技术领域
[0001] 本
发明涉及生物医药领域，具体说是一种用于制备可吸收生物修复骨蜡的材料与方法及应用。
背景技术
[0002] 松质骨结构松散、血运丰富，创面出血多为渗血，难以靠血管收缩自行
止血，也难以靠电凝、钳夹、止血纱布、明胶海绵填塞等常规方法进行止血。最有效的方法是迅速填充松质骨表面裂缝，中止渗血过程进而激活血管内、外凝血途径达到止血目的。临床上用到最多的是骨蜡进行松质骨创面止血。
[0003] 骨蜡，主要成分为蜂蜡，一般由蜂蜡和凡士林组成，可通过物理封堵骨髓部毛细血管渗血以达到止血目的，是目前最广泛应用于外科手术骨出血的
止血剂。骨蜡
生物相容性差且难以被基体降解、吸收，残留在局部会对骨愈合造成很大障碍，故其只是机械的物理屏障作用，会阻碍血液成分的聚集，不利于原始骨痂的形成，导致骨骼愈合不良，甚至骨
坏死，影响
骨再生。另外，由于骨蜡不能够降
解吸收，会作为异物长期留在体内，形成异物肉芽肿，引起局部
疼痛、渗液等症状，这样既降低了组织的抗感染能
力，又增加了术后感染发生的概率。
[0004] 有一些研究者尝试
氧化
纤维素、聚乳酸或多聚糖等替代传统骨蜡，虽然这些材料的生物相容性好、可降解吸收，但大多数为粉状、胶状，其止血机制是粘附聚集血小板形成血栓而止血，而松质骨创面出血不止是因为骨创面组织结构松散，血运丰富形成密布的血窦，组织中血管收缩性差，血小板聚集，血
凝块难以黏附于创面，易被血液或体液冲走。同时也由于此类材料物理性状不易改性，价格昂贵等问题导致目前市面上无适宜的骨创面止血材料。
[0005] 壳聚糖是一种生物高分子
聚合物，其化学名称为β-(1,4)-2-
氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是甲壳素(β-(1,4)-2-乙酰基-2-脱氧-D-葡聚糖)经过脱乙酰基形成的。壳聚糖属于直链状生物高分子化合物，主要是氨基
葡萄糖单体由β-1,4-糖苷键连接形成的，可对其分子链上的羟基和氨基进行化学修饰，经过化学修饰使其多种功能多样化。壳聚糖具有无毒、无刺激、无免疫源、无热源反应、不溶血、可自然降解和生物可降解以及组织相容性和生物相容性等特点，还具有抗菌、消炎、止血、减少创面血液渗出和促进创面组织再生、修复、愈合的作用以及易于形成凝胶的性质，这些都赋予它作为止血材料的良好性能。
发明内容
[0006] 针对
现有技术中存在的
缺陷，本发明的目的在于提供一种用于制备可吸收生物修复骨蜡的材料与方法及应用，所述骨蜡具有使用方便、可任意塑形、黏附性好、可被降解吸收、对人体无毒
副作用等优点。
[0007] 为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种用于制备可吸收生物修复骨蜡的材料，包括矿化胶原、壳聚糖、
硫酸钙和
水，其配比为20-45wt％、10-20wt％、10-30wt％、5-30wt％。
[0009] 在上述材料中，为了保持良好的热
稳定性，所述矿化胶原、壳聚糖、硫酸钙和水的配比优选为45wt％、10-20wt％、10-30wt％、10-30wt％；
[0010] 在上述材料中，为了便于注射使用，所述矿化胶原、壳聚糖、硫酸钙和水的配比优选为45wt％、15-20wt％、10-30wt％、10-30wt％；
[0011] 在上述材料中，优选的，所述矿化原胶为羟基
磷灰石-胶原复合物；更优选的，所述矿化原胶中羟基磷灰石与胶原的
质量比为(1-5)：1，优选2.33:1；
[0012] 所述硫酸钙具体可为半水硫酸钙。
[0013] 本发明还提供了一种可吸收生物修复骨蜡的制备方法，包括将矿化胶原、壳聚糖、硫酸钙和水进行物理共混的步骤，其中，所述矿化胶原、壳聚糖、硫酸钙和水的配比为20-45wt％、10-20wt％、10-30wt％、5-30wt％；
[0014] 在上述制备方法中，为了保持良好的
热稳定性，所述矿化胶原、壳聚糖、硫酸钙和水的配比优选为45wt％、10-20wt％、10-30wt％、10-30wt％；
[0015] 在上述制备方法中，为了便于
微创手术注射使用，所述矿化胶原、壳聚糖、硫酸钙和水的配比优选为45wt％、15-20wt％、10-30wt％、10-30wt％；
[0016] 优选的，所述矿化原胶为羟基磷灰石-胶原复合物；
[0017] 更优选的，所述矿化原胶中羟基磷灰石与胶原的质量比为(1-5)：1，优选2.33:1；
[0018] 在具体实施时，所述矿化胶原、壳聚糖、硫酸钙和水的配比为20wt％、20wt％、30wt％、30wt％，30wt％、20wt％、30wt％、20wt％，45wt％、20wt％、30wt％、5wt％，45wt％、
20wt％、20wt％、15wt％，45wt％、20wt％、10wt％、25wt％，45wt％、15wt％、30wt％、10wt％，
45wt％、15wt％、20wt％、20wt％，45wt％、15wt％、10wt％、30wt％，45wt％、10wt％、30wt％、
15wt％，或45wt％、10wt％、20wt％、25wt％。
[0019] 其中，配比为45wt％、20wt％、20wt％、15wt％，45wt％、20wt％、10wt％、25wt％，或45wt％、15wt％、10wt％、30wt％时可注射性能良好，适用于微创手术。
[0020] 所述硫酸钙具体可为半水硫酸钙。
[0021] 在上述方法中，优选的，所述矿化原胶按照包括如下步骤的方法制备：
[0022] S1、将
胶原蛋白溶解于酸中，得到第一溶液；
[0023] S2、向所述第一溶液中加入含Ca2+的溶液并持续搅拌，得到第二溶液；
[0024] S3、向所述第二溶液中加入含PO43-的溶液并持续搅拌，得到第三溶液；
[0025] S4、调节所述第三溶液的pH值至4.0-7.5(优选为7.0)，并收集沉淀，得到所述矿化原胶。
[0026] 在上述方法中，所述第一溶液中胶原蛋白的浓度为2-8mg/mL，优选为5mg/mL；
[0027] 所述Ca2+与所述胶原蛋白的用量比例为1g所述胶原蛋白:(0.01-0.1mol)所述Ca2+；
[0028] 所述Ca2+与所述PO43-的用量摩尔比为1:1.2。
[0029] 在上述方法中，步骤S1中，所述酸为乙酸、
盐酸或
硝酸，优选为乙酸；
[0030] 所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Ⅺ型胶原蛋白、ⅩⅩⅣ型胶原蛋白或ⅩⅩⅦ型胶原蛋白，优选为Ⅰ型胶原蛋白；
[0031] 步骤S2中，所述含Ca2+的溶液为Ca(NO3)2溶液、和/或CaCl2溶液，优选为Ca(NO3)2溶液；
[0032] 所述含Ca2+的溶液中Ca2+浓度为0.01-0.1mol/L；
[0033] 步骤S3中，所述含PO43-的溶液为(NH4)2HPO4溶液、K2HPO4溶液、KH2PO4溶液、Na2HPO4溶液、和/或NaH2PO4溶液，优选为(NH4)2HPO4溶液；
[0034] 所述含PO43-的溶液中PO43-浓度为0.01-0.5mol/L。
[0035] 步骤S4中，还包括对所述沉淀进行洗涤、
冷冻干燥、和/或
研磨的步骤；所述矿化原胶为粉末状；
[0036] 所述调节所述第三溶液的pH值使用强
碱溶液进行；所述强碱溶液的浓度为0.5-1.5mol/L，优选1.0mol/L；所述强碱溶液为NaOH溶液和/或KOH溶液。
[0037] 本发明还提供了以上任一所述的材料在制备可吸收生物修复骨蜡中的应用。
[0038] 本发明还提供了一种可吸收生物修复骨蜡，其包含以上任一所述的材料，或者，由以上任一所述方法制备得到。
[0039] 本发明还提供了所述可吸收生物修复骨蜡在制备骨创面止血
试剂中的应用，所述骨创面止血优选为松质骨创面止血。
[0040] 本发明所述可吸收生物修复骨蜡，具有如下有益效果：
[0041] (1)可塑成任意形状，使用方便，快速填充创面的裂隙；(2)黏附性好，可附着于创面处，不易脱落；(3)完成止血功能后，可逐渐被降解吸收；(4)生物相容性好，对身体无毒副作用；(5)可促进创面愈合。
附图说明
[0042] 此处所说明的附图用来提供对本
申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性
实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0043] 图1为测试样品涂抹在人工骨小梁的粘附性能结果，其中，(a)空白、(b)测试样品1、(c)测试样品5、(d)测试样品7、(e)测试样品9。
[0044] 图2为测试样品6的防溃散情况，其中，(a)振荡前(b)开始溃散(c)完全溃散。
[0045] 图3为测试样品6在降解时间测试时完全降解的情况。
[0046] 图4为测试样品1—3的热稳定性测试结果。
具体实施方式
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049] 下述实施例中所用的壳聚糖的脱乙酰度为80～95％，
粘度为50～800mPa·s。
[0050] 下述实施例中所用的I型胶原蛋白来源于
牛跟
腱。
[0051] 下述实施例中所用的传统骨蜡为强生(上海)医疗器材有限公司产品，注册证书编号为国械注进20163463039，其是由75％蜂蜡、15％
石蜡和10％棕榈异丙酯组成的不可吸收性蜡混合物。
[0052] 实施例1、一种可吸收生物修复骨蜡的制备
[0053] (1)将一定量的I型胶原蛋白溶解于乙
酸溶液中，形成了浓度为5mg/mL I型胶原蛋白/乙酸溶液200mL，然后逐滴加入浓度为0.01mol/mL的Ca(NO3)2水溶液6mL，搅拌10min，再逐渐滴入浓度为0.012mol/mL的(NH4)2HPO4水溶液6mL，均匀搅拌10min。通过1.0mol/LNaOH调节pH值，当pH值快接近4时，开始出现白色沉淀，随着pH值的变大，沉淀越来越多，胶原纤维析出水溶液中，调至pH值为7时，静置。除去上层清液，离心得到沉淀，并通过纯化水反复清洗，冷冻干燥，研磨成粉，即得到了矿化胶原粉末，所述矿化胶原粉末为羟基磷灰石-胶原复合物，其中羟基磷灰石的化学式为Ca10(PO4)6(OH)2，羟基磷灰石与胶原的质量比约为2.33:1。
[0054] (2)将矿化胶原粉末、壳聚糖、半水硫酸钙和水按照不同的质量比(如表1所示)进行物理共混，得到不同测试样品，其形态为橡皮泥状。
[0055] 表1、不同测试样品的组分
[0056]
[0057] 实施例2、可吸收生物修复骨蜡的性能测试
[0058] 将实施例1中表1所示测试样品分别进行如下步骤1—6的性能测试分析：
[0059] 1、稠度
[0060] 稠度是衡量材料固态或流动性的程度。
[0061] 参考ISO1566《牙科用
磷酸锌粘固剂》中牙科磷酸锌
水泥测定方法，将可吸收骨蜡稠度定义为：取2.5g测试样品，团成球状，用1kg的砝码通过塑料板压于其上所得圆的直径。用圆的直径来表示样品的稠度，圆的直径越大，样品的稠度越小。同一样品测定3个样本，且每个圆测定垂直和横向两个直径，并取平均值，结果如表3所示。
[0062] 表3结果表明，样品的稠度值的大小与壳聚糖和半水硫酸钙的比例有关，壳聚糖组分的比例越高，半水硫酸钙组分的比例越低，样品的稠度值越大。同时，样品的稠度值影响产品的可注射效果和防溃散能力，稠度值越大，可注射性越好，防溃散能力越高。
[0063] 传统骨蜡的稠度值为18.0mm，这是由于传统骨蜡的质地较硬，延展性差。
[0064] 2、可注射性能评价
[0065] 可注射性能评价标准如表2所示，结果如表3所示。
[0066] 表2、测试样品用27#针头的注射效果评价
[0067]
[0068] 表3结果表明，测试样品4、5、8和CK4可注射性能最佳。样品的可注射性能与其稠度有很大关系，从表3中可以看出，当样品的稠度大于30时，其注射性能明显变强。
[0069] 当样品的可注射性能评分在0—2时，其可注射性能良好，适用于微创手术。当样品的可注射性能评分为3或4时，其可注射性能差，适用于开放型手术，如开颅手术中颅骨的修复。
[0070] 传统骨蜡的可注射性能评分为4，其很难注射，只适用于开放型手术。
[0071] 3、粘附性能
[0072] 取0.2g测试样品，涂在人工骨小梁表面，室温条件下观察在3min时间内是否有掉渣现象，密实程度是否好，部分结果如图1所示。
[0073] 图1结果显示，测试样品1、5、7、9均能很好地黏附在人工骨小梁表面，且不易脱落，其它测试样品与测试样品1、5、7、9的结果相同。
[0074] 传统骨蜡质地较硬，需要通过加热或手温，使传统骨蜡变软，才能很好地贴附于人工骨小梁的表面。
[0075] 4、防溃散性能
[0076] 取0.2g各测试样品，团成球状，放置在样品瓶，加入15mL水，打开摇床，在转速为150r/min和水温为37℃的条件下，观察样品的防溃散性能。结果如图2和表3所示。
[0077] 以测试样品6为例，从图2(a)可以看出溃散前，溶液很澄清，随着时间的进行，样品开始发生溃散，溶液开始变浑浊(图2(b))。当样品完全溃散，溶液变得十分浑浊(图2(c))。
[0078] 从表3中可以看出，测试样品1-10在3min内均未发生溃散，完全溃散的时间大于90min。而CK1在2.8min时开始发生溃散，完全溃散的时间为80min。这是因为CK1样品中的壳聚糖比例较低，样品颗粒之间不能很好地粘连在一起，水分很容易侵入样品中。样品的防溃散能力与其有效作用时间有很大关系。因为当样品涂抹于与体液
接触的部位，例如颅骨与
脑脊液接触，在体液的浸泡和冲击下，如样品防溃散能力差的话，不能很好地起到物理封堵止血的作用。
[0079] 传统骨蜡的主要成分为蜂蜡，不溶于水，故具有很好的防溃散性能。此性能会影响样品的降解能力，具体见下述步骤5。
[0080] 5、降解时间
[0081] 取0.2g各测试样品，团成球状，放入装有浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液的样品瓶中，密封后放置于恒温水浴
振荡器中，在转速为150r/min和水温为37℃的条件下，进行降解。观察样品完全降解的时间。
[0082] 以测试样品6为例，测试样品6完全降解后，溶液变得十分浑浊(图3)。从表3中开始看出，测试样品1-10的降解时间为4.5—9h之间。CK1和CK2测试样品的降解时间分别为3.0h和3.5h。CK1测试样品降解时间短是因为样品的防溃散能力弱，碱溶液很容易侵入到样品中，导致样品降解速度快。CK2测试样品中矿化胶原组分的比例最低，矿化胶原中羟基磷灰石的降解速率最慢，而且其防溃散能力较差。导致CK2测试样的降解时间短。
[0083] CK3和CK4测试样品的降解时间为10h和9.5h，其降解时间比测试样品1-10略长。这是因为这两个样品的壳聚糖组分比例高，壳聚糖能够很好的把样品粘连成团，氢氧化钠溶液不容易侵入到样品内部，导致测试样品的降解时间变长。样品的降解时间关系到作用时间，如样品的降解时间过短，不能起到很好的物理封堵作用，如样品完成其止血和促进
骨修复作用后，仍不完全降解时，在体内会引起异物反应。故优选样品1-10。
[0084] 传统骨蜡12h后，仍不降解。在体内是不可吸收，很容易产生异物反应，引起
炎症等不良效果。
[0085] 6、热稳定性
[0086] 通
过热失重分析仪来测定样品的稳定性。取质量约为5mg的样品，在氮气的氛围内，以20℃/min的速率从室温升高到1000℃。
[0087] 以样品1-3为代表，将其热稳定性能展示在图4中。从图4中可以看出，每种样品均随着
温度的升高，样品重量急剧下降，然后缓慢下降。等温度升高到1000℃时，样品的剩余质量值随着矿化胶原比例的增加，而逐渐变大。这是由于矿化胶原中的羟基磷灰石的热稳定性好。随着矿化胶原比例的增加，样品的热稳定性能逐渐提高。其它测试样品的热稳定曲线与样品1-3类似。
[0088] 矿化胶原中的羟基磷灰石是一种具有良好的生物相容性，可刺激骨形成和骨结合的
生物活性材料，同时具有很好的热稳定性。故在以上测试样品中，优选测试样品3-10。
[0089] 表3、测试结果
[0090]
[0091] 本
说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的
权利要求范围之内。
