1、技术领域
[0001] 本
发明属于农业领域中的品种评价技术，涉及一种大麦幼苗期耐盐鉴定方法。本发明适合用于大麦耐盐种质资源的筛选与评价以及耐盐QTL遗传解析、耐盐基因
定位和耐盐大麦品种的选育。2、背景技术
[0002] 随着人口的增长和城市化、工业化的推进，农业耕地资源变得越来越宝贵。大面积的沿海滩涂为我国农业发展提供了重要的耕地储备。随着化肥的大量使用，
土壤次生盐渍化也逐渐成为影响农业生产和作物产量提高的制约因素。开发滩涂发展农业，减轻土壤盐渍化危害的一项关键技术是培育耐盐品种。大麦是
耐盐性较强的作物，在我国有很大的种植面积。但不同的大麦品种耐盐性差异较大，发掘、鉴定大麦耐盐种质资源和筛选优良耐盐品系都需要对众多材料进行耐盐性鉴定比较。耐盐性鉴定是大麦耐盐遗传育种工作中一项基本技术。现有大麦耐盐鉴定方法多采用含盐土壤实地种植鉴定，虽然较为直观，但受其他环境因子的影响较大，耗费成本较高，试验周期较长。本方法利用实验室条件，创造相对均一的环境，鉴定材料的耐盐性差异。方法较为简单，试验周期短，适合大规模材料的鉴定筛选。
[0003] 目前，已知的大麦耐盐鉴定方法是将大麦幼苗移栽在含有一定盐分的土壤里，根据其不同反应进行分级定性评价。虽然能够区分不同材料耐盐性，但容易收到外界环境的影响，年度间、地点间变化较大，
稳定性较差。一般鉴定方法不能有效规避气温、光照、
风力、降
水，以及土壤盐分不均对鉴定结果的影响，容易产生错误的结论。3、发明内容
[0004] 技术问题
[0005] 为了克服现有鉴定方法不能有效规避外部环境影响的不足，本发明提供一种鉴定方法能在较短的时间（10天）测出被测材料的幼苗期的耐盐性，由于处理的整个过程都在光照
培养箱内进行，因此能有效排除外界环境对测试结果的影响，鉴定结果稳定可靠。 [0006] 技术方案：
[0007] 一种指示不同大麦品种资源幼苗期耐盐程度的鉴定方法，其特征是， [0008] 1）材料预处理
[0009]
种子干燥：将待测样品的种子置于种子干燥箱，干燥24小时，37℃±2℃，
通风； [0010] 种子表面灭菌：每份样品选取无病无损健康籽粒200粒，首先用
质量百分比1%NaClO溶液浸泡10分钟，进行表面灭菌，然后用纯净水冲洗3次；
[0011] 种子催芽：将种子平铺于垫有2层
滤纸的培养皿中，使种子1/2浸没在水中，将装有种 子的培养皿置于培养箱催芽24小时，条件为25℃±2℃，黑暗；
[0012] 2）盐分胁迫处理
[0013] 种植材料：将空白对照：“1/2浓度Hoagland
营养液”和
盐胁迫处理：“盐胁迫溶液”分别注入15ml离心管，每管10ml，分别以“0”和“2”做好标记；将胚根露出10～20mm的大麦种子用软性聚
氨酯海绵轻轻裹住，放于盛有“1/2浓度Hoagland营养液”和“盐胁迫溶液”的离心管中，胚芽朝上，胚根朝下，种子中部与液面相齐。每份材料3次重复，胁迫处理、空白对照各20管。
[0014] 生长培养：将载有样品的离心管置于光照培养箱中培育，环境设置，白天：6:00～20:00，光照5000LX，
温度20℃；黑夜：20:00～次日6:00，黑暗，温度10℃；每天下午用
注射器重新置换相应培养液，并按次序调整试管架在培养箱中的
位置。
[0015] 3）调查评价
[0016] 性状调查：10天以后分别测定每份材料的苗高、根长和鲜重；
[0017] 苗高：茎基部至苗最长叶的叶尖的长度，单位cm，精确到小数点后1位； [0018] 根长：最长根的长度，单位cm，精确到小数点后1位；
[0019] 鲜重：样品整株称重，单位mg，保留整数位；
[0020] 耐盐性评价：利用公式计算各材料的综合盐害指数，确定其耐盐性。 [0021] 相对盐害率：
[0022] 盐害指数：
[0023] 公式中：RSji为i材料j性状的相对盐害率，Xji为在盐胁迫处理条件下i材料j性状的测定值的平均数， 为非胁迫条件下i材料j性状的测定值平均数，Yi为i材料的盐害指数；
[0024] 4）结果判定：Yi值越大，材料受到盐害的伤害越大，Yi值越小，品种的耐盐性越强。根据盐害指数，按照以下标准，划分耐盐等级。
[0025] 盐害指数0≤Yi≤20%时定为耐盐等级1级，高耐盐；
[0026] 盐害指数20%＜Yi≤40%时定为耐盐等级2级，耐盐；
[0027] 盐害指数40%＜Yi≤60%时定为耐盐等级3级，中耐盐；
[0028] 盐害指数60%＜Yi≤80%时定为耐盐等级4级，对盐敏感；
[0029] 盐害指数80%＜Yi≤100%时定为耐盐等级5级，对盐极敏感。
[0030] 有益效果
[0031] 本发明依据的原理：盐分胁迫对
植物的生长发育具有严重影响，对其光合作用、物质运输等生理过程产生不利影响，有害物质在植株体内大量结集，导致生长缓慢、
叶片卷曲，根系发育缓慢、停滞，甚至枯萎死亡。本发明所采用的技术方案是通过人工模拟盐分环境，测定待测样品在盐胁迫条件下相对于空白对照条件下，苗高、根长和整株鲜重所受到的影响，上述性状指标下降越严重说明其受到的盐害越重，其耐盐性越差。通过综合其在苗高、 根长和整株鲜重三个性状上的总体表现，计算盐害指数，最终确定品种的耐盐性。 [0032] 本发明的优点是，方法简单，易于掌握；结果可靠，整个耐盐鉴定过程都在可控条件下，受环境影响较小；设备要求较低，只需要一台普通光照培养箱；鉴定周期短，整个过程两星期完成。
附图说明
[0033] 图1为催芽后待处理的大麦幼芽。
[0034] 图2为将刚刚萌芽的大麦种子用软性聚氨酯海绵轻轻裹住，用
镊子轻轻夹住放于离心管中10ml刻度处。
[0035] 图3为不同盐分浓度处理对
幼苗生长的影响比较。
具体实施方式
[0036] 本方法主要包括“材料前处理”，“盐分胁迫处理”和“调查评价”三个步骤。具体方案如下。
[0037] 材料准备：15ml塑料离心管若干，根据实验规模确定数量；15ml试管架若干；中等强度聚氨酯
泡沫海绵（硬度35），用裁纸刀削成20mm×10mm×5mm小片若干；配制“1/2浓度Hoagland营养液”10L，“盐胁迫溶液”10L，盐胁迫溶液NaCl浓度为200mmol/L（1.15%），刘友良等（1刘宛，刘友良.大麦幼苗的NaCl胁迫和叶片耐C l-量.南京农业大学学报，1993，16(3):15-19；2龚明，刘友良，丁念诚等.大麦不同生育期的耐盐性差异.西北植物学报，1994，14(1):1-7；3赵檀方，段友臣，刘爱峰等.大麦品种(系)间耐盐性的比较研究.山东农业科学，1999，(6):19-21；4李磊，赵檀方，胡延吉等.大麦苗期耐盐性鉴定指标的研究.莱阳农学院学报，1998，15(4):253-257）研究表明，大麦盐害的
阈值相当于土壤含盐量为0.51%，当盐浓度为1.15%时，大麦将减产50%。故设定200mmol/L为胁迫浓度。盐胁迫溶液配制方法：取“Hoagland营养液”和“400mmol/LNaCl溶液”1∶1混合搅匀。 [0038] Hoagland营养液配方如下：
[0044] **微量元素5ml/L
[0045] pH=6.0（用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节）
[0046] *铁盐溶液：七水硫酸亚铁2.78g
[0047]
乙二胺四乙酸二钠（EDTA.Na）3.73g
[0048] 蒸馏水500ml
[0049] pH=5.5（用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节）
[0050] **微量元素液：碘化钾0.83mg/l
[0052] 硫酸锰22.3mg/L
[0053] 硫酸锌8.6mg/L
[0054] 钼酸钠0.25mg/L
[0056] 氯化钴0.025mg/L
[0057] 蒸馏水配制
[0058] 1、材料预处理
[0059] 供试材料均来自江苏省农业种质资源中期库（http://jagis.jaas.ac.cn/CL_crop.aspx），种质编号如下：
[0060] 表1试验品种资源名称及来源编号
[0061]
[0062] *“C2118”耐盐性较好，“苏啤3号”耐盐性一般[5乔海龙，陈和，陈健等.盐分胁迫对不同大麦品种萌发及生长的影响.江西农业学报，2008，20(4)：10-13；6申玉香，乔海龙，陈和等.几个大麦品种(系)的耐盐性评价.核农学报.2009，23(5)：752-757]。 [0063] *“扬饲麦1号”苗期耐盐性较强[7李国生，许如根，缪丽霞等.大麦发芽期的耐盐性研究.大麦科学，2004，(4)：28-30]。
[0064] 种子干燥：将待测样品置于种子干燥箱，干燥24小时（37℃±2℃，通风）； [0065] 种子表面灭菌：每份样品选取无病无损健康籽粒200粒，首先用1%NaClO溶液浸泡10分钟，进行表面灭菌，然后用纯净水冲洗3次。
[0066] 种子催芽：将种子平铺于垫有2层滤纸的培养皿（直径60mm）中，适量加纯净水，使种子1/2浸没在水中，将装有种子的培养皿置于培养箱（25℃±2℃，黑暗）催芽24小时。 [0067] 2、盐分胁迫处理
[0068] 种植材料：将“1/2浓度Hoagland营养液（空白对照）”和“盐胁迫溶液（盐胁迫处理）”分别注入15ml离心管，每管10ml，分别以“0”和“2”做好标记；将刚刚萌芽（胚根露出5～10mm）的大麦种子用软性聚氨酯海绵轻轻裹住，用镊子轻轻夹住放于盛有“1/2浓度Hoagland营养液”和“盐胁迫溶液”离心管中，种子中部齐10ml刻度处，用记号笔在管上注明材料编号“0-****-##”或“2-****-##”，“0”、“2”为不同处理编号，“****”为品种编号，“##”为株号；同一品种，盐水胁迫处理和空白对照在试管架上间隔排放。
[0069] 生长培养：将载有样品的离心管置于试管架上，放入光照培养箱。环境设置，白天：6:00～20:00，光照5000LX，温度20℃；黑夜：20:00～次日6:00，黑暗，温度10℃。每天下午用注射器重新置换相应培养液，并按次序调整试管架在培养箱中的位置。
[0070] 3、性状调查分析
[0071] 性状调查：10天以后分别测定每份材料的苗高、根长和鲜重。
[0072] 苗高：茎基部至苗最长叶的叶尖的长度，单位cm，精确到小数点后1位。 [0073] 根长：最长根的长度，单位cm，精确到小数点后1位。
[0074] 鲜重：样品整株称重，单位g，精确到小数点后2位。
[0075] 耐盐性评价：利用公式计算各材料的综合盐害指数，确定其耐盐性。 [0076] 相对盐害率：
[0077] 盐害指数：
[0078] 公式中：RSji为i材料j性状的相对盐害率，Xji为在盐胁迫处理条件下i材料j性状的测定值的平均数， 为非胁迫条件下i材料j性状的测定值平均数，Yi为i材料的盐害指数。Yi值越大，材料受到盐害的伤害越大，Yi值越小，品种的耐盐性越强。本技术发明旨在区分材料的苗期耐盐性。鉴定结果如下：
[0079] 表2盐害胁迫处理对不同品种幼苗生长的影响
[0080]
[0081]
[0082] 表3双因素方差分析
[0083]
[0084] 表3方差分析显示，在幼苗鲜重、苗长、根长3个性状上，“处理”间都存在极显著差异，表明NaCl胁迫处理对大麦幼苗生长存在明显抑制作用，“品种”间显著差异性表明，不同品种在上述性状上存在遗传差异，“品种×处理”互作显著性表明不同品种在耐盐性上存在差异。
[0085] 4、耐盐性评价：
[0086] 利用公式计算各材料的综合盐害指数，确定其耐盐性。
[0087] 相对盐害率：
[0088] 盐害指数：
[0089] 公式中：RSji为i材料j性状的相对盐害率，Xji为在盐胁迫处理条件下i材料j性状的测定值的平均数， 为非胁迫条件下i材料j性状的测定值平均数，Yi为i材料的盐害指数；
[0090] 评价结果判定：Yi值越大，材料受到盐害的伤害越大，Yi值越小，品种的耐盐性越强，根据盐害指数，按照以下标准，划分耐盐等级：
[0091] 盐害指数0≤Yi≤20%时定为耐盐等级1级，高耐盐；
[0092] 盐害指数20%＜Yi≤40%时定为耐盐等级2级，耐盐；
[0093] 盐害指数40%＜Yi≤60%时定为耐盐等级3级，中耐盐；
[0094] 盐害指数60%＜Yi≤80%时定为耐盐等级4级，对盐敏感；
[0095] 盐害指数80%＜Yi≤100%时定为耐盐等级5级，对盐极敏感。
[0096] 根据本鉴定方法进一步计算盐害指数，进行耐盐性评价。
[0097] 表4不同大麦品种耐盐性差异及评价
[0098]
[0099] 计算结果显示（表4），盐害指数范围在20.9～72.2之间，平均盐害指数43.9，根据盐害指数的大小可以区分品种的耐盐性，按盐害指数由小到大排序，耐盐性由强到弱依次为：野生皮大麦-3、扬饲麦1号、拜泉皮1号、盐选一号、C2118、临海老来红、宽颖大麦、九州二条9号、加拿大110、如东91-305、东阳三月黄、美97-1338、九州二条、宽颖裸麦、苏啤3号、龙中蓝、旱地兰。
[0100] 其中野生皮大麦-3、扬饲麦1号、拜泉皮1号、盐选一号、C2118、临海老来红6个品种鉴定为耐盐等级2级，较为耐盐，也是我们多年鉴定耐盐种质；苏啤3号等10个品种鉴定为耐盐等级3级，耐盐性一般；旱地兰鉴定为耐盐等级4级，对盐害敏感。
