배지성분에 대하여 1 내지 10%(w/v 또는 w/v)로 사용하며, 배지는 3 내지 5g/L의 K ₂ HPO ₄ , 0.01 내지 1g/L의 MgSO ₄ ·7H ₂ O, 0.5 내지 2.0g/L의 NH ₄ NO ₃ (Sigma Co., USA) 및 0.1 내지 2.0g/L의 박토펩톤 (Difco Lab., USA)이 포함된 것을사용한다.

제 2공정: 배양액 추출

제 1공정에서 수득된 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액에 유기용매를 가하여 추출하고, 상기 추출액을 원심분리하여 침전물을 수득한다: 상기 원심분리는 5000 내지 9000×g의 범위에서 10 내지 30분 동안 실시하고, 유기용매는 에탄올 또는 이소프로판올을 사용한다.

제 3공정: 피에스-7의 제조

제 2공정에서 획득한 침전물을 증류수에 용해시킨 후, 투석하여 투석 내부분획을 수득하고, 상기 투석 내부분획을 진공 동결건조한다: 상기, 투석은 배제 분자량이 10,000 내지 15,000인 것을 사용하여 1 내지 5일 동안 증류수를 3 내지 7회 교체함으로써 수행한다.

본 발명에서 아조토박터 인디카( Azotobacter indica )는 미국종균협회 (American Type culture collection)에서 구입하였으며 미국종균협회의 등록번호는 ATCC 21423이다.

본 발명 다당류 고분자 중합체 피에스-7의 제조방법은 피에스-7의 분리 및 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 획득할 수 있다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 고농도 당성분을 포함하는 식품가공 부산물의 성분분석

밥당화폐액과 엿기름 당화폐액의 성분분석 및 사과박의 성분분석을 실시하였다.

실험예1 : 밥당화폐액과 엿기름 당화폐액의 성분분석

전통음료인 식혜의 대량생산 공정에서 발생하는 고농도 당성분을 포함하는 부산물인 밥당화폐액과 엿기름 당화폐액의 성분을 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 액체 크로마토그래피는 굴절률(260 nm) 검출기(Model 410 refractive index detector, Waters 600E system, USA)가 장착되고, 겔여과컬럼(Shodex KB800M, Shodex KM805, Waters, USA)이 두 개 연결된 것을 사용하였다. 시료의 농도와 주입 양은 각각 5.0mg/㎖와 100㎕이었으며, 시료의 이동속도는 0.5㎖/분이었다. 액체 크로마토그래피를 이용한 분석 결과, 밥당화폐액과 엿기름 당화폐액의 전체 당농도는 약 20%(w/v)이었다. 표 1은 밥당화폐액과 엿기름 당화폐액의 구성성분을 나타낸 것으로 밥당화폐액의 주성분은 덱스트린, 말토트리오스 및 말토오스이었으며, 엿기름 당화폐액의 주성분은 덱스트린과 말토오스이었다.

실험예 2 : 사과박의 성분분석

사과쥬스의 대량생산 공정에서 발생하는 고농도 당성분을 포함하는 부산물인 사과박의 성분을 검정된 식품분석법(식품분석, 김경삼외, 효일문화사, 1999)에 의하여 분석하였다. 사과를 착즙하여 사과쥬스를 생산한 후, 부산물로 생성되는 사과박의 수분 함량은 5.8%(v/v)이었으며, 사과박의 구성성분은 표 2에 나타내었다.

실시예 2 : 탄소원으로서 밥당화폐액을 이용한 피에스-7의 제조

피에스-7을 생산하기 위한 배지의 조성은 5g/LK ₂ HPO ₄ , 0.1g/L MgSO ₄ ·7H ₂ O, 0.9g/L NH ₄ NO ₃ Sigma Co., USA) 및 0.5g/L 박토 펩톤(Difco Lab., USA)로 구성되었고, 탄소원으로 밥당화폐액을 멸균한 후 멸균된 배지에 무균적으로 3%(v/v)으로 혼합하여 사용하였다. 전배양은 고체 배지에서 일정시간 배양한 아조토박터 인디카 ( Azotobacter indica , ATCC 21423)을 한 백금니 취하여 250㎖ 용량의 플라스크에 멸균하여 준비된 50㎖의 배지에 접종한 후, 30℃에서 180rpm의 진탕 속도로 48시간 진탕배양하였다. 본배양은 전배양한 배양액을 500㎖ 용량의 플라스크에 멸균되어 준비된 150㎖의 동일 배지에 5% (v/v)를 접종하여 전배양과 동일한 방법으로 5일간 배양하였다.

상기 배양액을 8000×g의 범위에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거한 상등액을 회수하였다. 상기 회수한 상등액에 2배 용량의 95% 에탄올을 첨가하고, 잘 혼합하여 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 이 용액을 8000×g의 범위에서 20분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후, 침전물을 95% 에탄올로 2∼3회 세척하였다.

상기 세척한 침전물을 적당한 양의 증류수에 용해시킨 다음, 2∼3일 동안에 4∼5회 증류수를 바꾸어 주면서 투석하여 염성분을 포함한 저분자 물질을 제거하였다. 투석막은 배제 분자량이 12,000∼14,000인 것을 사용하였으며, 투석 후 피에스-7을 진공 동결건조하여 건조물을 회수하였다.

실시예 3 : 탄소원으로서 엿기름 당화폐액을 이용한 피에스-7의 제조

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였으며 탄소원으로서 엿기름 당화폐액을 이용하였다.

실시예 4 : 탄소원으로서 사과박을 이용한 피에스-7의 제조

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였으며 탄소원으로서 사과박을 이용하였다.

비교 실시예 1 : 탄소원으로서 포도당을 이용한 피에스-7의 제조

상기 밥당화폐액, 엿기름 당화폐액, 사과박을 이용하여 제조한 피에스-7을 포도당을 사용하여 제조한 피에스-7과 비교하기 위하여 일반 포도당을 탄소원으로서 배지에 첨가하여 상기 실시예 2과 동일한 방법으로 피에스 7을 제조하였다.

실시예 5 : 본 발명 제조방법으로 제조된 피에스-7의 분석

상기 실시예 2, 3, 4 및 비교 실시예 1에서 제조한 피에스-7을 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)와 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)를 사용하여 분석하였다. 상기 실시예 및 비교실시예에서 제조한 피에스-7을 1N HCl을 사용하여 100℃에서 2시간 가수분해시킨 후, 박막 크로마토그래피를 실시하였다. 박막 크로마토그래피의 전개용매는 부탄올, 피리딘 및 증류수를 6:4:3의 비율(v/v/v)로 혼합한 용액을 사용하였으며, 아닐린(aniline)과 디페닐아민(diphenylamine)을 각각 1%(v/v)의 농도로 제조한 아세톤용액(5㎖)과 85% (v/v) 인산용액(1㎖)을 혼합하여 만든 용액을 발색시약으로 사용하여 전개된 피에스-7을 확인하였다. 아울러, 가스 크로마토그래피(GC Model 5890, Hewlett-Packard, USA)는 헬륨을 이동상으로 하고, 주입속도는 1.2㎖/분, 압력은 16.5기압으로 하여 실시하였다. 분석은 시료 주입시 200℃로 3분 동안 유지시키고, 1분당 8℃씩 증가하여 280℃에서 실시하였으며, 보고된 문헌 (이진우 외, Biotechnology Letters, 1997, 19;803-807)과 비교하여 피에스-7을 확인하였다.

실시예 5 : 피에스-7의 생산성 비교

실시예 2, 3, 4 및 비교 실시예 1에서 제조된 피에스-7의 생산성 결과를 표 3과 도 2에 나타내었다. 표 3 및 도 2에서 보듯이, 밥당화폐액과 사과박은 종래의 피에스-7 생산 배지의 탄소원인 포도당의 경우 보다 높은 생산성을 나타냈다. 이는 전통음료인 식혜의 대량생산 공정에서 필수 불가결하게 발생하는 환경오염성 부산물인 밥당화폐액과 사과박을 피에스-7 생합성의 최적 탄소원으로 사용할 수 있다는 것이며, 이와 같은 결과는 피에스-7을 생산하기 위한 직접 생산비를 40% 이상 절감할 수 있음을 의미한다. 또한, 피에스-7의 생산성 증가에 따른 생산 설비와 간접 생산비의 절약 및 환경 오염물질의 정화에 소요되는 비용의 감소까지를 고려한다면, 대체할 수 있는 포도당의 원가 이상의 생산비를 절감하는 결과이다. 피에스-7의 생합성을 위하여, 탄소원으로 사용한 엿기름 당화폐액의 경우, 피에스-7의 생산성은 포도당을 사용하였을 때 보다 다소 낮지만 포도당의 원가와 생산성을 동시에 고려해보면, 비교적 우수한 탄소원으로 이용될 수 있으므로, 직접 생산비의 절감과 환경오염성 물질의 완전한 제거라는 효과를 기대할 수 있다.

이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 피에스-7의 제조시 탄소원으로서 사용되는 포도당을 식품가공 부산물인 밥당화폐액, 엿기름 당화폐액 또는 사과박으로 대체하여 사용하기 때문에 직접생산비의 40%를 절감할 수 있으며, 피에스-7의 생산성 향상시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 피에스-7 제조시 고농도의 당성분을 포함하는 식품가공 부산물을 탄소원으로 사용하기 때문에, 환경오염원의 정화를 위한 처리비용을 절감시킬 수 있는 효과가 있으므로 식품제조산업상 및 화공산업상 매우 유용한 발명인 것이다.