蛭石和珍珠岩作为根瘤菌与刺槐共生培养基质的应用
阅读：69发布：2024-02-20
专利汇可以提供蛭石和珍珠岩作为根瘤菌与刺槐共生培养基质的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了蛭石和珍珠岩作为根瘤菌与刺槐共生培养基质的应用，采用基质袋栽培技术，将蛭石与珍珠岩以2：1比例混合的基质装入透明塑料袋中，浇灌无氮 营养液 灭菌，然后在袋中种植刺槐苗，接种根瘤菌， 温室 培养。与传统 水 培方法相比，该方法能使根瘤菌在第8天与刺槐形成根瘤组织，其根瘤数量和 植物 地上部分 生物 量明显高于 水培 。本发明提供的方法克服了传统上采用水培的方法具有透气性差、污染率高、共生体系建立时间长、根瘤形成数量少、豆科植物生物量小等缺点，可用于豆科植物与根瘤菌共生固氮体系的快速建立、植物与 微生物 互作研究、濒危豆科 植物保护 和健壮种苗的培育。，下面是蛭石和珍珠岩作为根瘤菌与刺槐共生培养基质的应用专利的具体信息内容。
1.蛭石和珍珠岩作为根瘤菌与刺槐共生培养基质的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括将蛭石和珍珠岩混合后作为基质，采用基质袋培养技术进行根瘤菌与刺槐的共生培养。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的蛭石的颗粒粒径为1.0～3.0mm；所述的珍珠岩的颗粒粒径为1.5～2.5mm，按质量比，蛭石：珍珠岩＝2:1。
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4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的根瘤菌的接种量为10 ～10 CFU/mL。
5.如权利要求2、3或4所述的应用，其特征在于，所述的根瘤菌与刺槐的共生培养包括根瘤菌的活化、刺槐的催芽处理及将活化的根瘤菌接种在催芽处理后的刺槐根部，将接种根瘤菌的刺槐在蛭石与珍珠岩的混合基质中进行共生培养。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，待刺槐具有第一片真叶时向刺槐的根基处接种根瘤菌。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述的蛭石与珍珠岩的混合基质灭菌后再进行根瘤菌与刺槐共生的培养；
所述的灭菌包括向基质袋中倒入蛭石与珍珠岩的混合基质，然后再向装有混合基质的基质袋中倒入无氮营养液，最后将装有混合基质和无氮营养液的基质袋121℃灭菌60min。
蛭石和珍珠岩作为根瘤菌与刺槐共生培养基质的应用
技术领域
背景技术
[0002] 根瘤菌是一类重要的农业微生物，它们能与豆科植物共生形成根瘤，将大气氮还原为氨，为宿主植物提供所需的氮素营养，这种共生体系是已知生物固氮能力最强的共生体系之一，其每年的固氮量占全球生物固氮总量的50％以上，相当于全世界工业合成氮肥量的2倍，是全球氮素循环的主要环节。豆科植物作为一种重要的绿肥或生态保护植物，如毛苕子、草木犀、紫穗槐、刺槐等，在恢复土壤生态、水土保持、提高土壤生产力等方面发挥着重要的作用；作为经济作物，如大豆，它可为人类提供大量的植物蛋白和食用油，同样，很多豆科植物也是我国重要的中草药，如黄芪、甘草、苦参等。因此，研究根瘤菌与豆科植物匹配、建立高效共生固氮体系、提高氮素转化效率、改善土壤质量具有重要的指导意义，是农田土壤生态环境可持续发展的迫切需求。
[0003] 全世界豆科植物约650属，18000种，资源丰富，据报道可与豆科植物形成共生体系的根瘤菌具有同样多的种类，如何从种类繁多的豆科植物和根瘤菌中快速筛选和匹配高效共生固氮体系是我们面临巨大的挑战。传统的方法是通过试管水培方法建立共生体系，它克服了土培的连作障碍，对于观察豆科植物根部结瘤与否及结瘤数量、大小及形态不需要像基质培养那样取出植物。但在栽培过程中存在不少缺陷，主要表现营养液的浓度、温度、pH值等易产生剧烈变化，透气性差，溶解氧低，根系环境稳定性差。另外，对于体积、重量较大的种子，如黄豆、蚕豆等，滤纸对于种子的支撑有时会有一定困难，并且容易受到外界微生物的污染，影响共生体系的形成。
发明内容
[0004] 针对现有技术中的缺陷和不足，本发明发现了蛭石与珍珠岩能提高根瘤菌和刺槐的共生效率，与传统的水培方法相比，不仅生成根瘤的时间短，而且根瘤数量明显增多。该基质培养有效克服了水培过程中存在的缺点，促进植物生长，有利于快速建立共生体系。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 蛭石和珍珠岩作为根瘤菌与刺槐共生培养基质的应用。
[0007] 具体的，包括将蛭石和珍珠岩混合后作为基质，采用基质袋培养技术进行根瘤菌与刺槐的共生培养。
[0008] 更具体的，所述的蛭石的颗粒粒径为1.0～3.0mm；所述的珍珠岩的颗粒粒径为1.5～2.5mm，按质量比，蛭石：珍珠岩＝2:1。
[0009] 另外，所述的根瘤菌与刺槐的共生培养包括根瘤菌的活化、刺槐的催芽处理及将活化的根瘤菌接种在催芽处理后的刺槐根部，将接种根瘤菌的刺槐在蛭石与珍珠岩的混合基质中进行共生培养。
[0010] 同时，将根瘤菌接种在刺槐根部后的有效菌数为106～107CFU/mL。
[0011] 进一步的，待刺槐具有第一片真叶时向刺槐的根基处接种根瘤菌。
[0012] 更进一步的，将所述的蛭石与珍珠岩的混合基质灭菌后再进行根瘤菌与刺槐共生的培养；
[0013] 所述的灭菌包括向基质袋中倒入蛭石与珍珠岩的混合基质，然后再向装有混合基质的基质袋中倒入无氮营养液，最后将装有混合基质和无氮营养液的基质袋121℃灭菌60min。
[0014] 与现有技术相比，本发明的优点为：
[0015] (1)本发明通过对比实验发现，采用蛭石与珍珠岩一起作为混合基质进行刺槐与根瘤菌的共生培养，与传统的水培方法相比，不仅生成根瘤的时间短，而且得到的根瘤数量明显增多；
[0016] (2)本发明采用基质袋培养技术进行刺槐与根瘤菌的共生培养，大大的缩短了培养周期，解决了水培技术中存在的营养液的浓度、温度、pH值等生长环境参数易产生剧烈变化，透气性差，溶解氧低，根系环境稳定性差等问题，同时，对于体积、重量较大的种子，如黄豆、蚕豆等，解决了滤纸对于种子的支撑困难、容易受到外界微生物的污染及影响共生体系形成的问题；
[0017] (3)本发明采用的蛭石和珍珠岩在121℃灭菌条件下不会发生性状改变，有效的改善了植物的生长环境，防止外界微生物的污染，提高了刺槐-根瘤菌共生固氮能力，为科研和实践生产提供了新的途径和技术。附图说明
[0018] 图1基质袋栽培与传统试管水培方法中的根瘤数量，其中黑体正方形代表的是基质袋方法，实心圆圈代表的是试管水培方法；
[0019] 图2基质袋栽培与传统试管水培方法中的植物地上部分干重；
具体实施方式
[0021] 本发明采用的蛭石为颗粒状，其颗粒大小为1.0～3.0mm；本发明采用的珍珠岩为颗粒状，其颗粒大小为1.5～2.5mm。
[0022] 本发明采用如下方法实现:
[0023] (1)冻存根瘤菌的活化：应用YMA平板培养基。
[0024] (2)刺槐的催芽处理：取刺槐种子95％浓硫酸浸泡，期间慢速搅拌，8-10分钟后小心去掉硫酸并用大量无菌水快速冲洗，再加入95％乙醇浸泡1-2分钟后，蒸馏水冲洗6次。同时，配制1％水琼脂培养基，将种子均匀放入冷凝后的水琼脂培养基上。然后将培养皿放入30摄氏度培养箱中催芽约2天。
[0025] (3)育苗容器及基质制备：在基质培养中，蛭石与珍珠岩以2：1(质量比)混合装基质袋。配制6L左右无氮营养液，每袋基质袋中倒入约300ml，然后向事先准备洗净的大试管中分别倒入约60ml无氮营养液。
[0026] (4)实验处理如表1，共4个处理。将长度约为1cm发芽的刺槐苗，在无菌的条件下定植于基质袋和大试管中，待第一片真叶长出时，向植物根基处接10ml菌，接菌后有效6 7
菌数为(10～10 )CFU/mL。接菌后，每4天检测空白对照中细菌和所有处理真菌变化情况，整个栽培周期为36天。
菌数为(10～10 )CFU/mL。接菌后，每4天检测空白对照中细菌和所有处理真菌变化情况，整个栽培周期为36天。
[0027] 表1六种培育组的制备数量
[0028]
[0029] 注：其中植物组是在基质袋中植入催芽后的刺槐，植物加菌组是在基质袋中植入催芽后的刺槐并向其根部加1ml根瘤菌液
[0030] (5)检测内容：植物结瘤最早时间，根瘤数量；植物地上部分干重测定；采用梯度稀释平板技术法检测不同共生培养技术细菌和真菌变化。
[0031] 根据本发明处理数据可得出结论，基质袋培养技术中的刺槐地上干重明显高于水培技术，结瘤早于水培，接菌第8天就观察到根瘤形成，水培技术中第12天出现少量根瘤，在基质培养过程中，基质培养结瘤数多。基质培杂菌污染率较小，水培在培养到第24天时开始出现霉菌，在第36天时，几乎所有水培都出现了霉菌，而基质培养在细菌检测中始终没有霉菌出现。
[0032] 综合分析，基质袋培养的共生体系形成快，结瘤效率远高于水培，基质培养中，植物杂菌污染率较小，培养过程中没有霉菌出现，而水培则在培养到第24天时就出现了霉菌，基质中的植物干重统计结果总体高于水培，故基质培可作为实验室替代水培的一种新型的培养方式。
[0033] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
[0034] 实施例一：
[0035] 1材料：
[0037] 1.2基质袋及试管：聚乙烯袋，大小规格24cm×12cm，容积约为1500cm3。试管口直径约5cm，高约20cm。
[0038] 1.3供试豆科植物：刺槐(Robinia pseudoacacia)，种子购于杨凌。
[0039] 1.4供试菌株：Mesorhizobium amorphae CCNWGS0186。
[0040] 1.5所用培养基配方如下：
[0042] 液体TY培养基：胰蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，CaCl2·2H2O 0.7g/L；
[0043] 固体TY培养基：胰蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，CaCl2·2H2O 0.7g/L，琼脂粉20g/L；
[0044] 水琼脂培养基：每100mL蒸馏水加入1g琼脂粉；
[0045] 无氮营养液：Na2HPO4·12H2O 0.15g/L，CaCl20.1g/L，KH2PO40.1g/L，MgSO4·7H2O0.12g/L，柠檬酸铁5mg/L，Gibsom微量元素液1mL/L；Gibson微量元素液：H3BO32.86g/L，MnSO4.4H2O 2.03g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，Na2MnO4·7H2O 0.08g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L；
[0047] 2方法：
[0048] 2.1根瘤菌的活化
[0049] 将-80℃冰箱中保藏的根瘤菌CCNWGS0186在YMA培养基上培养3天，然后转接至TY液体培养基中培养2天，在5000r/min，4℃条件下离心5min收集菌体。无菌水洗涤菌体，再次5000r/min，4℃下离心5min，重复3次后得到所需菌液，4℃下保存备用，当天即用。
[0050] 2.2育苗容器及填充物制备
[0051] 在基质培养技术中，蛭石与珍珠岩以质量2：1的比例混合装100袋基质袋，基质袋3
为有底聚乙烯袋，规格为24cm×12cm，容积约为1500cm，向每个基质袋中装入约180克混合基质。
为有底聚乙烯袋，规格为24cm×12cm，容积约为1500cm，向每个基质袋中装入约180克混合基质。
[0052] 在水培养技术中，取长25cm*直径3cm试管，向其中放入滤纸(14cm*10cm)贴住内壁。配制30L左右无氮营养液，向基质袋中倒入约300mL营养液，用绳子将基质袋扎紧，然后向大试管中分别倒入约60mL无氮营养液，并用线绳膜封口后和基质袋一起放入高压灭菌锅中121℃，60min灭菌。
[0053] 2.3刺槐的催芽处理
[0054] 取刺槐种子于95％浓硫酸中浸泡，期间慢速搅拌，8-10分钟后小心去掉硫酸并用大量无菌水快速冲洗至溶液pH与无菌水相等。
[0055] 配制1％水琼脂培养基，在容器中加热搅拌至琼脂粉完全溶解，溶液沸腾后倒入锥形瓶中封口，和培养皿一起于121℃高压灭菌锅中灭菌30分钟。超净工作台内将种子均匀放入水琼脂培养基上，28℃培养箱中催芽2天。待刺槐种子长约1cm，将刺槐苗植入基质袋和大试管中，在基质中每袋3棵。其中，水培方法中刺槐种子置于滤纸与试管壁之间，每管3棵，放置于温室内。
[0056] 2.4实验处理
[0057] 在植物长出第一片真叶时，向水培和基质中加入根瘤菌菌悬液，使得根瘤菌数量6
达到10CFU/ml。每4天，记录基质袋中豆科植物共生固氮体系即根瘤形成情况。
达到10CFU/ml。每4天，记录基质袋中豆科植物共生固氮体系即根瘤形成情况。
[0058] 2.5微生物污染检测
[0059] 采用梯度稀释平板技术法检测不同共生培养技术微生物污染情况，基质培依次稀4 6
释到1:10，水培依次稀释到1:10进行检测，具体方法为：
释到1:10，水培依次稀释到1:10进行检测，具体方法为：
[0060] (1)基质处理中细菌检测稀释步骤：在超净工作台内，小心打开培养袋，分别从各处理的根际和根围1g培养基质，其中没有种植植物的基质1g，加入到100mL无菌水水管中，6
混匀，然后用移液器吸取1.0mL稀释液到装有9.0mL无菌水管中，6至稀释度为1×10，取
100μL液体于培养皿(牛肉膏蛋白胨培养基和真菌PDA培养基)上，用灭过菌的刮铲涂板。
每个稀释度重复3个培养皿。于28℃培养箱中，倒置培养2-3天后，统计菌落数。水培处理
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直接取样稀释至1×10。
混匀，然后用移液器吸取1.0mL稀释液到装有9.0mL无菌水管中，6至稀释度为1×10，取
100μL液体于培养皿(牛肉膏蛋白胨培养基和真菌PDA培养基)上，用灭过菌的刮铲涂板。
每个稀释度重复3个培养皿。于28℃培养箱中，倒置培养2-3天后，统计菌落数。水培处理
6
直接取样稀释至1×10。
[0061] 2.6植物生长情况统计
[0062] 将水培组与基质组中的植物取出，记录株植物根部的根瘤数量，并将记录后刺槐105℃电热烘干箱中烘干，万分之一天平称量恒重，记录植物干重。
[0063] 3实验结果：
[0064] 实验结果见图1和图2，可知基质袋培养技术中的刺槐地上干重明显高于水培技术，结瘤早于水培，接菌第8天就观察到根瘤形成，水培技术中第12天出现少量根瘤，在基质培养过程中，基质培养结瘤数多；基质培杂菌污染率较小，水培在培养到第24天时开始出现霉菌，在第36天时，几乎所有水培都出现了霉菌，而基质培养在细菌检测中始终没有霉菌出现。
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