使用氨基酸离子液体的羰基硫介导多肽合成
阅读：329发布：2020-05-13
专利汇可以提供使用氨基酸离子液体的羰基硫介导多肽合成专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种使用 氨 基酸 离子液体 的羰基硫介导多肽合成方法。所述氨基酸离子液体为带有保护基团的氨基酸为阴离子，咪唑鎓类为阳离子的离子液体。所述合成方法主要为：以多肽合成用预载 树脂 作为起始材料，通过含有羰基硫的氨基酸离子液体为可回收的反应物，进行氨基酸偶合反应，生成多肽链。采用本 发明 所述的合成方法可以在数分钟内室温下完成不需要 溶剂 、 碱 和其他添加剂残余的偶合反应，以高产率快速合成多肽。本发明所述的合成方法工艺简单，成本低廉，绿色环保，显示出极高的实用性和 可持续性 。，下面是使用氨基酸离子液体的羰基硫介导多肽合成专利的具体信息内容。
1.一种使用氨基酸离子液体的羰基硫介导多肽合成方法，其特征是：以带有保护基的氨基酸离子液体为反应物，羰基硫介导的多肽固相化学合成方法，包括如下主要步骤：(1)依照多肽的氨基酸序列，制备吸收了羰基硫的带有保护基的对应种类氨基酸离子液体；(2)将预载有氨基酸的多肽合成树脂溶胀后去保护，再与对应种类的氨基酸离子液体混合进行偶合反应；(3)反应完成后以溶剂洗去氨基酸离子液体；(4)添加下一个对应种类的氨基酸离子液体进行下一步偶合反应；(5)反应完成后以溶剂洗去氨基酸离子液体；(6)依照多肽长度情况，可重复步骤(4)与(5)直到完成肽链的合成；(7)对肽链去保护后，将肽链从树脂上化学切除，纯化后获得多肽产品。
使用氨基酸离子液体的羰基硫介导多肽合成
所属技术领域：
[0003] 早在1971年，羰基硫，一种存在于火山气中的天然气体，就被推测可能在生命起源初期的多肽形成中起到了关键的作用[1]。在接下来的生命起源化学的研究结果显示，羰基硫可与α氨基酸反应生成羧酸酐类(NCAs)，其可以与氨基酸进一步缩合，进而在碱性缓冲溶液中形成肽键[2,3]。然而，肽产物的生成相当缓慢(在56小时内，二肽的产率仅为6.8％)。即使在使用铁氰化钾或氯化铅作为催化剂的优化条件下，其产率仍低于50％[3]。因此，羰基硫介导方法的效率仍然远远不能满足顺序肽合成的最低要求。
[0004] 离子液体是一种对多肽溶解力超凡的绿色溶剂。在我们以前的工作中，多肽天然化学连接反应(Native chemical ligation)可在没有任何添加剂的情况下，在无水咪唑基离子液体中有效地实现[4]。这一发现启发我们尝试以咪唑基的氨基酸离子液体(AAILs)[5,6]来代替普通氨基酸进行羰基硫介导的多肽合成。我们期望在无须溶剂的情况下，氨基酸离子液体可以通过极大提升反应物浓度而促进偶联反应。此外，由于离子液体被认为是良好的二氧化碳溶剂[7,8]，羰基硫也同样可能易于被氨基酸离子液体捕获。发明内容：
[0005] 本发明提出了使用新型氨基酸离子液体的羰基硫介导的Fmoc(芴甲氧羰基)固相肽合成方法(OCS-SPPS)。本发明以预装氨基酸的 树脂用作起始材料，这是因为它在二甲基甲酰胺(DMF)和基于咪唑的离子液体中具有优异的溶胀性[9]。通过羰基硫介导的固相肽合成方法组装延长了肽链。在每个偶联/去保护循环中，无需额外的试剂或溶剂，将所需羰基硫饱和的氨基酸离子液体与被二甲基甲酰胺溶胀了的树脂直接混合，然后使用 20％哌啶(piperidine)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液除去肽链上的Fmoc保护基团。
最后通过三氟乙酸鸡尾酒试剂将多肽从树脂上切下。作为示例，其三肽的合成流程如下：
最后通过三氟乙酸鸡尾酒试剂将多肽从树脂上切下。作为示例，其三肽的合成流程如下：
[0006]
[0007] 其中AA代表氨基酸，[Fmoc-AAn]代表Fmoc基团保护的氨基酸阴离子，AA下标的数字n代表C端氨基酸的顺序位置，[emim]代表1-乙基-3-甲基咪唑鎓阳离子。
[0008] 本发明提供的使用新型氨基酸离子液体的羰基硫介导的Fmoc固相肽合成方法，和现有技术相比，具有如下创新与优势：
[0009] 1.本发明首次合成并应用了全新的带有保护基的氨基酸离子液体；
[0010] 2.本发明首次成功应用羰基硫实现了多肽的固相化学合成；
[0011] 3.本发明实现了不需要溶剂，碱和任何有机缩合剂的全新多肽合成。整个反应体系中基本只有反应物和产物存在，因此反应环境温和，工艺极其简单且绿色安全；
[0012] 4.本发明提供的多肽合成方法中的过量反应物可完全回收重复使用，是目前已知的化学经济性最高的多肽合成方法。
[0014] 图1中所示的是一类Fmoc保护的新型氨基酸离子液体的性状。
[0015] 图2中所示的是羰基硫在缓冲溶液或氨基酸离子液体中的摩尔吸收比。
[0016] 图3是示例中的四肽Thr-Asn-Ser-Tyr的HPLC与质谱分析结果。
[0017] 图4A是示例中的多肽Thymosinα1的氨基酸序列。
[0018] 图4B是示例中的对应多肽Thymosinα1合成收率的氨基酸离子液体重复利用效能。
[0019] 图5是示例中的通过应用新鲜配制的氨基酸离子液体或回收后“重新激活”的氨基酸离子液体而合成的多肽Thymosinα1的HPLC与质谱分析结果。具体实施方式：
[0020] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021] 下述实施例中所使用的实验材料、试剂等均可通过商业途径或已知实验方法获得。
[0022] 实施例1.新型氨基酸离子液体的制备。
[0023] 通过商业可得的Fmoc保护氨基酸与碱性咪唑鎓盐溶液的简单1:1中和反应后，得到一系列全新的氨基酸离子液体。
[0024] 反应方程式为：
[0025]
[0026] 其中，Ala为丙氨酸，Tyr为酪氨酸，Leu为亮氨酸，Ile为异亮氨酸，Ser为丝氨酸，Val为颉氨酸，Thr为苏氨酸，Asp为天冬氨酸，Asn为天冬酰胺，Glu为谷氨酸，Lys为赖氨酸， Me为甲基，tBu为叔丁基，Trt为三苯甲基，Boc为叔丁氧羰基。
[0027] 所得产品为一系列全新的Fmoc保护的氨基酸离子液体(图1：离子液体外观)。
[0028] 实施例2.新型氨基酸离子液体的捕获羰基硫能力测试。
[0029] 在大气压力下，所制备氨基酸离子液体通过重量分析法测试对于羰基硫的捕获能力。图2 显示每摩尔的碱性缓冲液能够吸收大约0.007摩尔的羰基硫[3]，而羰基硫与氨基酸离子液体的吸收摩尔比高达0.11至0.16。因此，氨基酸离子液体可在不添加碱的情况下有效捕获羰基硫，从而可为多肽合成提供温和的反应环境。
[0030] 实施例3.使用新型氨基酸离子液体的羰基硫介导的四肽合成。
[0031] 为验证新合成方法的实用性，我们在不同条件下合成了四肽Thr-Asn-Ser-Tyr。
[0032] 将适量0.5mmol/g预装氨基酸的 树脂装入25毫升多肽注射器，以二甲基甲酰胺溶胀后，添加溶于二甲基甲酰胺4倍当量的对应氨基酸与添加剂或无溶剂的饱和羰基硫的氨基酸离子液体，充分震荡混合后，以二甲基甲酰胺洗去过量反应物，重复以上步骤只至完成四肽链的合成，然后使用20％哌啶(piperidine)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液除去肽链上的Fmoc保护基团，最后添加三氟乙酸鸡尾酒试剂K(三氟乙酸:苯酚:
水:茴香硫醚:1,2- 乙二硫醇＝82.5:5:5:5:2.5)将多肽从树脂上切下。多肽产品通过乙醚沉淀后收集。
水:茴香硫醚:1,2- 乙二硫醇＝82.5:5:5:5:2.5)将多肽从树脂上切下。多肽产品通过乙醚沉淀后收集。
[0033] 与常规的固相多肽合成方法相比，使用羰基硫饱和的氨基酸离子液体的多肽合成显著缩短了偶合反应时间并且产率大大提高(表1，序号1，3)。为了研究羰基硫介导多肽合成中的消旋情况，我们也通过反相高效液相色谱法测定多肽中间体Asn-Ser-Tyr的空间异构体，结果并未检测到消旋。在没有羰基硫的情况下，多肽偶合完全无法进行(表1，序号2)。这一事实显示，羰基硫在应用氨基酸离子液体的多肽合成中是不可或缺的。然而，提升温度并未促进羰基硫介导固相多肽合成，而是导致了严重的天冬酰胺去酰胺化(序号4)。我们也发现，在反应体系中添加水，会阻碍羰基硫介导多肽合成中的肽形成(图3：HPLC与质谱分析结果)。
[0034] 表1.常规与羰基硫介导固相多肽合成法制备四肽Thr-Asn-Ser-Tyr。
[0035]
[0036] 实施例4.使用新型氨基酸离子液体的羰基硫介导的二十八肽Thymosinα1合成与氨基酸离子液体的回收重复利用。
[0037] 基于以上结果，我们以Thymosinα1(图4A)，一种生物活性二十八肽[10,11]，来验证羰基硫介导多肽合成对于长肽的适用性。因为Thymosinα1序列含有连续的β-支链氨基酸，易于在合成过程中凝聚，所以被认为是一种“困难”多肽[12,13]。
[0038] 将适量0.5mmol/g预装氨基酸的 树脂装入25毫升多肽注射器，以二甲基甲酰胺溶胀后，添加无溶剂的饱和羰基硫的氨基酸离子液体，充分震荡混合后，以二甲基甲酰胺洗去过量反应物，重复以上步骤只至完成二十八肽链的合成，然后使用
20％哌啶 (piperidine)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液除去肽链上的Fmoc保护基团，最后添加三氟乙酸鸡尾酒试剂B(三氟乙酸:苯酚:水:三异丙基硅烷＝88:5:5:2)将多肽从树脂上切下。多肽产品通过乙醚沉淀后收集，获得粗肽产率为92.7％。
20％哌啶 (piperidine)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液除去肽链上的Fmoc保护基团，最后添加三氟乙酸鸡尾酒试剂B(三氟乙酸:苯酚:水:三异丙基硅烷＝88:5:5:2)将多肽从树脂上切下。多肽产品通过乙醚沉淀后收集，获得粗肽产率为92.7％。
[0039] 除了合成效率，另一个是羰基硫介导多肽合成方法的重要问题是氨基酸离子液体的回收与重复利用。未反应的多余氨基酸离子液体在每次偶合步骤后经由二甲基甲酰胺洗出，再以乙醚洗涤后干燥。然而，随着回收氨基酸离子液体次数的增加，多肽产率也在逐渐降低(图 4B)。产率的下降可能是因为回收的过程中羰基硫从离子液体中流失导致的。因此我们对回收的氨基酸离子液体重新通入羰基硫气体来恢复羰基硫的浓度。我们发现，即使在回收五次后，“重新激活”的氨基酸离子液体仍能提供与新鲜配制的氨基酸离子液体(多肽收率51％) 媲美的多肽收率(50％)(图4B，图5：HPLC与质谱分析结果)。
[0040] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均包括在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0041] 参考文献：
[0042] 1.Seyferth,D.；Marmor,R.S.；Hilbert,P.J.Org.Chem.1971,36(10),1379.[0043] 2.Katakai,R.；Nakayama,Y.Biopolymers 1976,15(4),747.
[0044] 3.Leman,L.Science.2004,306(5694),283.
[0045] 4.Kühl,T.；Chen,M.；Teichmann,K.；Stark,A.；Imhof,D.Tet-rahedron Lett.2014,55(27), 3658.
[0046] 5.Fukumoto,K.；Yoshizawa,M.；Ohno,H.J.Am.Chem.Soc.2005,127(8),2398.[0047] 6.Ohno,H.；Fukumoto,K.Acc.Chem.Res.2007,40(11),1122.
[0048] 7.Hasib-ur-Rahman,M.；Siaj,M.；Larachi,F.Chem.Eng.Pro-cess.Process Intensif. 2010,49(4),313.
[0049] 8.Cadena,C.；Anthony,J.L.；Shah,J.K.；Morrow,T.I.；Brennecke,J.F.；Maginn,E.J.J. Am.Chem.Soc.2004,126(16),5300.
[0050] 9.Lawrenson,S.；North,M.；Peigneguy,F.；Routledge,A.Green Chem.2017,19(4), 952.
[0051] 10.Goldstein,A.L.；Low,T.L.；McAdoo,M.；McClure,J.；Thur-man,G.B.；Rossio,J.；Lai, C.Y.；Chang,D.；Wang,S.S.；Harvey,C.；Ramel,A.H.；Meienhofer,J.Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.1977,74(2),725.
[0052] 11.GARACI,E.Ann.N.Y.Acad.Sci.2007,1112(1),14.
[0053] 12.García-Ramos,Y.；Giraud,M.；Tulla-Puche,J.；Albericio,F.Biopolymers 2009,92(6), 565.
[0054] 13.Paradís-Bas,M.；Tulla-Puche,J.；Albericio,F.Chem.Soc.Rev.2016,45(3),631.
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种提高甘蔗抗宿根矮化病的有机肥及其制备方法 | 2020-05-12 | 73 |
| 一种自洁净渣土聚合物的制备方法 | 2020-05-12 | 560 |
| 一种通风窗底板搅拌摩擦焊焊接工装与方法 | 2020-05-12 | 184 |
| 一种可以有效增强水稻抗逆性的水溶性肥料及其制备方法 | 2020-05-12 | 59 |
| 一种医院用智能化控费系统 | 2020-05-13 | 457 |
| 一种水稻一种两收优质丰产种植方法 | 2020-05-08 | 349 |
| 一种生物试剂生产用自动配料装置 | 2020-05-08 | 403 |
| 一种塑料编织袋清洗装置 | 2020-05-12 | 807 |
| 一种烟囱式大棚太阳能储能发电系统 | 2020-05-08 | 974 |
| 促进鸳鸯繁殖的装置 | 2020-05-11 | 709 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈