신규한 모나스커스 속 미생물, 이를 함유한 미생물제 및 제조방법{Novel Monascus microorganism, agent containing thereof and preparation method of the same}

본 발명은 축산분뇨에서 발생하는 악취를 분해하는 모나스커스 속 미생물제과 광합성 세균 미생물제를 포함하는 복합 미생물제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 축산분뇨의 주요 악취 원인인 황화수소(H ₂ S)와 암모니아 및 휘발성 지방산의 발생을 효과적으로 억제할 수 있는 모나스커스 퍼퓨리우스( Monascus purpureus )와 광합성 세균을 포함하는 가축 급여 및 분뇨처리용 미생물제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

최근 들어 가축사육이 집약화되고 이의 생산성 향상을 위한 과다 영양분을 함유한 사료를 가축에게 공급함에 따라 가축체내에서 유용하게 이용되지 않고 그대로 배설됨으로써 환경오염을 더욱 야기시키고 유기성 물질에서 발생되는 황화수소, 암모니아, 휘발성 지방산 등의 악취로 인하여 가축의 호흡기 질병발생을 높이고 농장 작업자의 업무효율을 떨어뜨리고 있는 실정이다.

따라서 상기 악취제거를 위한 연구들이 대한민국 특허공개공보 제1998-14276호, 제1998-56775호, 제1998-56781호에 보고되었다. 그러나, 대한민국 특허공개공보 제1998-14276호는 유기성 폐기물을 부숙시키는 퇴비용 미생물제에 관한 것으로서 주로 세균을 이용한 악취제거용 미생물제를 개시하고 있으며, 곰팡이를 이용한 악취 제거 미생물제에 대하여 언급하거나 시사하고 있는 바가 없다. 또한, 대한민국 특허공개공보 제1998-56775호는 폐수내 유기 성분을 빠르게 분해하는 동시에 악취 제거 성능이 우수한 미생물제 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서 이 경우에도 주로 세균을 이용한 악취제거용 미생물제를 개시하고 있으며, 곰팡이를 이용한 악취 제거 미생물제에 대하여 언급하거나 시사하고 있는 바가 없다. 대한민국 특허공개공보 제1998-56781호는 악취 분해능이 있는 미생물제의 제조방법에 관한 것으로서 사용된 균주 역시 4종의 세균류이고, 또한 대량의 배지에 미생물의 악취분해능 유지와 활성화를 우수하게 하기 위한 DMSO를 첨가하는 것을 특징으로 한다. 또한 이들 미생물제는 악취 발생의 배기원이나, 원료 집적장, 처리장 등에 투여하는 방식에 대해서만 언급하고 있다.

또한, 상술한 종래기술에 개시된 악취 제거용 미생물제들의 활성은 황유래 물질이나 암모니아 제거에 대해서만 국한되어 있고, 가축 분뇨의 주요 악취 물질인 휘발성 지방산을 제거할 수 있는 미생물의 활성에 대해서는 언급하고 있는 바가 전혀 없다.

이에 본 발명자들은 지속적이며 다각도로 연구한 끝에 가축분뇨에서 악취발생을 효과적으로 감소시키는 곰팡이를 분리하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 축산분뇨에서 발생하는 악취를 효과적으로 분해할 수 있는 모나스커스 속 미생물제와 광합성 세균 미생물제를 함유하는 복합 미생물제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 복합 미생물제의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 악취 분해 효과가 있는 신규한 모나스커스 속 미생물을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명은 축산분뇨에서 발생하는 악취성분인 황화수소, 이산화황, 암모니아, 휘발성 지방산 등을 효과적으로 저감시킬 수 있는 모나스커스 속의 미생물을 함유한 미생물제에 관한 것이다. 상기 미생물은 단독으로 사용하거나 광합성 세균, 예를들어 로도박터( Rhodobacter ) 속, 로도슈도모나스( Rhodopseudomonas ) 속 등의 미생물과 같이 사용할 수 있다.

이러한 축산 분뇨 악취 제거용 미생물제는 모나스커스 속을 함유하는 미생물제 10 내지 30중량%, 광합성 세균을 함유하는 미생물제 20 내지 40중량%, 미생물 안정화형 부형제 30 내지 60중량%를 포함할 수 있다.

본 발명에 개시된 모나스커스 속 미생물은 황화수소를 포함한 황유래의 악취물질, 암모니아뿐만 아니라 가축 분뇨의 주요 악취물질인 휘발성 지방산을 효과적으로 저감시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 지금까지 개시된 바 없는 모나스커스 속 미생물의 악취 제거 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 개시된 모나스커스 속 미생물의 구체적 예로는 모나스커스 퍼퓨리우스( Monascus purpureus ), 모나스커스 필로서스( Monascus pilosus ), 모나스커스 앵카( Monascus anka ) 등이 있다.

광합성 세균은 휘발성 지방산을 에너지원으로 이용하여 효과적으로 제거할 수 있기 때문에 본 발명의 모나스커스 균주의 휘발성 지방산 제거능에 상승적 효과를 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 미생물제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로 미생물제는 액체배양, 고체배양, 반고체배양 등의 방법으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 액체배양 방법으로 제조한다. 액체배양 방법은 발효기를 이용한 액체심부배양과 표면배양으로 나뉘는데, 일반적으로 액체심부배양법은 고체배양법에 비하여 초기 시설비가 많이 드는 단점이 있으나 조절이 용이하고 배양시간이 상대적으로 매우 짧기 때문에 보다 효과적인 배양방법이다. 본 발명에서 미생물제를 제조하는 방법은 액체배양 방법으로 미생물을 1차 배양한 다음 미생물의 안정성을 높이기 위해 영양공급원을 함유한 부형제와 혼합하여 저온 건조과정에서 2차 배양을 실시하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 축산분뇨에서 발생하는 악취를 효과적으로 저감시킬 수 있는 신규한 미생물 모나스커스 퍼퓨리우스 KFCC-11238에 관한 것이다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 가축분뇨에서 악취발생을 효과적으로 감소시킬 수 있는 곰팡이를 분리하는데 성공하였으며, 분리된 곰팡이는 모나스커스 속의 미생물로 동정되었다.

모나스커스는 균사내에 홍색색소를 생산하기 때문에 명명된 것으로 홍국균으로도 알려져 있다. 이는 중국, 일본, 동남아 등지에서 홍주, 홍두부 등의 발효균으로 주로 이용되고 있으며(응용미생물학개론, 세진사, 1997년 출판) 미생물 천연색소원으로 많이 이용된다. 또한 중국, 대만 등에서는 혈액순환 개선제, 살균 또는 정균 등의 약제 및 식품 보존제로서 널리 이용되고 있다.

모나스커스에 관한 특허는 다수 출원되었으며, 그 예로서 홍국색소의 생산에 관한 기술(대한민국 특허공고공보 제1980-1444호, 대한민국 특허공개공보 제1992-12447호, 대한민국 특허공개공보 제1991-12250호, 대한민국 특허공고공보 제1996-34395호, 대한민국 특허공개공보 제1991-12249호, 대한민국 특허공고공보 제1996-16134호) 및 홍국색소를 함유한 발효식품(대한민국 특허공개공보 제1988-10697호, 대한민국 특허공고공보 제1998-144305호, 대한민국 특허공개공보 제1998-20659호, 대한민국 특허공고공보 제1998-146499호)에 관한 것이다. 이외에 대한민국 특허공고공보 제1994-75601호는 홍국균 배양 추출물이 함유된 음식물에 관한 것으로 모나스커스가 항균작용 및 콜레스테롤 저하효과가 있다고 개시하고 있다. 이와 같이 모나스커스 속의 미생물 및 이를 이용한 기술에 관한 특허는 주로 색소와 식품에만 국한되어 있고, 이를 가축 사료 첨가용 미생물제나 악취제거 미생물제 또는 균주로 사용된 바는 없다.

또한, 본 발명에 개시된 신규 미생물의 동정 및 특징에 대하여 설명하면 다음과 같다.

본 발명자들은 돼지에게 광물질 공급원으로 농장 부근의 흙을 급여하는 과정에서 흙의 급여에 따라 농장의 악취가 감소된다는 사실을 발견하였다. 이에 그 원인을 규명하기 위하여 흙에 함유된 미생물을 분석한 결과 홍국균 모양의 콜로니를 얻었으며 상기 미생물을 삶은 쌀, 보리에 배양한 후 이를 돼지에게 급여한 결과 가축분뇨에서 발생하는 악취가 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다. 이에 상기 분리 균주를 동정한 결과 모나스커스 퍼퓨리우스로 동정되었으며, 분리 균주는 2000년 11월 23일자로 한국종균협회에 기탁번호 KFCC-11238로 기탁되었다.

이렇게 분리한 미생물은 차펙 이스트 아가(CYA)배지, 몰트 익스트렉트 아가(MEA) 배지, 글리세롤 25% 나이트레이트 아가(G25N) 배지 등에서 배양할 수 있다. 이때 배양온도는 20 내지 40℃이며, 보다 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서 성장시킨다. pH 조건은 5 내지 8, 바람직하게는 6.0 내지 7.5이다. 배지의 탄소원으로서는 글루코오스, 글리세롤, 사카로오스, 전분 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 질소원으로는 효모추출물, 맥아추출물, 육추출물, 펩톤, 질산나트륨, 황화암모늄 등 유기 또는 무기 질소원을 단독 또는 조합으로 사용할 수 있다. 무기물은 사용하는 배지에 따라 달라질 수 있으며 일반적으로 철, 마그네슘, 인, 망간 등을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 미생물제를 제조하기 위해서 상기에서 얻은 모나스커스 속의 균주를 배지에 접종하여 25 내지 30℃, 100 내지 200rpm으로 1 내지 3일간 배양시켜 배양액을 얻은 후 이를 종균으로 사용한다. 이때 배지의 탄소원으로서는 글루코오스, 전분, 사카로오스 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 질소원으로는 효모추출물, 맥아추출물, 펩톤, 질산나트륨, 황화암모늄 등 유기 또는 무기 질소원을 단독 또는 조합으로 사용할 수 있다. 무기물은 사용하는 배지에 따라 달라질 수 있으며 일반적으로 철, 마그네슘, 인, 망간 등을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 종균을 글루코오스 1 내지 3중량%, 바람직하게는 2중량%, 감자분말 0.1 내지 0.5중량%, 바람직하게는 0.3중량%를 함유하는 멸균된 배양액에 접종하여 발효기에서 25 내지 37℃, 100 내지 200rpm으로 1 내지 3일간 배양시킨다. 배양이 완료된 후 균체 비드를 분쇄시킨 다음 대두분말, 대두박, 옥분, 밀기울, 질석, 규조토 등으로 구성된 부형제와 중량% 기준으로 1:1 내지 1:3, 바람직하게는 1:1의 비율로 혼합하고 8 내지 15시간 동안 저온 건조시킨 후 분쇄하여 모나스커스 속 미생물제를 얻는다. 곰팡이의 경우 액체 배양시 균체 비드를 형성하기 때문에 분쇄기로 균체를 분쇄하여 부형제와 혼합하여 건조시킬 경우 상기 균체가 질석이나 규조토의 공극에 잘 침투하여 안정성이 높아지며 건조과정 초기에 발생하는 2차 배양을 촉진한다. 대두박과 옥분 등은 균주의 영양공급원으로 작용하여 균 성장을 촉진한다.

본 발명에 사용되는 광합성 세균으로는 로도박터( Rhodobacter ) 속, 로도슈도모나스( Rhodopseudomonas ) 속 등 통상의 광합성 세균을 사용할 수 있으며, 이중 로도박터속의 미생물이 특히 바람직하다. 구체적인 광합성 세균의 예로는 로도박터 켑슐레이터스( Rhodobacter capsulatus ), 로도박터 스페로이즈( Rhodobacter sphaeroides ) 등의 로도박터종, 또는 로도슈도모나스 비리디스( Rhodopseudomonas viridis ), 로도슈도모나스 스페로이즈( Rhodopseudomonas sphaeroides ) 등의 로도슈도모나스종을 사용할 수 있으며, 특히 로도박터 켑슐레이터스가 바람직하다. 상기 광합성 세균은 광합성 세균을 배양하는 통상의 배지에 접종하여 30 내지 37℃, 1000 내지 5000룩스의 명조건에서 1 내지 2일간 배양한다. 배양이 완료된 후 대두분말, 대두박, 옥분, 질석, 규조토 등으로 구성된 부형제와 중량% 기준으로 1:1 내지 1:3, 바람직하게는 1:1의 비율로 혼합하고 8 내지 15시간 동안 저온 건조시킨 후 분쇄하여 광합성 세균을 함유한 미생물제를 얻는다.

상기 방법에 따라 제조한 모나스커스 속을 함유한 미생물제와 광합성 세균을 함유한 미생물제를 중량% 기준으로 1:1 내지 1:3, 바람직하게는 1:1의 비율로 혼합하여 본 발명의 복합 미생물제를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.

<실시예 1>

미생물의 분리 및 동정

본 발명의 신규한 모나스커스 속의 미생물을 배양하기 위한 최적의 배지를 선정하기 위해 차펙 이스트 아가(CYA)배지, 몰트 익스트렉트 아가(MEA) 배지, 글리세롤 25% 나이트레이트 아가(G25N) 배지별로 배양하였다. 각 배지의 조성은 다음과 같았다.

(1) CYA(Czapek Yeast Agar): 차펙 이스트 아가

NaNO ₃ 3.0g, K ₂ HPO ₄ 1.0g, KCl 0.5g, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.5g, FeSO ₄ ·7H ₂ O 0.1g, 효모추출물 5.0g, 사카로오스 30g, 아가 15g, 증류수 1L, pH 7.1

(2) MEA(Malt Extract Agar): 몰트 익스트렉트 아가

맥아추출물 20g, 펩톤 1g, 글루코오스 20g, 아가 15g, 증류수 1L, pH 5.6

(3) G25N(Glycerol 25% Nitrate Agar): 글리세롤 25% 나이트레이트 아가

NaNO ₃ 3.0g, K ₂ HPO ₄ 1.0g, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.5g, 효모추출물 5.0g, 글리세롤 25g, 아가 15g, 증류수 1L, pH 7.1

7일간 배양한 후 콜로니의 직경을 cm 단위로 측정한 결과 표 1에 나타난 바와 같이 배지별로 성장속도가 상이하였으며, 이중 MEA 배지에서 가장 우수한 성장을 나타내었고, 곰팡이의 일반적인 배양온도인 25℃보다는 37℃에서 더 우수한 성장상태를 나타내었다.

또한 각 배지에서 미생물의 배양특징을 실험한 결과 표 2에 나타난 바와 같이 배양배지에 따라서 균사체 색깔이나 색소생산이 다르게 나타났다.

균주동정을 위해 피디에이(PDA, Potato Dextrose Agar) 평판배지에서 미홍색을 띤 콜로니를 분리하여 슬라이드 배양하면서 광학현미경으로 관찰한 결과 표 3에 나타난 바와 같이 모나스커스 속의 특징인 격벽을 가진 균사, 자낭포자, 피자기, 분생자, 후막포자 등이 확인되었으나, 가근, 포복지, 접합포자, 병족세포 등이 관찰되지는 않았다.

따라서 본 발명의 신규 분리 균주는 자낭균류(Ascomycetes)의 모나스커스 속임을 확인할 수 있었다. 상기 분리 균주는 2000년 11월 23일자로 한국종균협회에기탁번호 KFCC-11238로 기탁되었다.

본 발명의 분리균주를 600배의 배율로 일반적인 광학현미경 하에서 형태를 관찰한 결과는 표 4에 나타내었다.

<실시예 2>

분리균주의 효소활성 검색

모나스커스 속 분리균주의 효소활성을 측정한 결과 표 5에 나타난 바와 같이 전분분해효소(amylase) 활성이 높은 것을 알 수 있었다.

효소활성 측정은 와이엠아가(YM agar, Yeast-Malt extract Agar)를 기본배지로 하여 효소별로 표 6과 같이 각각의 기질을 함유하는 배지를 제조하여 측정하였다.

<실시예 3>

미생물제의 제조

평판배지에서 배양시킨 모나스커스 균주를 멸균한 차펙-닥스 브로스 100ml(Czapek-Dox Broth: 사카로오스 3.0g, 질산나트륨 0.3g, K ₂ HPO ₄ 0.1g, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.05g, KCl 0.05g, FeSO ₄ ·7H ₂ O 0.001g, pH 7.3)에 접종하여 30℃, 180rpm으로 3일간 배양시킨 배양액을 종균으로 하였다. 그리고 5L 자-퍼멘터(jar-fermentor)를 이용하여 글루코오스 2중량%, 감자분말 0.4중량%를 함유하는 멸균된 3L 배양액에 종균을 접종하여 30℃, 2vvm, 200rpm으로 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 형성된 균체 비드를 분쇄기로 분쇄한 다음 대두박, 옥분, 질석, 규조토가 중량% 기준으로 1:1:1:1의 비율로 혼합된 부형제와 중량% 기준으로 1:1의 비율로 혼합하고 15시간 동안 30 내지 45℃에서 저온 건조시킨 후 분쇄하였다. 또한 대두박과 옥분은 균주의 영양공급원으로 작용하여 균 성장을 촉진함을 알 수 있었다. 이렇게 하여 모나스커스 속을 함유하는 미생물제를 얻었다.

광합성 세균은 로도박터 켑슐레이터스( Rhodobacter capsulatus ) ATCC 33303를 이용하여 한국종균협회 균주 카다로그의 189번 배지인 로도슈도모나스용배지[EDTA 20.0mg, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 1.0g, 말산(malic acid) 4.0g, MgSO ₄ ·7H ₂ O, CaCl ₂ ·2H ₂ O 75.0mg, FeSO ₄ ·7H ₂ O 12.0mg, 미량광물질 (H ₃ BO ₄ 0.7g, MnSO ₄ ·H ₂ O 0.398g, Na ₂ MoO ₄ ·2H ₂ O 0.188g, ZnSO ₄ ·7H ₂ O 0.06g, Cu(NO ₃ ) ₂ ·3H ₂ O 0.01g, CoCl ₂ ·6H ₂ O 0.05g/증류수 250ml) 1.0ml, 씨아민 1.0mg, 바이오틴 15.0mg, K ₂ HPO _4, KH ₂ PO ₄ /1L]에 접종 배양하여 30℃, 3000룩스의 명조건에서 2일간 배양한 후 대두박, 옥분, 질석, 규조토를 중량% 기준으로 1:1:1:1의 비율로 혼합한 부형제와 중량% 기준으로 1:1 혼합하고 24시간 동안 저온 건조시킨 후 분쇄하였다. 이렇게 하여 광합성 세균을 함유하는 미생물제를 얻었다.

상기 방법에 따라 얻어진 각각의 미생물제를 중량% 기준으로 1:1의 비율로 혼합하여 본 발명의 복합 미생물제를 얻었다.

<실시예 4>

돼지 분뇨의 악취제거 시험

실시예 3에 따라 얻어진 복합 미생물제를 돼지 분뇨혼합물과 뇨에 1중량%씩 첨가하여 악취제거능을 측정한 결과 황화수소 및 암모니아 함량이 크게 감소된 결과를 얻었다(표 7 참조). 이때 악취발생 정도는 관능법에 의해 검사하였다. 관능법에 의한 검사는 10명의 검사자로 하여금 각기 다른 처리를 한 가축분뇨의 냄새를 맡게 한 다음 악취발생 정도에 따라 점수를 매겨 그 평균값을 계산하는 방법이다.

* 악취정도: 1-2 냄새 거의 없음, 3-5 보통, 6-8 심한 악취, 9-10 매우 심한 악취

유기성 폐기물 발효에 있어 본 발명의 모나스커스 속 균주와 광합성 세균을 함유한 복합 미생물제에 의한 악취제거 방법은 매우 안정하며, 효율성이 좋고 2차적인 환경오염을 일으키지 않으며 특히 가축분뇨 퇴비화에 좋은 영향을 줄 수 있는 장점이 있다. 또한 가축분뇨의 악취발생을 억제하기 위해서 미생물을 직접 가축분뇨에 살포하거나 가축사료에 포함시킴으로써 용이하게 급여할 수 있다.