拟康氏木霉T5-1菌株及其在促进三七生长和根腐病防控中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物病害的防控，最为快速有效的手段是使用化学
杀菌剂。但长期大量使用化学杀菌剂会造成环境污染、
生态系统破坏、病原菌耐药性以及抗药性的产生，另外
农药残留问题也严重制约作物安全生产并威胁人类健康。当前
化学农药仍占主导地位，但因生防菌具有使用安全、不产生抗药性等优点，其作为一种绿色的、环境友好的防控手段，尤其是向
土壤中添加生防菌来防控土传病害，越来越受到人们的关注，并逐渐成为未来生态农业可持续发展的重要方向。同时，
微生物菌肥的使用也可以缓解因化学
肥料大量使用造成的土壤板结、土壤理化性质改变等问题。微生物菌肥的使用前提是获得具有高效生物活性功能的有益微生物。生防菌通过与病原菌竞争空间、产生抗菌活性物质、
重寄生病原菌、诱导植物系统抗性以及促进植物生长等方面直接或间接防控植物病害。随着分子生物学的发展，生物技术对微生物改造技术的成熟，生防菌在农业生产中作为一种替代农药或者至少能作为减少化学农药使用量的一种补充手段的地位越来越牢固，同时显现出巨大的经济效益、社会效益以及生态效益，也符合人类绿色环保和可持续发展的目标。
[0003] 三七与人参、西洋参等同科同属，享有“南国神草”、“金不换”等美誉，是我国特有名贵中药材，具有
止血、活血化瘀、降血脂、抗血栓等功效，尤其对跌打损伤等有奇效。三七对生态环境的需求较为苛刻、生态幅较窄、生长周期较长，随着种植年限的增加，土壤中病原菌不断积累，病害发生率也不断增加，常年造成损失达10％-40％，严重的达到70％以上，严重影响三七的产量和品质，成为制约三七产业健康发展的主要障碍。目前三七主要种植在我国
云南省，种植面积已超过30万亩，在世界范围内市场占有率高达85％以上。随着人们健康意识的提高以及社会对心血管类药品需求的提升，三七的市场需求量不断增加。由此带来的大规模单一面积种植、化学农药的滥用等，使得三七农药残留问题愈发突出。因此，利用生物防控手段防控三七根腐病，对提升三七产品的
质量以及绿色中药材的持续发展具有重要的现实意义。
[0004] 目前已报道的三七根腐病原
真菌主要包括镰刀菌属(Fusarium spp.)、柱孢菌属(Cylindrocarpon spp.)、疫霉属(Phytophthora spp.)、茎点霉属(Phoma spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)以及拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)等6个属。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提出了拟康氏木霉T5-1菌株及其在促进三七生长和根腐病防控中的应用。具体技术方案如下：
[0006] 拟康氏木霉T5-1菌株，分类命名为拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)，在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO.12779。
[0007] 所述拟康氏木霉T5-1菌株在
葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养3d，可长满直径为9cm的培养皿，菌丝发达，气生菌丝蓬松茂密，无色素产生；所述PDA培养基组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
[0008] 所述拟康氏木霉T5-1菌株在促进三七生长和根腐病防控中的应用。
[0009] 所述拟康氏木霉T5-1菌株在促进三七生长中的应用，通过使用拟康氏木霉菌T5-1菌株分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理，促进三七生长。
[0010] 所述拟康氏木霉菌T5-1菌株分生孢子悬浮液的浓度为1×104～1×107个分生孢子/mL。
[0011] 所述拟康氏木霉菌T5-1菌株分生孢子悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
[0012] 1)将拟康氏木霉T5-1菌株接种于PDA培养基上培养，得到拟康氏木霉T5-1菌株菌落；
[0013] 2)在步骤1)的培养皿中加入20mL无菌
水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到拟康氏木霉T5-1分生孢子悬浮液。
[0014] 步骤1)中培养条件为28℃黑暗培养6d。
[0015] 拟康氏木霉T5-1菌株在三七根腐病防控中的应用，所述根腐病的病原菌为毁灭柱孢菌(C.destructans)、恶疫霉菌(P.cactorum)、镰刀菌(F.solani)的一种及以上。
[0016] 所述拟康氏木霉T5-1菌株滤液抑制根腐病菌生长。
[0017] 所述拟康氏木霉T5-1菌株滤液的制备包括如下步骤：
[0018] 1)将拟康氏木霉T5-1菌株接种于PDA培养基上培养，得到拟康氏木霉T5-1菌株菌落；
[0019] 2)从步骤1)得到的拟康氏木霉T5-1菌落边缘，打取5mm的菌丝
块20块，接种至含300mL PDB培养液的500mL三
角瓶中，振荡培养30d后，采用
真空泵抽滤，得到拟康氏木霉T5-
1菌株滤液；所述PDB培养基组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L。
[0020] 步骤1)中培养条件为28℃黑暗培养2d；步骤2)中培养条件为25℃、180rpm/min。
[0021] 所述拟康氏木霉T5-1菌株的
挥发性有机化合物在密闭条件下抑制根腐病菌的产孢。
[0022] 所述拟康氏木霉T5-1菌株重寄生根腐病菌。
[0023] 本发明的有益效果为：筛选的拟康氏木霉T5-1菌株菌丝发达，气生菌丝蓬松茂密，无色素产生。拟康氏木霉T5-1菌株能够促进三七生长，同时，菌株可抑制根腐病菌生长、重寄生于根腐病菌、菌株的挥发性有机化合物在密闭条件下抑制根腐病菌的产孢，达到促进三七生长以及抑制根腐病的双重效果，为生物菌肥的开发及其利用奠定良好
基础。
[0025] 分类命名：拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)菌株编号：T5-1[0026] 保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心
[0027] 保藏机构简称：CGMCC
[0028] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0029] 保藏日期：2016年08月08日
[0030] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12779
附图说明
[0031] 图1为拟康氏木霉T5-1菌株在PDA培养基上的形态学特征，其中a为菌落形态，b为分生孢子梗形态，c为分生孢子形态。
[0032] 图2为拟康氏木霉T5-1菌株滤液对恶疫霉菌D-10的抑制效果，其中a为未用T5-1菌株滤液处理的恶疫霉菌D-10的菌落形态，b为T5-1菌株滤液处理后对恶疫霉菌D-10的抑制效果。
[0033] 图3为拟康氏木霉T5-1菌株滤液对恶疫霉菌D-10的抑制效果，其中CK为未用T5-1菌株滤液处理，T5-1-Ster-D-10为T5-1菌株滤液经过121℃高温处理20min后对恶疫霉菌D-10的抑制率。
[0034] 图4为拟康氏木霉T5-1菌株挥发性有机化合物对镰刀菌F-2产孢的抑制效果，其中F-2为未用T5-1挥发性物质处理的镰刀菌产孢情况，T5-1-F-2为用T5-1挥发性有机物处理后的镰刀菌产孢情况，A和B表示处理组与对照组在1％水平上存在极显著差异。
[0035] 图5为拟康氏木霉T5-1重寄生三七根腐病菌的效果，其中a为以孢子粘附的方式重寄生Cylindrocarpon destructans，b为以菌丝缠绕的方式重寄生Cylindrocarpon destructans，c为以形成“钩状”结构的方式重寄生Phtophthora cactorum。
具体实施方式
[0036] 本发明提出了拟康氏木霉T5-1菌株及其在促进三七生长和根腐病防控中的应用，下面结合
实施例对本发明做进一步说明。
[0037] 实施例1：拟康氏木霉T5-1菌株的分离及鉴定
[0038] 1、菌株的分离与纯化
[0039] 从云南省文山州获得三年生三七根组织样品，用
自来水将三七根组织表面的泥土等冲洗干净；切取三七根组织病健交界处组织块，大小约4mm2；将切好的组织块在1％的
次氯酸钠溶液中消毒3min，无菌水冲洗3遍后，在灭菌
滤纸片上充分晾干；将组织块放置于添加有
硫酸链霉素(100ppm)的PDA平板上，在28℃恒温
培养箱中倒置培养1-3d，定期观察；待培养皿中长出疑似菌落后，立即进行挑取并转移到新鲜的PDA平板上进行编号保存；采用菌丝末端法进行纯化，得到如图1所示的纯培养物。所述PDA平板组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
[0040] 2、菌株的鉴定
[0041] 提取分离纯化后菌株的基因组DNA，采用以下3对引物进行PCR扩增：
[0042] ①上游引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，和下游引物ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)，扩增序列如SEQ ID No.1所示。
[0043] ②上游引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，和下游引物ITS4(5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，扩增序列如SEQ ID No.2所示。
[0044] ③上游引物tef1(5’-GTGAGCGTGGTATCACCATCG-3’)，和下游引物tef1(5’-GCCATCCTTGGAGACCAGC-3’)，扩增序列如SEQ ID No.3所示。
[0045] 将上述扩增序列在木霉菌
数据库TrichoBLAST(http://www.isth.info/tools/blast/preblast.php)中进行比对，分类命名为拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)，菌株命名为T5-1。
[0046] 实施例2：拟康氏木霉T5-1菌株分生孢子悬浮液对三七的促生作用
[0047] 将拟康氏木霉T5-1菌株接种于PDA培养基上28℃黑暗培养6d，得到拟康氏木霉T5-1菌株菌落；在培养皿中加入20mL无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到拟康氏木霉T5-1分生孢子悬浮液，浓度为1×107个分生孢子/mL。
[0048] 田间一年生三七植株与二年生三七植株，由云南省苗乡三七科技园提供。采用随机区组的试验设计，设置的小区面积/三七株数为：一年生三七0.5m×0.5m/约100株；二年生三七1.5m×0.5m/约30株；设置3个梯度稀释的拟康氏木霉T5-1菌株的孢子悬浮液浓度(A，稀释10倍；B稀释100倍；C，稀释1000倍)进行定期灌根处理，每个浓度设置3个重复，每个小区灌根量为500mL，每隔7d进行一次灌根处理，共进行4次灌根，对照组用自来水替代。
[0049] 按照五点取样法，一年生三七在处理后第20d，二年生三七第45d时进行取样。一年生三七每个小区取样10株(3次重复共30株)；二年生三七每个小区取样5株(3次重复共15株)。对所取样品的单株进行中叶长、中叶宽、株高、地上部鲜重、地下部鲜重的测量，对每个重复中的所有样品进行地上部干重、地下部干重总重量的测量。通过以上测量指标，运用DPS
软件进行显著性差异分析。结果如表1和表2，结果显示，拟康氏木霉T5-1菌株对三七有促生作用。
[0050] 表1 拟康氏木霉T5-1菌株对一年生三七的促生效果
[0051]
[0052] 注：数据后注*，说明与对照相比有差异显著性(P<0.05)。
[0053] 表2 拟康氏木霉T5-1菌株对二年生三七的促生效果
[0054]
[0055] 注：数据后注*，说明与对照相比有差异显著性(P<0.05)。
[0056] 实施例3：拟康氏木霉T5-1菌株滤液对恶疫霉的抑制作用。
[0057] 将拟康氏木霉T5-1菌株接种于PDA培养基上28℃黑暗培养2d，得到拟康氏木霉T5-1菌株菌落；打取5mm的菌丝块20块，接种至含300mL PDB培养液的500mL三角瓶中，25℃、
180rpm/min条件下振荡培养30d后，采用
真空泵抽滤，得到拟康氏木霉T5-1菌株滤液；滤液于121℃加
热处理20min，并与PDA培养基按照体积比1:4充分混合，倒平板，每板约20mL；用
5mm的打孔器，取活化4d的恶疫霉菌落边缘菌丝块，放置于9cm平板中央，培养10d后，采用十字交叉法测量恶疫霉菌的菌落直径，计算抑制率。结果如图2和图3，拟康氏木霉T5-1菌株滤液对恶疫霉菌的抑制效果明显。
[0058] 实施例4：拟康氏木霉T5-1菌株挥发性有机化合物对镰刀菌产孢的抑制作用[0059] 采用对扣培养的方法。将拟康氏木霉T5-1菌株与镰刀菌分别进行活化，待生长3天后，用5mm打孔器分别在拟康氏木霉T5-1菌株与镰刀菌的菌落边缘打取新鲜菌丝块；将拟康氏木霉T5-1菌株菌丝块放置在含20mLPDA的9cm培养皿中央，镰刀菌菌丝块放置在另一个新鲜的含20mLPDA的9cm培养皿中央；将两个皿底相互对扣，用
封口膜进行4层包裹处理，每个处理3次重复；含镰刀菌菌丝块的一面在上，含拟康氏木霉T5-1菌株菌丝块的一面在下，以两面都接镰刀菌的处理作为空白对照，28℃恒温培养箱中进行培养7d；用5mm打孔器打取受拟康氏木霉T5-1菌株挥发性有机化合物处理后的镰刀菌菌丝块并转移至新鲜的PDA培养基上进行恢复生长5d后，在接种点附近、接种点与菌落边缘连线的中点、菌落边缘3个
位置，用5mm打孔器打取菌丝块，置于含1mL灭菌水的PCR管中，摇匀后进行产孢量的统计。结果如图
4，拟康氏木霉T5-1菌株挥发性有机化合物对镰刀菌F-2产孢产生抑制效果。
[0060] 实施例5：拟康氏木霉T5-1重寄生三七根腐病菌的作用
[0061] 采用对峙培养的方法。将拟康氏木霉T5-1、毁灭柱孢菌(C.destructans)和恶疫霉菌(P.cactorum)进行活化，待生长3天后，用5mm打孔器分别打取菌丝块；将拟康氏木霉T5-1菌丝块放置在含20mL PDA的9cm培养皿一侧(距边缘约2cm左右)，毁灭柱孢菌与恶疫霉菌的菌丝块放置在培养皿另一侧(距边缘约2cm左右)，28℃恒温培养箱中倒置培养。分别在培养第4d与第8d时，用灭菌刀片切取菌丝交界处，大小约4mm×4mm，进行扫描
电子显微镜观察。结果如图5，拟康氏木霉T5-1可以孢子粘附的方式重寄生Cylindrocarpon destructans；以菌丝缠绕的方式重寄生Cylindrocarpon destructans；以形成“钩状”结构的方式重寄生Phtophthora cactorum。
