一种菌体制剂的制造和应用方法
专利汇可以提供一种菌体制剂的制造和应用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种菌体制剂制造和应用方法，属于 微 生物 学和 生物工程 ，目的在于提供一种生产工艺简单，耗能低、使用方便、防病增产效果好、应用范围广的菌体制剂的制造方法与用法。涉及的菌株为P751和BC752。菌株先通过分离与纯化制得菌种，再通过试管斜面培养，液体扩大培养和万瓶培养制得制剂产品，本方法可用于小规模生产或用于大规模工业生产，制剂可用来进行作物拌种、喷洒沾根、防治病虫害，促进生长，增加产量，也可用于 治疗 某些人体 皮肤 病。，下面是一种菌体制剂的制造和应用方法专利的具体信息内容。
1.一种菌体制剂的制造方法，首先通过分离和纯化制得菌种，然后接种进行试管斜面培养，液体扩大培养和万瓶培养制得成品，其特征包括：(1)、所用的菌株为P751和BC752；(2)、菌株采用松针组织分离法或病叶保湿降落法进行分离，然后采用滴悬液、培养基倒皿法进行纯化；(3)、菌种在试管斜面培养、液体扩大培养和万瓶培养的各个阶段，须各自加入按照一定配方制成的灭菌的培养基进行培养；(4)、制得的菌体制剂要加入保护剂。
2.按照权利要求1所述的制造方法，其特征在于菌体制剂所加入的保护剂可以是2%的甘油或7.5%无菌马血清的葡萄糖液;
3.按照权利要求1制成的菌体制剂的使用方法，其特征包括：（1）、按菌液与种子比例1∶10和每亩用量拌种;（2）、在作物发病前、苗期及初花期喷洒以防病虫;（3）、用菌剂浸沾苗根、接穗后进行栽植、扦插或嫁接;（4）、防治根部病害时，用稀释液灌根;（5）、对人体皮肤病，用稀释液浸洗或涂擦患部。
4.按照权利要求3所述的使用方法，其特征在于使用时的稀释倍数是按不同病虫种类、不同作物或林木，以及不同使用期来决定的。
本发明属于微生物学，具体而言，属于通过生物工程制备具有生物调节和防病、增产功效的微生物制剂的方法。
现代农业促进作物增产的主要措施是肥水管理、改良品种和施用农药防治病、虫、杂草，但这些措施实施和发挥的效能有限，同时，施用化肥不仅能耗高，且易破坏土壤理化性质，施用化学农药还会造成环境污染、破坏生态平衡。为此，近年来世界各国都在积极研究植物病虫害的生物防治和生物调节，企望通过生物工程达到促进作物增产的目标。四十年代苏联的固氮菌、磷肥菌，五十年代英、美及澳大利亚的拮抗菌，七十年代初澳大利亚的放射土壤杆菌，七十年代末到八十年代初美国加利福尼亚州的“增产菌”，都是植物-微生物生态工程范畴。中国农科院植保所何礼远的《细菌在植物病害生物防治上应用研究的进展》一文（见《生物防治通报》1985，1（1）28-31），就这方面作了概要介绍;北京农业大学植病生防室陈延熙等人研制的“增产菌”在作物和蔬菜上也取得了一定的增产效果（见《生物防治通报》1985，1（2）22-24）。上述这些菌都属于土壤根际细菌，存在着作用单一（或增产或防病）、使用效果不稳定或菌剂生产困难、难于推广应用等缺点。因此，各国科学家仍在不断探索新的菌株及制剂，以满足农业发展日益增长的需要。
本发明的目的在于提供一种生产工艺简单、耗能低、使用方便、增产效果好、应用范围广的菌体制剂的制造和应用方法。
本发明涉及的微生物菌株为Pseudomonas sp.P751（以下简称P751）和Bacll
us cereus BC752（以下简称BC752），均由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册的编号分别为CGMCC NO.9146及CGMCC NO.0147。
上述两株细菌根据B.E.布坎南等编的《伯杰细菌鉴定手册》（第八版P6、274、729），同属原核生物界（Klngdom Procargotae），与光无关的原核生物（“暗细菌”）门2（Bacferia）、细菌纲（Bacfermycefes）。P751菌株属革兰氏阴性好氧杆菌和球菌，假单胞菌科（Pseudomonadaceae），假单胞菌属（Pseudomonas），其特性界于勒氏假单胞菌（P.lemolgnel Delafleld），和睾丸酮假单胞菌（P.testosteroni Marcus）间，因缺试剂睾丸酮无法定种，可能是该属中的新菌株，或是亚种或生物型水平不同的新菌株。BC752属芽孢杆菌和球菌，芽孢杆菌科（Bacillaceae）、芽孢杆菌属（Bacillus），蜡状芽孢杆菌（Baclllus cereus Frankland），Bacillus cereus BC752株，它与种的模式菌株水平上差异小，但本质不同，可能是亚种或生物型水平不同的新菌株，P751和BC752两菌株均从贵州马尾松针叶分离，其菌学性质为：P751株：革兰氏阴性，杆状，大小0.5-0.6X1微米，无鞭毛，细胞内聚β-羟基丁酸颗粒;皿上划线培养，菌落园形、光滑、凸起、边沿整齐，半透明，乳白色（用马丁培养菌落呈桔黄色），大小1-1.5毫米，倒皿培养，菌落生在底层，多为椭圆形，也有圆形和不规则形;葡萄糖为氧化型产酸，氧化酶阳性，无精氨酸双水解酶，不利用精氨酸、甜菜碱、葡萄糖、果糖和阿拉伯糖，能利用羟基苯甲酸盐、石蕊牛奶产碱;好氧，适宜生长温度9-40℃，最适宜温度26℃左右，PH7-10。
BC752株：革兰氏阳性，杆形，大小1.4X2.8-3微米，芽孢中生，孢囊不明显膨大，细胞内有聚-β-羟基丁酸盐颗粒;皿上菌落圆扁形，白色，中心色浓，稍凸起，边沿稍透明，不很整齐，有念珠状“缘毛”;V.P和M.R试验阳性，氧化酶和接触酶阳性，利用丙二酸盐，石蕊牛奶胨化还原;兼性厌氧，适宜生长温度15-45℃，最适宜温度26℃左右，PH6-10。
本发明的菌体制剂的制造方法是：从松针上分离得到的原始群体，经纯化、生物测定筛选出P751和BC752纯菌种，将其移置试管斜面培养基上培养出一级种子，之后进行液体扩大培养，以活化菌种、扩大菌量，最后进行万瓶培养而制成制剂成品。
P751和BC752在自然界多以水珠状胶液形态存在于马尾松的针叶上，其原始群体通常采用针叶组织分离法获得，即先制备肉膏胨琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，将有水珠状胶液特征的针叶剪成小段，经稍加消毒，清洗后移入斜面恒温培养，转管后得到目的菌苔;也可采用病叶保湿降落法分离，即将有病菌子实体的松赤落叶病叶铺于盛少量清水培养皿内的玻片上，盖皿盖，置于恒温箱中保湿培养若干天，揭去病叶，滴无菌水于玻片上，用消毒接种铒稍加搅和，制成菌悬液，沾液在培养基斜面上划线培养，以获得原始群体用上述分离方法中的一种制得的野生群体，并用以下方法纯化，获得纯菌株，即将原始菌苔制成的菌悬液滴入已灭菌的培养皿内，再倾入温热的培养基，均匀混合，然后恒温培养。待出现BC752菌落时，立即挑取单个菌落在另一斜面上划线，即可得BC752纯菌株;而P751株则需48小时后才会在培养基下层形成透明的云雾块，或呈微少、散生并在灯光下呈浅兰色的单个菌落，切取或挑取云雾块或小菌落连同培养基移至斜面培养基上，用接种针将其稍加捣碎并划线，再经28小时培养得到P751菌苔，如此反复，多次划线培养可得近于无色透明的纯菌苔。由于P751菌株能在培养基下层生长并表现出独特的特征，因此必须采用培养基倒皿法才能获得纯菌株。
通过分离和纯化的菌种经试管斜面培养，液体扩大培养和万瓶培养时，均需不同的培养基，制得菌体制剂后，要加入保护剂。
试管斜面培养的目的在于将纯化的菌种制成一级菌种，其培养基同针叶组织分离法所用培养基。液体扩大培养的目的在于活化菌种，扩大菌量，其培养基按P751和BC752两类，可采用牛肉膏（汁）、蛋白胨、酵母浸膏等，添加醋酸钠、磷酸一铵、KCl、NaCl、硫酸镁、硫酸亚铁、葡萄糖等不同配方，培养基煮好后用稀碱液调至PH7-7.5，然后灭菌、接种、培养即成。万瓶培养的目的在于制成菌剂产品，其培养基也可用液体扩大培养的培养基，方法是将培养液用高锰酸钾消毒后分装万瓶中，蒸煮一小时灭菌，然后接种，摇匀，置26-28℃下静止培养，24-28小时后即制得菌体制剂。
工业生产上采用反应器，将制备的培养基加入至反应器的60%，用116℃蒸汽消毒40分钟，待培养液冷至28℃时，将万瓶种子液加入，然后通入空气，在26-28℃、PH7-7.5条件下培养，P751株采用大气量培养28小时，BC752株用小气量培养24小时。
培养结束后，加入保护剂混合，所用保护剂可用2%的甘油或7.5%无菌马血清的葡萄糖液。
用上述方法生产的菌体制剂可用于农作物，经济作物、蔬菜、林木、果树、牧草、花卉等植物的病虫害防治、促生增产;P751菌株还可用作猪的饲料添加剂，有促壮催肥作用，也可用于某些人体皮肤病。施用时对人畜无毒害。
其用法是：（1）拌种：每亩用菌剂40-60毫升，加适量水均匀喷洒在种子表面，边喷边翻动，使菌剂均匀浸沾在种子表面，稍晾干，播种;或把菌液按种子量1∶10比例均匀拌到种子上，稍晾干，播种;（2）喷雾：每亩用量为40-60毫升原菌液，一般在作物发病前、苗期或初花期喷洒1-2次;林木病虫防治，用原液或10-100倍稀液在病虫害发生前喷洒1次。（3）浸沾根苗：每亩取40-60毫升菌液，用每亩浸沾根苗所需的水量稀释，将苗根浸沾，稍晾后栽植、扦插、苗木嫁接用液或10%液浸沾接穗嫁接。作物根部有病害时，可用稀释液灌根;（4）擦洗患处：对人体皮肤病，用稀释液浸洗或用原液涂擦患部。
本发明制成的菌体制剂具有以下理化性质：该制剂系用两株细菌加培养基生产的，含有一定数量活菌体的液体菌剂（也可制成粉剂、可湿性粉剂等剂型）。P751液剂呈清澈的淡褐色，表面有一层菌膜;BC752液剂呈略浑的淡褐色，静止存放多时有白色沉淀物（即絮状菌块）。两种制剂均不宜在阳光、尤其是紫外光下存放，宜在阴凉处存放，温度不得超过40℃，最好在常温下保存，可存放0.5-1年。该制剂一般无味，但被杂菌污染即有难闻的臭味。不能和青霉素、链霉素等抗菌素混用或混存，但P751菌剂可与多菌灵、波尔多液、甲（乙）基托布津、敌克松、速灭杀丁、敌杀死等化学杀菌剂、杀虫剂混用，可增效，而BC752制剂除不可与波尔多液、敌克松杀菌剂混用外，与上述其它杀菌杀虫剂可混用，以增加防病灭虫效果。制剂PH为7-9。
本发明的方法可以生产一种兼具防病治虫、促进植物生长、使作物增产的细菌菌体制剂。该菌株可由叶部分离筛选，不从根围筛选，生产比较容易;使用方法简便，应用范围广泛。
实施例：选取有水珠状胶液特征的针叶，剪成1cm左右段，放在洗净的培养皿内备用。再按下列配方制取肉膏胨琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15-20g，水1000ml。方法是加热溶解上述成份，用1N NaOH调PH值为7.4-7.8，装管加棉花塞，用1Kg/cm2蒸汽灭菌20-30分钟将灭菌试管液斜放，冷却成斜面培养基。接着将前述放有小段针叶的培养皿内倾少量75%乙醇，使针叶淹没，消毒10秒钟后立即将酒精倾去，勿再用升汞水消毒。之后，将无菌水分别盛于3个已消毒过的皿盖内，迅速将消毒过的针叶段移至无菌水中冲洗，连续3次后，将针叶段用接种针挑起，不带水地迅速移至斜面试管中，置于28℃恒温箱中培养24-28小时，针叶段周围长出细菌菌苔，及时挑取菌苔转管并纯化。纯化方法是：取5ml无菌水，挑取原始菌苔制成细菌悬浮液，在无菌条件下，将悬液滴入消毒培养皿内。把熔化的培养基冷至不炀手，倾入有菌悬液的皿内，均匀混合，冷凝后置26-28℃下培养24小时，即见到生长在培养基表面的BC752菌落，立即将单个菌落挑取在另一斜面上划线可得BC752纯菌种;P751则需培养48小时后，培养基下层方生长呈稍透明的云雾块，或微小散生在灯光下呈浅兰色的椭圆形单个菌落，选择其上无其它菌落处切取含该云雾块或单个菌落的培养基移至斜面培养基上，用接种针将其稍加捣碎并划线，再培养28小时后即现透明有光泽的P751菌苔，如菌苔呈白色，光泽差，即为不纯，需再次纯化，才能得到P751纯菌种。用经纯化的菌种转至一定数量的斜面培养基上，得到一级扩大的菌种，然后进行液体扩大培养。液体扩大培养基因菌株不同而异，P751株培养基配方为牛肉膏3g，蛋白胨5g，水1000ml;BC752株培养基配方为牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl8g，水1000ml。将培养基按配方分别煮好后，用5% NaOH调节至PH7-7.5，分装在1000ml玻璃三角瓶中，其量为170-250ml，加棉花塞置高压消毒锅中以1Kg/cm2蒸汽灭菌30分钟备用。在培养好的斜面纯菌种管中加入3-5ml无菌水，用接种环把菌苔轻轻刮下，摇匀后接入上述三角瓶内，每1000ml培养液接一支菌悬液，然后在26-28℃下静止培养24-28小时或振荡培养8-12小时，则得出二级种子液，可用于万瓶培养。万瓶培养采用培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨、松针煮液1000ml，在制成的培养液中加入0.1% K2MnO4消毒，分装万瓶中，每瓶装5000ml，蒸煮1小时灭菌，然后将二级种子液接入万瓶中，每万瓶接二级种液250ml，摇匀后置26-28℃下静止培养，P751株培养28小时，BC752株培养24小时，可得到菌体制剂。用稀释法抽样检查纯度与活菌数，如合格，可加入2%甘油作保护剂。该菌剂即可稀释供大田使用。
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