用于快速测量生化需氧量的方法
阅读：453发布：2020-05-18
专利汇可以提供用于快速测量生化需氧量的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于通过 荧光 、基于浓度升高的样品来测量被称为参考样品或标准溶液(Std1至Std8)的样品的BOD5的标定方法，所述参考样品是由包含寡糖和多糖以及寡肽和多肽的混合物的单一储备溶液制备的；还涉及使用所述标定方法的快速测量 生化需 氧 量 的方法。，下面是用于快速测量生化需氧量的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于通过荧光来测量样品的BOD5的标定方法，其基于被称为参考样品或标准溶液(Std1至Std8)的浓度增加的样品，所述参考样品由包含以下组分的相同储备溶液制备：
i)30mg/L至60mg/L的蛋白胨P1，
ii)20mg/L至50mg/L的包含最多400个氨基酸的约30kDa至50kDa的多肽P2，iii)20mg/L至50mg/L的包含最多600个氨基酸的约50kDa至70kDa的多肽P3，iv)5mg/L至25mg/L的包含15个至25个葡萄糖单元、有利地为15个葡萄糖单元的寡糖G1的混合物，
v)5mg/L至25mg/L的包含几百个至几万个葡萄糖单元的具有支链的多糖G2，vi)130mg/L至170mg/L的具有直链的多糖G3，其包含几万个至几百万个葡萄糖单元且为纤维形式，
全部蛋白质占所述溶液中存在的全部有机物的35重量％至45重量％、有利地为40重量％，且全部糖占所述溶液中存在的全部有机物的55重量％至65重量％、有利地为60重量％。
2.一种用于快速测量含有可生物降解的有机物的样品中生化需氧量的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在多孔微孔板内与荧光生物试剂和能够降解待测样品的微生物接种物一起温育：
-一方面，至少一个包含有机物的样品，以及
-另一方面，被称为参考样品(Std1至Std8)的浓度增加的8个样品，其由包含以下组分的相同储备溶液制备：
i)30mg/L至60mg/L的蛋白胨P1，
ii)20mg/L至50mg/L的包含最多400个氨基酸的约30kDa至50kDa的多肽P2，iii)20mg/L至50mg/L的包含最多600个氨基酸的约50kDa至70kDa的多肽P3，iv)5mg/L至25mg/L的包含15个至25个葡萄糖单元、有利地为15个葡萄糖单元的寡糖G1的混合物，
v)5mg/L至25mg/L的包含几百个至几万个葡萄糖单元的具有支链的多糖G2，vi)130mg/L至170mg/L的具有直链的多糖G3，其包含几万个至几百万个葡萄糖单元且为纤维形式，
全部蛋白质占所述溶液中存在的全部有机物的35重量％至45重量％、有利地为40重量％，且全部糖占所述溶液中存在的全部有机物的55重量％至65重量％、有利地为60重量％，
-G1和P1在0小时至24小时的温育过程中被降解(区域1或Z1)，G2、P2和P3在24小时至48小时的温育过程中被降解(区域2或Z2)，G3在48小时内不被降解，根据降解区域Z1或Z2，所述参考样品或标准溶液使得能够根据参考样品的浓度来构建4条标定曲线；
b)分析由所述样品随时间变化发出的荧光，所述荧光分析包括3个步骤：
-在微生物接种物的作用下，测量待测样品和参考样品在45小时至50小时、有利地为48小时的降解中所发射的荧光强度，
-使用待测样品所测量的所述荧光强度，通过与参考样品所测量的荧光强度相比较来计算参考有机物的浓度，以及
-通过应用先前由比较根据相同方案对参考样品进行的荧光强度测量和根据BOD5标准对所述参考样品进行的测量而获得的对应模型，将该有机物的浓度转化成等同于BOD5标准(5天的生物需氧量)的mgO2·L-1值。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述参考样品Std1至Std8的可生物降解的有机物的浓度对应于0至约110mgO2·L-1的BOD值。
4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述温育是在pH 7.2的磷酸盐缓冲介质中、在25℃至35℃的温度下进行的。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，有机样品是净化装置废水，其选自未经净化的水、沉后水、经生物处理的水和排放物，地表水或地下水，来自工艺或工业生产的废水或废物。
6.一种用于实施根据权利要求2所述的方法的试剂盒，其特征在于，其包括：荧光生物试剂、参考样品和缓冲液。
用于快速测量生化需氧量的方法
[0003] 有机底物可以被微生物用作底物，它们从中获得能量和生长能力。许多工业应用在需氧或厌氧条件下使用这些生化降解反应，特别是：废水的净化、高附加值化合物的生产、能源生产和农产品生产。有机底物的可利用来源非常广泛：农作物和农作物残渣、农产品生产和残渣、家庭和城市废物、生物质，特别是藻类。
[0004] 存在用于测量有机底物的可生物降解性的不同方法，即用于测量微生物能够使用这些底物以转化它们的程度。每个应用领域使用其自己的方法，非常普遍地基于测量在反应过程中形成的产物，有时是基于测量经降解的底物。这些方法是费时的、实施复杂的，且需要沉重、庞大和昂贵的设备。
[0005] 测量有机底物的可生物降解性的最常用的工业参数中的一个是生化(或生物)需氧量(BOD)。BOD代表水中的需氧微生物为氧化溶解或悬浮在水中的有机物所需的氧分子量。最普遍进行的测量是BOD5的测量。BOD5对应于在20℃的温度下温育样品5天的生化(或生物)需氧量。它的标准测量方案在1998年5月的标准NF EN 1899-1中描述。该测量方案是费时的，且结果可以变化，这主要由于所用接种物的微生物多样性的波动。
[0006] 在过去20年中进行的许多研究已经带来了更快速和更可靠的不同技术的开发(Jouanneau S.等人，Water Research，(2014)，49，62-82)。
[0007] 在这些方法中，还可以提及的是基于氧化还原介质的方法，例如DudalY.等人(Anal.Bioanal.Chem.(2006)，384，175-179)所描述的，其重复了国际申请2006/079733的内容，并描述了在微孔板上用于测量由溶解的有机物(DOM)诱导的分解代谢活性的荧光试验。该技术使得能够基于葡萄糖标定曲线来计算DOM的可矿化量，并将DOM根据其与细菌反应的能力进行分类。
[0008] Hudson等人(Science of the total environment，2007，391，No.1，149-158，Elsevier)和Heloise Garcia Knapil等人(Environmental Engineering Science，2014，31，No.12，653-633)描述了通过使用有机物的天然荧光来测量样品中存在的该有机物的方法。该方法的目的是测定BOD，但不涉及有机物通过细菌的降解。Reshetilov A.等人(State of the Art in Biosensors-Environmental and Medical Applications，2013，57-77，InTech)是用于测量BOD的不同方法的综述。在这些方法中，作者提到了利用使用电子传输介质的生物传感器的方法，因此为基于BOD的电化学测量的方法。作者还报道了使用包含快速降解底物的合成标定物的溶液的可能性，特别是OECD指南中提到的2001年的试验303中的那些(http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-303-simulation-test-aerobic-sewage-treatment-a-activated-sludge-units-b-biofilms_9789264070424-en)。
[0009] Murakami Y.等人(Sensors and Actuators B:Chemical InternationalJournal Devoted to Research and Development of Physical and ChemicalTransducers，1998，53，No.3，163-172，Elsevier)描述了电化学系统，其包括对由微生物活性造成的pH变化敏感的固定化细菌。
[0010] Christian Guyard(L’eau,l’industrie,les nuisances,2010,334,51-58)描述了形成申请WO2006/079733的主题的方法，其不测量BOD5，但测定包含在样品中的有机物的生物地球化学活性。美国专利6511822描述了用于电化学检测BOD5的方法，其使用通过谷氨酸-葡萄糖混合物的标定曲线，谷氨酸-葡萄糖混合物是根据NF EN 1899-1的BOD5标准的标准溶液。申请US 2004/326617涉及用于测定BOD5的方法，其基于固定化细菌聚生体降解样品中的可生物降解OM的耗氧量的电化学检测。
[0011] 最近，发明人已经开发了通过荧光和/或微生物活性的比色检测来测量有机底物的可生物降解性，该微生物活性是通过在微生物混合物中添加有机底物而产生的，这使得能够通过标定由此推断每个应用领域的预期值并定量存在的有机物。在申请EP2597461中描述的该方法是以允许自动数据处理的多次测量的形式进行的。这是基于在温育过程中，可生物降解的有机物会被细菌直接同化、或在高分子量聚合物(多糖、多肽等)水解后被同化的事实。不同的分解代谢途径导致丙酮酸盐和/或乙酰辅酶A的产生，其在需氧条件下在Krebs循环中被氧化。在该氧化过程中，辅酶因子被还原(NAD+、FAD等)，然后这些经还原的辅酶因子在呼吸链水平被再氧化，诱导经由ATP合成酶和氧化磷酸化过程产生ATP形式的能量。在需氧条件下，呼吸链水平上的最终电子受体是空气中的氧分子，其经历还原，从而产生水。所用的分子探针会被小部分的氧分子取代作为最终电子受体，并被还原为非常荧光性的化学形式。用这种方法，能够使用荧光测量在有机物降解中所涉及的代谢活性，且该测量与通过细菌的耗氧量直接成比例。该耗氧量正好是定义生物需氧量的量；当后者被测量5天时，其表示为术语BOD5。但是，该方法不是基于包括由不同溶液形成的复合标准品的标定，也不是基于根据温育周期的双重标定。
[0012] Jouanneau S等人(Water Research,2013,49,62-82,Elsevier)综述了用于测量BOD的不同方法，特别是指形成申请EP2597461的主题的发明人的方法。
[0013] 尽管如此，仍然要求提供涉及监测该参数的分析实验室，以及能够调和其日益增长的对收益性和活性的需求的方法。
[0014] 现在，发明人已经发现他们可以利用荧光强度漂移来测量有机物的降解。图1中所示的荧光强度漂移表示O2的消耗率。最容易同化的有机分子被迅速降解(<24h)，而需要几个水解步骤的聚合物在更长的温育时间(>24h)后被降解。
[0015] 基于这些同化的差异，发明人还开发了针对城市废水的复合标准品以产生标定曲线。
[0016] 因此，本发明的主题是通过荧光测量样品的BOD5的标定方法，其基于被称为参考样品或标准溶液(Std1至Std8)的浓度增加的样品，所述参考样品由包含以下组分的相同储备溶液制备：
[0017] i)30mg/L至60mg/L的蛋白胨P1，
[0018] ii)20mg/L至50mg/L的包含最多400个氨基酸的约30kDa至50kDa的多肽P2，[0019] iii)20mg/L至50mg/L的包含最多600个氨基酸的约50kDa至70kDa的多肽P3，[0020] iv)5mg/L至25mg/L的包含15个至25个葡萄糖单元、有利地15个葡萄糖单元的寡糖G1的混合物，
[0021] v)5mg/L至25mg/L的具有支链的多糖G2，其包含几百个至几万个葡萄糖单元，[0022] vi)130mg/L至170mg/L的具有直链的多糖G3，其包含几万个至几百万个葡萄糖单元且为纤维形式，
[0023] 全部蛋白质占溶液中存在的全部有机物的35重量％至45重量％、有利地为40重量％，全部糖占溶液中存在的全部有机物的55重量％至65重量％、有利地为60重量％。储备溶液的组分P1和G1是在30℃下温育小于24小时的过程中可生物降解的有机物，储备溶液的组分P2、P3和G2是在30℃下温育24小时至48小时的过程中可生物降解的有机物，储备溶液的组分G3在30℃下温育48小时的过程中没有或只是轻微地被降解。
[0024] 在本发明的意义内，“蛋白胨”是蛋白质水解的反应产物，“多肽”是动物或植物来源的蛋白质，“寡糖”是例如麦芽糊精的葡萄糖聚合物，“具有支链的多糖”是具有支链的葡萄糖聚合物例如淀粉，“具有直链的多糖”是具有直链的葡萄糖聚合物例如纤维素。
[0025] 在本发明的具体实施方案中，相对于有机物的总质量，表示为％的比值为：
[0026] P1＝15％
[0027] P2和P3＝每种12.5％
[0028] G1和G2＝每种5％
[0029] G3＝50％
[0030] 在本发明的有利实施方案中，蛋白胨P1是弱水解的酪蛋白胨，其包含20重量％至30重量％的游离氨基酸和70％至80％的寡肽和多肽，该寡肽和多肽包含最多200个氨基酸、具有小于25kDa的低分子量。
[0031] 在本发明的另一个有利实施方案中，多肽P2是来自鸡蛋白的白蛋白。
[0032] 在本发明的另一个有利实施方案中，多肽P3是牛血清白蛋白。
[0033] 在本发明的另一个有利实施方案中，糖G1是弱水解的麦芽糊精(右旋糖当量＝约4％至7％)，产生具有平均15个葡萄糖单元的寡糖的混合物。
[0035] 在本发明的另一个有利实施方案中，糖G3是棉纤维纤维素。
[0036] 能够产生标准范围的储备溶液是通过将不同组分(G1至G3和P1至P3)的标准品溶解在盐水溶液中来制备的。盐水溶液对应于在蒸馏水中稀释至1/50的缓冲液(试剂B)。缓冲液 主要是基于在法国BOD5标准(1998年5月的NF EN 1899-
1)中使用的缓冲液，其包含：
1)中使用的缓冲液，其包含：
[0037] KH2PO4＝8.5g/L
[0038] K2HPO4＝21.75g/L
[0039] Na2HPO4·12H2O＝33.4g/L
[0040] NH4Cl＝1.7g/L
[0041] MgSO4·7H2O＝4.5mg/L
[0042] FeCl3·6H2O＝0.25mg/L
[0043] CaCl2＝5.5mg/L
[0044] 根据本发明，所述储备溶液还具有以下特征：
[0045] -通过密封管方法确定的化学需氧量(ST-COD)为340mgO2/L至360mgO2/L(根据2002年的标准ISO 15705测量)，
[0046] -BOD5为120mgO2/L至160mgO2/L(根据1998年5月的标准NF EN1899-1测量)，[0047] -蛋白质的总浓度为100mg/L至130mg/L，有利地115mg/L，
[0048] -糖的总浓度为160mg/L至200mg/L，有利地180mg/L，
[0049] -pH＝7至7.5(根据2001年的标准NF T90-008测量)，
[0050] -电导率＝1.1mS/cm至1.4mS/cm(根据1994年的标准NF EN 27888测量)。
[0051] 本领域技术人员根据其一般常识将能够选择P1至P3和G1至G3的量，使储备溶液具有这些特征。
[0052] 在本发明的有利实施方案中，标准溶液如下：
[0053] 标准品8(Std8)或储备溶液(SS)：有用的BOD5(不含G3)＝约110mgO2/L[0054] 稀释至2/3的标准品7(Std7)或储备溶液(SS)：有用的BOD5(不含G3)＝约73mgO2/L[0055] 稀释至1/3的标准品6(Std6)或储备溶液(SS)：有用的BOD5(不含G3)＝约37mgO2/L[0056] 稀释至1/10的标准品5(Std5)或SS：有用的BOD5(不含G3)＝约11mgO2/L[0057] 稀释至1/15的标准品4(Std4)或SS：有用的BOD5(不含G3)＝约7.5mgO2/L[0058] 稀释至1/30的标准品3(Std3)或SS：有用的BOD5(不含G3)＝约3.5mgO2/L[0059] 稀释至1/75的标准品2(Std2)或SS：有用的BOD5(不含G3)＝约1.5mgO2/L[0060] 标准品1(Std1)或盐水溶液：BOD5＝0mgO2/L
[0061] 在本发明的意义内，“有用的BOD5”是指基于如先前定义的标准溶液而测量的BOD5，其对应于可以在48小时内代谢的物质。因此，它是基于肽P1至P3和多糖G1和G2，G3在48小时后不被代谢。
[0062] 根据其复杂性，构成标准溶液的分子P1至P3和G1至G3在温育过程中或多或少地迅速降解。类似的，由其降解导致的荧光强度根据其矿化的需氧量而变化。因此，降解曲线分为2个区域：0小时至24小时的区域1(Z1)和24小时至48小时的区域2(Z2)。糖G1和蛋白质P1在Z1中被降解，蛋白质P1和P2以及糖G2在Z2中被降解(见图2)。糖G3在48小时内没有被明显降解。对应于区域1和区域2界限的温育时间是指示性的，并且可以根据所考虑的接种物而变化。
[0063] 因为将荧光与耗氧量联系起来的关系不同，区域Z1和Z2被独立地标定，这是由于其组成分子的特性以及考虑温育时的培养基的物理和化学条件是不同的。由于考虑到荧光与BOD5之间联系的不同取决于有机物的降解时间的事实，所以在两个区域中的该标定能够被更精确的测量。在Z1中降解的和Z2中降解的标准品中的BOD5份额是从来自标准品生产的数据和从来自对标准品及其组成分子进行的标准化BOD5测量的数据而计算的，使用如所用的相同接种物，即城市废水净化装置(WWPP)投入物或使用以下配方的商业制剂：
[0064] ％BOD Z1＝
[0065] ([G1].BOD5m-G1+[P1].BOD5m-P1)/Σ[X].BOD5m-X％BOD Z2＝
[0066] ([P2].BOD5m-P2+[P3].BOD5m-P3+[G2].BOD5m-G2)/Σ[X].BOD5m-X
[0067] BOD Z1＝BOD5Stdi×％BOD Z1
[0068] BOD Z2＝BOD5Stdi×％BOD Z2
[0069] 其中：
[0070] X＝G1、G2、G3、P1、P2或P3
[0071] [x]＝以mg/L计的分子X的浓度，其是由用于制备储备溶液进行的称量而计算的，[0072] BOD5m-X＝按照参考BOD5方法，与 方法中使用相同接种物的测量获得的特定于X分子的BOD5——以X的mgO2/mg计，
[0073] Σ[X].BOD5m-X＝由构成储备溶液的每种分子提供的BOD5的总和——以mgO2/L计，
[0074] BOD5Stdi＝标准溶液Std1至Std8的特定BOD5，其是根据参考BOD5方法，用与方法中使用的相同接种物对储备溶液进行的测量而计算的——以mgO2/mg计。
[0075] 最后，得到4条标定曲线：
[0076] -从标准溶液Std1、Std5、Std6、Std7和Std8获得的高范围(HR)标定曲线Z1；
[0077] -从相同的标准溶液Std1、Std5、Std6、Std7和Std8获得的HR标定曲线Z2；
[0078] -从标准溶液Std1、Std2、Std3、Std4和Std5获得的低范围(LR)标定曲线Z1；以及[0079] -从相同的标准溶液Std1、Std2、Std3、Std4和Std5获得的LR标定曲线Z2。
[0080] 在标定线的y轴上绘制的值是对于区域1和区域2的标定曲线分别在Z1和Z2中荧光漂移的曲线下的面积(AUC)。在数学上，这相当于取Z1在24小时和0小时获得的荧光强度之间的差与Z2在48小时和24小时获得的荧光强度之间的差。
[0081] 不同的标准溶液的浓度、由此获得的它们的BOD5值根据所考虑的接种物而变化，且本领域技术人员因而能够调整它们。为了建立标定曲线，点Std1对应于测量空白(没有有机物的缓冲溶液)，点Std2对应于约1.5mgO2/L的BOD5值，点Std5对应于约11mgO2/L的BOD5值，点Std8对应于约110mgO2/L的BOD5值。此外，对于给定的接种物， 方法相对于标准化的BOD5的标定可以使用用于制备范围的储备溶液来检查，并且如果需要的话，可以重新调整。
[0082] 总之，AUC与涉及有机物降解的细菌代谢过程中还原的分子探针的量成比例，并因此与其所需的氧分子的量成正比。与BOD5的等价性是通过代表城市废水的复合标准品获得的，其BOD5已经按照标准化方法测量。
[0083] 为了定量样品，Z1和Z2中的AUC是由在温育过程中进行的荧光测量计算出的，且BOD5值是通过将在Z1中获得的值和在Z2中获得的值相加而建立的标定曲线确定的。高浓度样品(净化装置投入物)是用HR标定曲线定量的，低浓度样品(净化装置产出物)是用LR标定曲线定量的。适用于定量样品的范围选择是根据样品获得的AUC值与标准溶液获得的AUC值相比较而独立地在Z1和Z2之间自动进行的。因此，例如，在Z1中具有大量BOD5并且在Z2中具有很少BOD5的样品的定量将使用Z1中的LR范围和区域2中的HR范围，以保证最准确的可能结果。
[0084] 本发明的主题还是用于快速测量包含可生物降解的有机物的样品中的生化需氧量的方法，所述方法包括以下步骤：
[0085] a)在多孔微孔板内与荧光生物试剂和能够降解待测样品的微生物接种物一起温育：
[0086] -一方面，至少一个包含可生物降解的有机物的样品；以及
[0087] -另一方面，被称为参考样品或标准溶液(Std1至Std8)的浓度增加的8个样品，其由包含以下组分的相同储备溶液制备：
[0088] i)30mg/L至60mg/L的蛋白胨P1，
[0089] ii)20mg/L至50mg/L的包含最多400个氨基酸的约30kDa至50kDa的多肽P2，[0090] iii)20mg/L至50mg/L的包含最多600个氨基酸的约50kDa至70kDa的多肽P3，[0091] iv)5mg/L至25mg/L的包含15个至25个葡萄糖单元、有利地为15个葡萄糖单元的寡糖G1的混合物，
[0092] v)5mg/L至25mg/L的包含几百个至几万个葡萄糖单元的具有支链的多糖G2，[0093] vi)130mg/L至170mg/L的具有直链的多糖G3，其包含几万个至几百万个葡萄糖单元且为纤维形式，
[0094] 全部蛋白质占溶液中存在的全部有机物的35重量％至45重量％、有利地为40重量％，全部糖占溶液中存在的全部有机物的55重量％至65重量％、有利地为60重量％。
[0095] -G1和P1在0至24小时的温育过程中被降解(区域1或Z1)，G2、P2和P3在24小时至48小时的温育过程中被降解(区域2或Z2)，G3在48小时内不被降解，根据降解区域Z1或Z2，所述参考样品或标准溶液使得能够根据参考样品浓度构建4条标定曲线；
[0096] b)分析由所述样品随时间变化发射的荧光，所述荧光分析包括3个步骤：
[0097] -在微生物接种物的作用下，测量待测样品和参考样品在45小时至55小时后、有利地在48小时的降解中所发射的荧光的强度，
[0098] -使用对待测样品测量的所述荧光强度，以通过与对参考样品测量的荧光强度相比来计算参考有机物的浓度，
[0099] -通过应用先前通过比较根据相同方案进行的对参考样品荧光强度测量和根据所述参考样品的BOD5标准进行的测量获得的对应模型，将该有机物的浓度转化成等同于BOD5标准(5天的生物需氧量)的mgO2·L-1值。
[0100] 在实践中，使用荧光强度和转化有机物浓度的步骤可以同时进行，通过标定曲线直接从荧光到以mgO2/L计的值和到根据标准化方法的该标准品的现有特征。
[0101] 根据本发明的方法可以常规地用于定量城市废水(未经处理的、处理期间或处理之后)的BOD5。除城市废水的分析外，所述方法还可以用于具有类似于城市废水特征的任何工业废水样品，即主要由生化分子构成的可生物降解的有机物。因此，该方法已经被证明对农产品和造纸工业的废水有效。如果按照对这种样品的BOD5标准(NF EN 1899-2)所规定的定量界限为0.5mgO2/L，该方法也可以用于地表水和天然水；不管所分析的水的类型，样品必须具有6至8的pH；如果情况并非如此，则必须事先调整pH。
[0103] 对于标准化方法，分析前样品的稀释是基于由COD测定的其全部有机物值，也可以用mgO2/L表示。如果基于COD估算的BOD5小于Std8的BOD5，则样品可以不经处理进行分析；如果不是，样品必须在盐水中适当稀释(试剂B在软化水中稀释至1/50)。由Envolure提供的自动化数据处理程序还使得能够基于测量的COD确定样品的合适稀释率，以及在分析前定义板的方案，即不同标准溶液(标准范围)和样品在微孔板上的位置。样品和标准范围的分析必须进行两次或三次；96孔微孔板因此可以同时分析40个样品两次或分析24个样品三次。因此样品pH的任选的调整，基于其COD和板的方案定义确定样品的稀释构成了分析的第一个步骤。酶标仪/培养箱也必须预先加热到30℃，以使其在到时间时处于正确的温度下。
[0104] 一旦已经进行了这些第一个步骤并且样品已经被稀释，其必须进行预处理。样品的预处理由部分杀菌组成，以抑制天然存在于其中的细菌的活性。这种部分杀菌可以通过任何标准化技术进行，特别是通过微波处理或热处理；本领域技术人员将能够根据待处理的样品的类型和数量来调整要使用的条件。因此，对于25ml的体积，预处理可以通过暴露于微波3分钟进行，或优选地，对于200μL的体积，通过在120℃加热10分钟、然后在4℃冷却10分钟进行。
[0105] 以这种方式，在相同的接种条件下分析样品和标准品(其最初不含细菌)，这使得能够获得可比较的结果。为此，根据上文定义的板的方案，使用微量移液器将事先稀释的样品转移到聚丙烯微孔板中。转移体积为200μL。用铝膜覆盖微孔板以防止挥发，并置于120℃的烘箱中10分钟。在这段时间结束时，将板置于4℃的冰箱中10分钟以恢复至环境温度并使任何蒸气冷凝。
[0106] 在样品的预处理过程中，可以制备接种物。为此，用于此目的的废水(投入到废水净化装置或WWPP)或者使用试剂盒中提供的注射器和注射过滤器以1.2μm过滤，或者以5000g离心30秒。回收滤液或离心的上清液并用盐水稀释(试剂B在软化水中稀释至1/50)。
[0107] 一旦样品已经被预处理并且制备了接种物，可以填充聚苯乙烯微孔板以在存在接种物的情况下温育样品，并且随着时间变化监测荧光。为此，用于分析的每个微孔板孔必须按以下顺序填充：
[0108]
[0109] Std1至Std8对应于前文定义的Std1至Std8
[0110] Ech＝测试样品
[0111] 这些体积必须用微量移液器或分装移液器引入。一旦微孔板填满，将气体渗透膜置于其上。除了允许气体交换以确保有氧外，这种膜还使得能够限制孔内物质的挥发。然后可以将微孔板放入预热至30℃的酶标仪/培养箱中，开始分析序列。分析序列持续48小时，每30分钟进行荧光测量(λex/λem＝540/600nm)。每次荧光测量之前都要进行微孔板的线性搅拌。当分析序列完成后，可以使用Envolure提供的软件程序自动处理原始数据。然后如前文所述计算样品的BOD5。
[0112] 在本发明的有利实施方案中，荧光生物试剂是由Invitrogen-Life Technologies以商品名 销售的刃天青衍生物(CAS号：550-82-3)。
[0113] 在本发明的有利实施方案中，温育温度为25℃至35℃，有利地30℃至35℃，还更有利地等于30℃。在这些温度下，动力学加速使得在标准化方法条件(在20℃下温育)下在仅48小时而不是5天后能够达到BOD5当量。
[0114] 在本发明的有利实施方案中，在pH 7.2的缓冲介质中进行温育，所述缓冲介质能够提供细菌所必需的营养物质：磷、氮和微量元素，有利地在pH 7.2的磷酸盐缓冲液中进行温育。
[0115] 根据本发明，方法可以应用于净化装置废水，其选自未经处理的水、经沉淀的水、经生物处理的水和排放物，地表水或地下水，来自工艺或工业生产的废水或废物。
[0116] 本发明的主题还是用于实施根据本发明的方法的试剂盒，其包括：荧光生物试剂、参考样品和缓冲溶液。
[0117] 下文的实施例1至2和图1和3举例说明本发明。
[0118] 图1示出标准溶液Std1至Std8的荧光强度随时间的漂移；最易于同化的有机分子被迅速降解(<24h)，而需要几个水解步骤的聚合物在较长的温育时间(>24h)后被降解。
[0119] 图2示出3个采样点(○巴黎城市跨省净水工会(SIAAP)的实验室；●密尔沃基城市污水区(MMSD)的实验室和 3号实验室)的BOD5的替代值和参考值之间的相关关系。直线不确定度上限和不确定度下限分别表示由标准方法提供的对于BOD5值所普遍接受的绝对不确定度的上限和下限。
[0120] 图3示出P1、P2、G1和G2的降解曲线；该曲线分为2个区域：0至24小时的区域1(Z1)和24小时至48小时的区域2(Z2)。糖G1和蛋白质P1在Z1中被降解，蛋白质P1和P2以及糖G2在Z2中被降解。
[0121] 实施例1：标定方案
[0122] 由于根据标准化方法的样品的BOD5值可以根据所使用的接种物而变化，所以在方法的任何常规使用之前，必须根据所使用的接种物通过与标准化BOD5方法比较来标定后者。该步骤还使得能够根据接种物的特性明确其制备方案，特别是在将其用于分析之前必须应用的稀释因子。最后，对于每种接种物，确定精确划定两个标定区域(Z1和Z2)的温育时间。对于每种方法，使用下表中所示的溶液：
[0123]
[0124] 根据标准化方法，通过基于Std8值的计算确定Std0至Std7的BOD5值；确定标准溶液Std1至Std8的BOD5值用于所考虑的接种物(BOD5-Stdi)，并确定在Z1中降解的BOD5和在Z2中降解的BOD5的分数，即％BOD Z1和％BOD Z2；这些值可以被集成到自动化程序来处理结果。
[0125] 根据 方法，确定划定Z1和Z2的温育时间(Z1必须含有G1和P1的降解峰；Z2必须含有P2、P3和G2的降解峰)，然后确定接种物的稀释因子：Std1获得的荧光必须尽可能弱，并且Std8的分析必须不会导致由产生的荧光探针产生的限制(饱和)。同时，接种物必须能够在不到48小时内降解P2和P3。因此，接种物的最佳稀释对应于使得验证这两个标准的最佳折衷。
[0126] 在针对给定接种物相对标准化BOD5标定Enverdi-BOD方法并确定接种物的最佳稀释因子后，应该通过比较经由两种方法在BOD5浓度从非常弱到强的不同样品板以及BOD5标准中建议的对照样品中获得的结果来验证该标定和该接种物稀释。如果需要，可以在该步骤中调整接种物的标定或稀释，以在相同样品和相同接种物的情况下获得两种方法在统计学上可比的结果。为进行该标定，使用了弱BOD5至非常弱BOD5(<20mgO2/L)的20个样品和中等BOD5至高BOD5(>20mgO2/L)的20个样品。210mgO2/L的谷氨酸-葡萄糖(GAG)对照样品被用作BOD5标准的对照。
[0127] 也可以使用混合的标准溶液进行标定：Std Z1(G1溶液和P1溶液的混合物，分别为15mg/L和45mg/L)，Std Z2(P2溶液、P3溶液和G2溶液的混合物，浓度分别为35mg/L、35mg/L和15mg/L)和对应于含有G1、P1、P2、P3、G2和G3的标准溶液本身的Std8，G1、P1、P2、P3、G2和G3的浓度分别为15mg/L、45mg/L、35mg/L、35mg/L、15mg/L和150mg/L。
[0128] 实施例2：比较根据本发明的方法和标准方法(US标准和EU标准)获得的结果[0129] 1.流程
[0130] 在20天内收集来自MMSD(密尔沃基，美国)和SIAAP(巴黎，法国)的多个净化装置的、平均经过24小时的未经净化的和经处理的污水的总共109个样品。将这些样品储存在4℃，并在48小时内分析。就在分析之前，使用设定为最小功率(<200W)的微波炉对25ml的样品进行3分钟至7分钟的部分灭菌以减少其天然细菌负载。灭菌之前和之后进行的BOD5和COD测量显示该流程对有机物的含量和可生物降解性没有影响。
[0131] 接种物是通过离心来自一个净化站(30s，2000×g)的未经净化的污水以去除颗粒来制备的。
[0132] 按照试剂盒中给出的步骤，在所有样品上使用 试剂盒(Envolure，France et Envolus，美国)，在96孔微孔板中混合适当体积的荧光试剂、缓冲溶液和接种物与样品或标准溶液。除了接种物外，试剂盒中还提供了所有的试剂和标准溶液。每隔15分钟使用荧光酶标仪(FLx800，Biotek，美国)记录荧光(λex.＝540nm，λem.＝600nm)，其还用于在30℃温育以及搅拌微孔板48小时。
[0133] 然后，使用基于试剂盒提供的标准溶液模型，将荧光数据转化成以mgO2.L-1计的BOD5。与样品完全相同地处理这些标准溶液，并且使用其响应来推断其BOD5。
[0134] 按照标准化方法(MMSD的标准方法5210和SIAAP的NF EN 1899-1)对所有样品进行标准BOD5。
[0135] 使用三种最常用的统计测试检验通过 和标准方法测量的BOD5值之间的等价性：最小平方线性回归、Bland和Altman法以及Wilcoxon测试。使用XLSTAT软件(Addinsoft，法国)进行这些测试。
[0136] 2.结果
[0137] 用替代方法测得的超过80％的BOD5值位于标准方法的绝对不确定范围内(见图2)。替代结果与标准BOD5测量一致：测定系数(R2)均大于0.9，斜率非常接近于1。
[0138] 获得的结果证明了，通过标准方法US-EPA 5210(http://www.polyseed.com/misc/bod-std％20methods-8.04.pdf)和1998年5月的NF EN 1899-1(在法国和美国的3个不同地点进行的一项133个样品的研究)获得的那些在统计学上是等价的。
[0139] 根据本发明的方法，由于以下因素而允许准确定量实际样品的BOD5：
[0140] -使用发明人专门研发的单一标准溶液来模拟真实样品的可生物降解的有机物，[0141] -温育时间为45小时至50小时、有利地等于48小时，温度为25℃至35℃、有利地等于30℃，
[0142] -在0小时至24小时和24小时至48小时的2个区域的标定，和
[0143] -在分析前对实际样品进行预处理。
[0144] 这种简单而快速的方法表现出与用标准化方法1998年5月的NF EN1899-1获得的性能相同的性能。
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