技术领域
[0001] 本
发明涉及细胞
生物学技术领域，特别是涉及一种间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法。
背景技术
[0002] 冷冻保护液(Cryoprotectant)是指可以保护细胞在极低温的环境中免受冻伤的物质，也称为细胞冻存液。在细胞悬液中加入
冷冻保护剂可以保护细胞免受溶液损伤和
冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的
水分子结合，发生水合反应，弱化水的结晶，使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中
电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。
[0003] 根据是否可以穿透细胞膜，冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多为小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内，该类保护剂主要有二甲基亚砜，甘油，乙二醇等，其保护机制是在细胞悬液
凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中的
电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时细胞内水分不会过多
外渗，避免细胞过度脱水皱缩，使用该类冷冻保护剂时，需要预冷一定时间，在细胞内外达到平衡以充分保护。非渗透性冷冻保护剂一般是大分子物质，不能渗透到细胞内，该类保护剂主要有聚乙烯吡咯烷
酮(PVP)，
蔗糖，聚乙二醇等，其保护机制是可以与同溶液中的水分子有限结合，降低溶液中自由水的含量，使得冰点降低，减少冰晶的形成。
[0004] 目前，间充质干细胞一般采用含10％DMSO的血清冻存液进行冻存。但是，该细胞冻存保护液中通常采用动物血清，会产生异种生物来源的外源污染，DMSO含量较高，细胞毒性大，这种细胞冻存保护液不能在临床上使用。而且，一般的细胞复苏过程，容易受热不均匀，发生二次结晶的现象，对细胞的损伤较大。
发明内容
[0005] 基于此，有必要针对上述问题，提供一种间充质干细胞冻存液，能有效减少细胞在冻存和复苏过程中受到的损伤，提高复苏后细胞活性。
[0006] 一种间充质干细胞冻存液，包括以下工作浓度的组分：
[0007]
[0008]
[0009] 所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。
[0010] 上述间充质干细胞冻存液，不含外源血清和
有机溶剂，避免外源蛋白污染，且不会对细胞产生毒害作用，羟基
磷灰石(HA)纳米颗粒能有效减少冰晶形成，防止
温度传导不均匀以及尖锐冰晶形成损伤细胞，在此
基础上，还联合使用了全反式维
甲酸和
抗坏血酸，能有效地保护细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失。
[0011] 间充质干细胞培养上清液中含有丰富的生长因子，有利于维持间充质干细胞的活性。
[0012] 在其中一个
实施例中，所述羟基磷灰石纳米颗粒的工作浓度为1.8～2.2g/100mL。该浓度的HA纳米颗粒的冻存液对细胞保护效果更佳。
[0013] 在其中一个实施例中，所述间充质干细胞冻存液的基底液为间充质干细胞选择性培养基。
[0014] 在其中一个实施例中，所述间充质干细胞选择性培养基为干细胞无血清培养基。优选地，可以选择友康公司的干细胞无血清培养基作为间充质干细胞选择性培养基。
[0015] 本发明一方面还包括一种间充质干细胞冻存方法，包括以下步骤：
[0016] 消化：将培养汇合度为75％～85％的间充质干细胞取出，清洗，消化，离心，保留沉淀，加入上述间充质干细胞冻存液，重悬得细胞悬液，细胞液浓度为4.5～5.5×106个/mL；
[0017] 冻存：使用程序降温仪将上述细胞悬液降温至-80℃，放置于液氮保存。
[0018] 以上方法采用本发明的间充质干细胞冻存液对细胞进行冻存，冻存细胞
密度合理，冻存降温时温度传导均匀，不易产生冰晶，有效减少对细胞的伤害，提高复苏后细胞的活性，而且，由于不含外源血清和有害物质，复苏后的细胞可以应用于临床。
[0019] 在其中一个实施例中，所述细胞液浓度为5×106个/mL。
[0020] 在其中一个实施例中，所述冻存步骤中，降温在程序降温仪中进行。使用程序降温，减少细胞冻存的时冰晶的伤害，促进
玻璃化的形成，减少细胞复苏后吸水胀破的
风险。
[0021] 本发明一方面还提供一种间充质干细胞的保存试剂盒，包括复苏液和上述间充质干细胞冻存液。采用该保存试剂盒的冻存液和复苏液能，有效保护细胞，维持细胞活性。
[0022] 在其中一个实施例中，所述复苏液包括以下工作浓度的组分：
[0023]
[0024] 所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。
[0025] 上述复苏液中含有高浓度的
葡萄糖，随着葡萄糖的消耗，细胞内渗透压回归到正常水平，有效防止细胞胀破。
[0026] 在其中一个实施例中，所述复苏液的基底液为无血清培养基。
[0027] 本发明一方面还提供一种间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
[0028] 解冻：取采用上述的间充质干细胞冻存液进行冻存的细胞，放置于37±0.5℃下解冻；
[0029] 离心：向解冻的细胞液中加入上述复苏液，离心，保留沉淀，加入复苏液重悬，接种，培养。
[0030] 上述复苏方法，首先采用了本发明的间充质干细胞冻存液进行冻存，然后采用了本发明的复苏液进行复苏，减少细胞吸水涨破的风险，保证细胞活性。
[0031] 在其中一个实施例中，所述离心步骤具体为：向解冻的细胞液中加入解冻后细胞液4～6倍体积的间充质干细胞选择性培养基，300g离心4～6min，保留沉淀，加入复苏液重悬，接种至培养瓶，放置于
培养箱中培养。
[0032] 与
现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0033] 本发明的间充质干细胞冻存液，不含外源血清和
有机溶剂，避免外源蛋白污染，且不会对细胞产生毒害作用，羟基磷灰石纳米颗粒能有效减少冰晶形成，防止温度传导不均匀以及尖锐冰晶形成损伤细胞，在此基础上，还联合使用了全反式维甲酸和抗坏血酸，能有效地保护细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失。
[0034] 本发明的冻存方法，采用本发明的间充质干细胞冻存液对细胞进行冻存，冻存细胞密度合理，冻存降温时温度传导均匀，不易产生冰晶，有效减少对细胞的伤害，提高复苏后细胞的活性，而且，由于不含外源血清和有害物质，复苏后的细胞可以应用于临床。
[0035] 本发明的保存试剂盒，在细胞冻存和复苏过程中，能有效保护细胞，维持细胞活性。
[0036] 本发明的复苏方法，采用了本发明的间充质干细胞冻存液进行冻存，并采用本发明的复苏液进行复苏，减少细胞吸水涨破的风险，保证细胞活性。
附图说明
[0037] 图1为实施例2中间充质干细胞细胞复苏后细胞的生长情况图；
[0038] 图2为对比例1间充质干细胞细胞复苏后细胞的生长情况图；
[0039] 图3为实施例2所得细胞诱导分
化成脂肪情况图；
[0040] 图4为对比例1所得细胞诱导分化成脂肪情况图。
具体实施方式
[0041] 为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0042] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的
说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0043] 实施例1
[0044] 一种间充质干细胞冻存方法，包括以下步骤：
[0045] 消化：将培养汇合度为80％的间充质干细胞取出，用生理盐水清洗一次，加入适量0.25％胰酶消化，待细胞变圆后加入选择性培养基终止消化，300g离心5min，保留沉淀，加入间充质干细胞冻存液，重悬得细胞液，控制细胞浓度为5×106个/mL；其中，间充质干细胞冻存液以间充质干细胞选择性培养基为基底液，每100mL间充质干细胞冻存液中包括以下组分：30mL间充质干细胞培养上清液，5mL甘油，5g PVP，0.5g PVA，0.5g海藻糖，1g HA纳米颗粒，1mg全反式维甲酸，10mL血清替代物；该间充质干细胞培养上清液通过以下方法得到：
80％汇合度下的间充质干细胞培养24h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液；
[0046] 冻存：将上述细胞液放置于程序降温仪中程序降温，放置于-80℃过夜，然后放置液氮中长期保存。
[0047] 一种上述冻存细胞的复苏方法，包括以下步骤：
[0048] 解冻：取采用以上间充质干细胞冻存液进行冻存的细胞，加入复苏液，放置于37℃下迅速解冻；其中，复苏液以无血清培养基为基底液，每100mL复苏液中包括以下组分：0.3g葡萄糖，1mg全反式维甲酸，1mg抗坏血酸；
[0049] 离心：加入解冻后细胞液5倍体积的间充质干细胞选择性培养基，300g离心5min，保留沉淀，加入间充质干细胞选择性培养基重悬，接种至培养瓶中，放置于培养箱中培养。
[0050] 实施例2
[0051] 一种间充质干细胞冻存方法，与实施例1中的冻存方法区别在于，每100mL间充质干细胞冻存液中包括以下组分：30mL间充质干细胞培养上清液，5mL甘油，5g PVP，0.5g PVA，0.5g海藻糖，2g HA纳米颗粒，1mg全反式维甲酸，10mL血清替代物。
[0052] 该冻存细胞的复苏方法与实施例1中的复苏方法相同。
[0053] 实施例3
[0054] 一种间充质干细胞冻存方法，与实施例1中的冻存方法相同。
[0055] 该冻存细胞的复苏方法与实施例1中的复苏方法不同之处在于，每100mL复苏液中包括以下组分：0.3g葡萄糖，1mg全反式维甲酸，1mg抗坏血酸。
[0056] 实施例4
[0057] 一种间充质干细胞冻存方法，与实施例1中的冻存方法相同。
[0058] 上述冻存细胞的复苏方法与实施例1中的复苏方法不同之处在于，采用常规间充质干细胞复苏液，该常规间充质干细胞复苏液包括：10％人血清，DMEM-F12。
[0059] 对比例1
[0060] 一种间充质干细胞的冻存方法，与实施例1中的冻存方法不同之处在于，采用常规间充质干细胞冻存液对间充质干细胞进行冻存，该常规间充质干细胞冻存液包括以下浓度的组分：10％DMSO，10％人血清。
[0061] 上述冻存细胞的复苏方法与实施例1中的复苏方法不同之处在于，采用常规间充质干细胞复苏液，该常规间充质干细胞复苏液包括：10％人血清，DMEM-F12。
[0062] 实验例1
[0063] 对实施例和对比例中复苏后接种培养前的细胞进行计数，结果如表1所示：
[0064] 表1冻存和复苏后细胞数量
[0065] 冻存细胞数(个/mL) 复苏后活细胞数(个/mL)
实施例1 5×106 3.6×106
实施例2 5×106 4.8×106
实施例3 5×106 4×106
实施例4 5×106 3.2×106
对比例1 5×106 3×106
[0066] 从表1可以看出，采用本发明实施例的方法冻存和复苏的细胞数量相比于对比例更多，其中实施例1的数量相对偏少，实施例2的数量最多。
[0067] 实验例2
[0068] 采用实施例2和对比例1的方法复苏得到的细胞形态分别如图1和图2所示。图1中的细胞密度较多，细胞形态好；图2中的细胞密度相对较少。
[0069] 在相同条件下，对实施例2和对比例1复苏得到的细胞进行诱导分化成脂肪实验，诱导结果分别如图3和图4所示，深色为
染色后的脂肪滴。图3中的深色部分较多，表明实施例2所得细胞成脂分化活性高；图4中深色较少，表明细胞成脂分化活性较低。
[0070] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0071] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明
专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附
权利要求为准。
